基于生物效價檢測和高效液相色譜法的中藥莪術(shù)及其炮制品品質(zhì)評價的研究

王建權(quán)，徐建中，俞旭平，孫乙銘

(浙江省慈溪市中醫(yī)醫(yī)院 中藥房，浙江 慈溪 315300)

基于生物效價檢測和高效液相色譜法的中藥莪術(shù)及其炮制品品質(zhì)評價的研究

王建權(quán)Δ，徐建中，俞旭平，孫乙銘

(浙江省慈溪市中醫(yī)醫(yī)院 中藥房，浙江 慈溪 315300)

目的 建立莪術(shù)的生物效價檢測指標來評價生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)的活血化瘀、消炎功效的差異，并建立高效液相色譜法測定莪術(shù)及其炮制品中有效成分姜黃素的含量。方法 生物效價測定法將莪術(shù)及其炮制品水提取液與牛血纖維蛋白原充分混勻，再加入凝血酶后觀察體外凝集反應(yīng)，并計算莪術(shù)活血化瘀效價，高效液相色譜法色譜柱為Waters Cl8(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.2%甲酸(47:53)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為420 nm。結(jié)果 生莪術(shù)抗纖維蛋白原的生物效價為2.07 U，醋煮莪術(shù)為2.58 U，醋炙莪術(shù)為1.72 U，而生莪術(shù)中主要功效成分姜黃素含量為0.03599 mg/g，醋炙莪術(shù)、醋煮莪術(shù)中姜黃素含量分別為0.03916 mg/g、0.04167 mg/g。結(jié)論 以拮抗牛血纖維蛋白原作為生物效價的評價，醋煮莪術(shù)的活血化瘀功效高于生莪術(shù)和醋炙莪術(shù)。

莪術(shù)；炮制品；活血化瘀；生物效價

莪術(shù)為姜科姜黃屬多年生植物蓬莪術(shù)、溫郁金或者廣西莪術(shù)的干燥根莖。其性辛、溫、苦，具有消積止痛、行氣破血的作用，可用于食積脹痛, 也可用于氣滯血瘀所致經(jīng)閉腹痛等癥狀[1]。根據(jù)《中國藥典2010年版》及相關(guān)文獻顯示[2]，莪術(shù)中主要含有揮發(fā)油和姜黃素2大類成分，一般采用性狀、薄層鑒別及揮發(fā)油測定，難以全面評價莪術(shù)及其炮制品的品質(zhì)，而建立適宜的活血化瘀生物活性檢測方法和高效液相色譜法用于莪術(shù)及其炮制品的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價，可以體現(xiàn)莪術(shù)功效特點，并補充了莪術(shù)現(xiàn)有的質(zhì)控模式的不足。生物效價法試驗以牛血纖維蛋白原(FIB)的變化為指標來考察莪術(shù)及其炮制品的活血化瘀功效，當牛血纖維蛋白原與凝血酶相互作用生成纖維蛋白，并形成凝膠，以此為指標來評價莪術(shù)及其炮制品體外拮抗凝血酶-牛纖維蛋白原凝膠的反應(yīng)效果，高效液相色譜法試驗測定了莪術(shù)及其炮制品中主要功效成分姜黃素的含量，結(jié)合以上兩種方法更接近于評價莪術(shù)及其炮制品活血化瘀功效，將生物活性測定法引入中藥質(zhì)量控制和評價體系，更能全面評價莪術(shù)及其炮制品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料 牛血纖維蛋白原測定試劑盒(FIB)(天津美德太平洋科技限公司，批號201424000)；凝血酶(中國食品藥品檢定研究院，批號S10117-200)；同一批次莪術(shù)3種炮制品(生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù))由浙江省慈溪市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供并炮制。

R-1001-VN 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DZF-202型真空干燥箱(南京泰康環(huán)?？萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 工作緩沖液的制備：pH7. 2 磷酸鹽緩沖液(取0.2 mol/L磷酸二氫鉀50 mL與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液35 mL，加新沸過的冷水稀釋至200 mL，搖勻，即得) 與生理鹽水1:20比例混合。

