黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織P53及Ki-67蛋白表達(dá)的影響

虞義建，甘梅富

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院 病理科，浙江 臺(tái)州 317000)

黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織P53及Ki-67蛋白表達(dá)的影響

虞義建Δ，甘梅富

(浙江省臺(tái)州醫(yī)院 病理科，浙江 臺(tái)州 317000)

目的 探討黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織中P53及 Ki-67蛋白表達(dá)的影響。方法 選取非小細(xì)胞肺癌患者67例，按治療方法不同分組，對(duì)照組28例口服吉非替尼，研究組39例在吉非替尼基礎(chǔ)上加用黃芪多糖注射液，免疫組化法測(cè)定治療前后組織Ki-67及P53蛋白水平，同時(shí)測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群變化。結(jié)果 研究組有效率、疾病控制率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究組治療后P53陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組， Ki-67陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)。研究組治療后CD3+T、CD4+T低于對(duì)照組，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于對(duì)照組(均P<0.05)。結(jié)論 采用黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織降低Ki-67及提高P53蛋白表達(dá)的效果顯著。

黃芪多糖注射液；吉非替尼；肺癌；Ki-67；P53

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，發(fā)病率居世界首位[1]，嚴(yán)重危害人類的健康。多數(shù)確診患者已屬中晚期,失去手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[2]。目前靶向藥物治療制劑吉非替尼為肺癌患者帶來(lái)了新的希望，然而部分患者毒副反應(yīng)較大，不能明顯延長(zhǎng)生存期。應(yīng)施予多學(xué)科綜合治療中晚期肺癌，以提高療效，延長(zhǎng)生存期及提高生存質(zhì)量。增殖核抗原Ki-67能準(zhǔn)確反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，并與多種腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[3]。P53基因參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的周期調(diào)控,其表達(dá)使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆凋亡,若缺失或突變與腫瘤的發(fā)生高度相關(guān)[4]。目前關(guān)于黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織中Ki-67及P53蛋白表達(dá)影響的相關(guān)研究較少，本次研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月～2015年7月來(lái)浙江省臺(tái)州醫(yī)院治療的肺癌患者67例，經(jīng)病理組織學(xué)確診，排除存在肝腎功能、心電圖異常，存在化療禁忌癥患者，按治療方法不同分組，對(duì)照組28例口服吉非替尼治療，男16例，女12例，年齡62～74歲，平均年齡(65.1±6.8)歲，TNM分期Ⅲ期19例，Ⅳ期9例；研究組39例在吉非替尼基礎(chǔ)上加用黃芪多糖注射液，男22例，女17例，年齡61～75歲，平均年齡(65.4±6.7)歲，TNM分期Ⅲ期25例，Ⅳ期14例，2組具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：對(duì)照組患者口服吉非替尼250 mg/d，28 d 1個(gè)周期。研究組在吉非替尼基礎(chǔ)上加用黃芪多糖注射液250 mg加入0.9%NaCl 500 mL中靜滴，1次/天，28 d 1個(gè)周期。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)：試劑：?jiǎn)慰寺】贵wKi67和P53及Envision TM+試劑盒(K40004)；水性封片膠購(gòu)自DAKO公司。

操作過程：肺癌組織和癌旁組織石蠟切片，經(jīng)10%緩沖甲醛內(nèi)固定，切片4 μm。二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡15 min，無(wú)水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中浸泡3 min，流水沖洗5 min。PBS液中震蕩儀震蕩5 min/次×3?？乖梦⒉ㄐ迯?fù)10 min后讓其自然冷卻至室溫，蒸餾水洗滌后再用PBS液震蕩儀震蕩5 min/次×3。滴加第一抗體(Ki-67、P53)，室溫下孵育15 min。PBS液震蕩儀震蕩5 min/次×3。滴加mouse En VisionTM，室溫下孵育30 min。PBS液震蕩儀震蕩5 min/次×3。滴加DAB顯色，37 ℃反應(yīng)30 min后觀察顯色。蘇木素復(fù)染，脫水、透明、樹脂膠封片，記錄顯色情況。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)：臨床療效：完全緩解(SD)為瘤體消失，持續(xù)時(shí)間大于1個(gè)月；部分緩解(PR)為瘤體2個(gè)月最大相互垂直直徑乘積縮小>50%，持續(xù)時(shí)間大于1個(gè)月；穩(wěn)定(SD)為瘤體2個(gè)月最大互相垂直直徑乘積縮小<50%；或增大<25%，持續(xù)時(shí)間大于1個(gè)月；惡化(PD)為瘤體2個(gè)最大互相垂直直徑乘積增大>25%。有效率=(完全緩解+部分緩解)/總例數(shù)×100%；疾病控制率=(完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定)/總例數(shù)×100%。

Ki-67及P53蛋白：采用免疫組化測(cè)定治療前后病理組織，計(jì)算Ki-67及P53蛋白陽(yáng)性細(xì)胞百分率。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性(-),10%～25%為弱陽(yáng)性(+),26%～50%為陽(yáng)性(++)、>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

免疫功能：治療前、后采用美國(guó)BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T、CD8+T、CD4+T、CD4+T/CD8+T)變化。