1.2.2 莪術(shù)炮制品的制備

生莪術(shù)：稱取莪術(shù)原藥材，浸泡6 h，洗凈，置蒸籠內(nèi)蒸至上氣，趁熱切成薄片，晾干，篩去灰屑。

醋煮莪術(shù)：稱取莪術(shù)原藥材置于制藥鍋中，加米醋，并加冷水將其浸沒，用文火加熱至醋汁吸盡，觀察莪術(shù)藥材內(nèi)無白心時，立即取出，稍微晾干，切厚片，干燥。莪術(shù)每10 kg , 用米醋2 kg。

醋炙莪術(shù)：稱取莪術(shù)原藥材均勻切片，加40%米醋拌勻，等米醋稍微浸潤，置于炒制鍋內(nèi)，用文火慢慢加熱，炒至顯微黃色，略帶焦斑時，取出，放至室溫即可。

1.2.3 莪術(shù)炮制品供試液的制備：分別稱取炮制規(guī)范、質(zhì)量穩(wěn)定的3種莪術(shù)炮制品飲片10 g，分別加入20倍量冷水浸泡4 h，煎煮2次，每次1 h，過120目篩去除藥渣?；旌?次水煎液，水煎液過濾后濃縮至100 mL。

1.2.4 空白梯度試驗：取牛血纖維蛋白原溶液(濃度為5 mg/mL)從加入量20 μL開始，每次試驗組加入量增加20 μL，且各組分別加入凝血酶(濃度為5 U/mL)20 μL，充分混勻，立即放入(37±1)℃水浴中，觀察成膠情況。試驗結(jié)果表明當牛血纖維蛋白原溶液加入量大于50 μL時，觀察到各組試驗結(jié)果均形成了一定量的膠塊，而當各試驗組加入量在50 μL以下時不易形成膠塊。因此試驗選擇牛血纖維蛋白原溶液(濃度為5 mg/mL)加入量從50 μL開始每次增加50 μL的劑量進行空白梯度試驗。

1.2.5 生物效價測定方法的建立：將生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)供試液分別用工作緩沖液進行稀釋，稀釋濃度相當于生藥量0.5、1、2、3、5、10、15、25、35、40、60、75 mg/L的供試品溶液。取干凈試管，分別加入不同濃度的供試液20 μL、牛血纖維蛋白原溶液(濃度為5 mg/mL)50 μL，振搖混勻后加入凝血酶溶液(濃度為5 U/mL)20 μL，立即放入(37±1)℃水浴中，10 min中后觀察成膠情況，若無凝膠出現(xiàn)，每次增加50 μL的牛血纖維蛋白原溶液，按上述方法平行測定3次。計算莪術(shù)及其炮制品抗凝效價按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅩⅣ生物檢定統(tǒng)計法項下“量反應(yīng)平行線法”( 3，3) 法[3-5]。

1.2.6 莪術(shù)生物效價計算方法：莪術(shù)活血化瘀效價(U)=CFIB×VFIB/C供試品×V供試品。

1.2.7 莪術(shù)及其炮制品中姜黃素的含量測定

① 色譜條件：Waters C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%甲酸(47:53)；檢測波長：420 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫35℃。

② 對照品溶液的制備：精密稱定姜黃素對照品，加甲醇制成每1 mL含45 μg的對照品溶液，微孔有機濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

③ 供試品溶液的制備： 分別稱取生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，密塞并稱取重量，超聲提取60 min，冷卻放至室溫，再稱定重量，用甲醇補充，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

④ 專屬性實驗：分別精密吸取對照品溶液，生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按①項下色譜條件進行測定。

⑤ 線性范圍考察：分別精密量取姜黃素對照品溶液(濃度為45 μg/mL)1、2、5、10 1、20 μL注入高效液相色譜儀，照上述色譜條件測定姜黃素的峰面積。以峰面積(A)為縱坐標，進樣量(C)為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。

⑥ 生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)姜黃素含量測定：分別精密吸取上述生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)供試品溶液2份各10 μL，按上述色譜條件進行測定，每個樣品平行測定2次，外標峰面積法計算。

1.2.8 驗證試驗

① 精密度試驗：按上述色譜條件，取同一份生莪術(shù)供試品溶液劑量梯度依照“1.2.4”、“1.2.5”項下方法分6次進行測定，完成后與莪術(shù)對照藥材溶液進行對比檢定；

② 重復(fù)性試驗：取同一批生莪術(shù)分6次進行提取，分別制成其供試品溶液，按上述方法操作，與莪術(shù)對照品溶液進行對比檢定；

③ 中間精密度試驗：為了考察實驗室2個不同實驗人員對測定結(jié)果的影響，按照上述方法進行；

1.2.9 莪術(shù)抗凝活性與主要功效成分之間的相關(guān)性分析：將莪術(shù)及其炮制品抗凝效價與對應(yīng)的主要化學(xué)成分姜黃素含量作圖，并按照1.2.7項下方法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 纖維蛋白原-凝血酶成膠結(jié)果 所有未成膠組在5 min之后加入高劑量的凝血酶溶液(濃度為5 U/mL)，經(jīng)(37±1)℃水浴10 min后，仍未觀察到繼續(xù)成膠，表明莪術(shù)對凝血酶的直接抑制作用不敏感。試驗結(jié)果證明，莪術(shù)有明顯的抑制纖維蛋白原活性的作用。見表1。

表1 生莪術(shù)與纖維蛋白原拮抗劑量關(guān)系考察

2.2 莪術(shù)抗凝活性的量效關(guān)系考察 莪術(shù)具有明顯的抑制血漿纖維蛋白原活性的作用，也就是有明顯的抗凝血作用。試驗對莪術(shù)對照藥材的抗凝作用量效關(guān)系進行了考察，結(jié)果表明，莪術(shù)對照藥材的對數(shù)計量(X)與FIB(Y，牛纖維蛋白原劑量)具有良好的線性關(guān)系。線性回歸方程：Y=1.335C+0.213(mg)，相關(guān)系數(shù)r=0.9920，線性范圍為0.08～1.5 mg， 線性關(guān)系良好。說明FIB法可以通過“量反應(yīng)平行線法”( 3，3)法對莪術(shù)生物效價進行檢定[4-5]。

2.3 幾種莪術(shù)炮制品活血化瘀功能生物效價比較 按照上述方法分別測定莪術(shù)炮制品醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)，醋炙莪術(shù)拮抗牛血纖維蛋白原劑量滿足Y=1.392X+0.104，r=0.9940，線性范圍為0.1～1.2 mg，平均效價為1.7U；醋煮莪術(shù)拮抗牛血纖維蛋白原劑量滿足Y=1.554X+0.202，r=0.9820，線性范圍0.06～0.7 mg，平均效價為2.58 U。醋炙莪術(shù)、醋煮莪術(shù)拮抗纖維蛋白原作用數(shù)據(jù)見表2、表3。

表2 醋炙莪術(shù)與纖維蛋白原拮抗劑量關(guān)系考察

表3 醋煮莪術(shù)與纖維蛋白原拮抗劑量關(guān)系考察

2.4 莪術(shù)及其炮制品中姜黃素的含量測定結(jié)果

2.4.1 專屬性實驗：結(jié)果表明：在本實驗色譜條件下，供試品溶液中其他成分與姜黃素分離良好。

圖1 姜黃素對照品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of curcumin reference substance solution

圖2 供試品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of test solution

2.4.2 線性范圍考察：線性回歸方程為A=2973.5C+6.5715(μg/mL)，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，線性范圍為0.045～55.0 μg/μL， 8次空白測定RSD為0.20%，檢出限為0.02 μg/μL。線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗：與莪術(shù)對照藥材溶液進行對比檢定，計算得到其平均效價分別為2.12 U，RSD分別為 5.8%。表明儀器的精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗：與莪術(shù)對照品溶液進行對比檢定，計算平均效價分別為1.97U，RSD分別為 4.2%。

2.4.5 中間精密度試驗：結(jié)果表明，生莪術(shù)平均效價分別為2.14 U，RSD分別為3.6%。說明不同實驗人員對測定結(jié)果影響較小，該方法穩(wěn)定性較好。

2.4.6 生莪術(shù)、醋煮莪術(shù)、醋炙莪術(shù)姜黃素含量測定結(jié)果：每個樣品平行測定2次，外標峰面積法計算。見表4。

表4 樣品分析結(jié)果

2.5 莪術(shù)抗凝活性與主要功效成分之間的相關(guān)性分析 將莪術(shù)及其炮制品抗凝效價與對應(yīng)的主要化學(xué)成分姜黃素含量作圖，見圖3，并按照1.2.7項下方法進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，莪術(shù)及其炮制品抗凝效價與姜黃素質(zhì)量分數(shù)之間未見顯著性相關(guān)。

圖3 姜黃素含量與抗凝效價相關(guān)性圖Fig.3 Correlation between content of curcumin and anticoagulant potency

3 討論

本試驗從莪術(shù)及其炮制品醋炙莪術(shù)與醋煮莪術(shù)活血化瘀藥理作用的相關(guān)文獻[6-7]得到啟發(fā)，對中藥莪術(shù)及其炮制品活血化瘀功效的檢測方法做了一定的探索，本實驗將生物效價法及高效液相色譜法進行對比[8-11]，建立莪術(shù)及其炮制品的評價體系，不僅可以測定其姜黃素含量，而且還可以評價莪術(shù)及其炮制品的活血化瘀藥效?！吨袊幍?015年版》提出了中藥的質(zhì)量控制標準要逐步由單一性指標成分向活性有效成分及生物活性測定的綜合性檢測指標過渡，因此中藥及中成藥生物活性測定法代表著質(zhì)量評價的一種發(fā)展趨勢。而活血化瘀類中藥及其炮制品一般會選擇幾種指標和藥理研究方向進行生物活性的考察。本課題組通過前期的試驗對凝血4項進行了篩查，最終選擇了拮抗FIB(牛血漿纖維蛋白原)的效應(yīng)[12-13]作為考察指標，并比較了莪術(shù)不同提取組分的活血化瘀活性，其中主要功效成分姜黃素的活血化瘀最好，并結(jié)合高效液相色譜法對莪術(shù)及其不同炮制品中姜黃素含量與活血化瘀活性相關(guān)性進行了考察，方法簡單、準確，并能構(gòu)建量效關(guān)系，對中藥莪術(shù)及其炮制品的質(zhì)量控制和臨床療效的關(guān)聯(lián)更具有實際意義。

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(編校：王冬梅)

Study on quality evaluation of curcuma and its processed products by biopotency determination method and HPLC method

WANG Jian-quanΔ, XU Jian-zhong, YU Xu-ping, SUN Yi-ming

(Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang Cixi Chinese Medicine Hospital, Cixi 315300, China)

ObjectiveTo establish a method for determining anticoagulation potency of Curcuma,Vinegar boiled Curcuma,Vinegar sunburned Curcuma on promoting blood circulation and removing blood stasis，and the establishment of a HPLC method for content determination of effective ingredients of zedoary turmeric curcumin and its processed products.MethodsBy the full mixture water extracts of these Curcuma and Processed Products and full mixing of fibrinogen, prothrimbin was added into the mixture to from the gel reaction in the nature state and the antagonism titer of Curcuma and Processed Products was calculated. HPLC column for waters C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) , the mobile phase is acetonitrile 0.2% formic acid (47:53). The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 420 nm.ResultsThe biological potency of antifibrin Curcuma for 2.07 U, Vinegar boiled Curcuma was 2.58U and Vinegar sunburned Curcuma was 1.72 U. And zedoary main efficacy components of the content of curcumin 0.03599 mg/g, vinegar Rhizoma Zedoariae and vinegar boiled the content of curcumin in Rhizoma Curcumae respectively 0.03916 mg/g and 0.04167 mg/g.ConclusionEvaluation of the antagonistic activity of fibrinogen as a biological activity, the Vinegar boiled Curcuma’s effection of activating blood circulation is higher than the Vinegar sunburned Curcuma and the Curcuma.

curcuma; processed products; blood stasis; bioavailability

王建權(quán)，通信作者，男，本科，主管中藥師，研究方向：中藥分析，E-mail：2189920600@qq.com。

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.58