2 結(jié)果

2.1 2組患者治療后臨床效果分析 研究組有效率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(51.3%vs.46.4%，χ2=0.154，P=0.885)，研究組疾病控制率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(76.9%vs.64.3%，χ2=1.28，P=0.256)。見表1。

表1 2組患者治療后臨床效果分析[n(%)]

2.2 2組患者治療前后組織Ki-67及P53蛋白表達(dá)狀況 Ki67、P53蛋白以細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，其免疫組化結(jié)果見圖1。

圖1 Ki67、P53蛋白免疫組化結(jié)果(×100)Fig.1 Immunohistochemistry of Ki67 and P53 protein(×100)

研究組治療前P53陽(yáng)性率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(51.28%vs.50.00%，Z=0.419,P=0.675)；研究組治療后P53陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(79.49 %vs.57.14%，Z=2.331,P=0.020)。

研究組治療前Ki-67陽(yáng)性率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(71.79%vs.71.43%，Z=0.302,P=0.763)，研究組治療后Ki-67陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組(35.90%vs.60.71%，Z=2.193,P=0.028)。見表2、表3。

表2 2組患者治療前后組織P53蛋白表達(dá)比較

表3 2組患者治療前后組織Ki-67蛋白表達(dá)比較

2.3 2組患者治療前后2組T細(xì)胞亞群變化 與治療前比，研究組治療后CD3+T、CD4+T下降，CD8+T、CD4+T/CD8+T升高(P<0.05)，研究組治療后CD3+T、CD4+T低于對(duì)照組，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

組別 例數(shù)時(shí)間點(diǎn)CD3+(%)CD8+(%)CD4+(%)CD4+/CD8+對(duì)照組28治療前61 20±6 8243 75±5 2933 97±5 650 86±0 29治療后62 37±6 4441 47±4 3834 54±4 980 89±0 32研究組39治療前60 94±7 0144 54±5 7334 18±5 470 85±0 31治療后72 91±7 83?#35 82±4 41?#41 86±4 81?#1 21±0 27?#

*P<0.05，與同組治療前比較，compared with the same group pre-treatment；#P<0.05，與對(duì)照組治療后比較，compared with control group post-treatment

3 討論

肺癌是發(fā)病率、死亡率均很高的一種惡性腫瘤，對(duì)人類威脅日益嚴(yán)重，我國(guó)肺癌的發(fā)病率有明顯增高趨勢(shì)。多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，盡管近年來(lái)化療和放療技術(shù)有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但患者長(zhǎng)期生存率并未得到明顯提高。因此，迫切需要探討新的有效治療措施。目前一些小分子的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑已應(yīng)用于晚期NSCLC治療并取得了巨大的進(jìn)展[5]。吉非替尼是具有代表性的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)有抑制作用[6],從而達(dá)到抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、加速細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)化、放療效果的作用。研究表明吉非替尼能夠快速改善漿膜腔積液非小細(xì)胞肺癌患者的臨床癥狀，顯著提高患者的生活質(zhì)量改善幅度[7]。黃芪多糖可以可以提高患者機(jī)體的免疫水平[8]，往往可以起到抗腫瘤并提高免疫力的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Ki-67和P53蛋白在肺癌和肺部良性病變的患者中差異較大,有助于臨床對(duì)患者進(jìn)行早期診斷。目前關(guān)于黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織中Ki-67及P53蛋白表達(dá)影響較少，本次研究探討黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織中Ki-67及P53蛋白表達(dá)影響。

研究表明化療在滅殺腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定程度的損傷[9]。黃芪主要含有多糖、皂苷、氨基酸、生物堿等成分，具有補(bǔ)益中氣、扶正固本的療效。研究顯示黃芪多糖可在體外誘導(dǎo)DC成熟,并促進(jìn)其抗原遞呈能力,有效活化CTL,增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤功能[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)研究組治療后CD3+T、CD4+T低于對(duì)照組，CD8+T、CD4+T/CD8+T高于對(duì)照組(P<0.05)，說明中藥能夠作用于全身免疫系統(tǒng)，即促進(jìn)免疫細(xì)胞的生成及細(xì)胞因子的分泌，提高細(xì)胞抗腫瘤的免疫功能。

Ki67是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物,代表細(xì)胞增殖水平，且能可靠而迅速地反映惡性腫瘤增殖率的指標(biāo),其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記。P53是人類惡性腫瘤中最常見的突變基因,與人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)性最高[11]。P53基因,可與多種分子協(xié)同促進(jìn)肺癌惡性進(jìn)展[12]。本次研究發(fā)現(xiàn)研究組治療后P53陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，研究組治療后Ki-67陽(yáng)性率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。說明黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織降低Ki-67表達(dá)，提高P53蛋白表達(dá)，間接說明二者合用對(duì)肺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)歸有重要的影響。

本次研究發(fā)現(xiàn)采用黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌患者組織降低Ki-67表達(dá)，提高P53蛋白表達(dá)，效果顯著。本次由于人數(shù)及時(shí)間限制，對(duì)于黃芪多糖注射液聯(lián)合吉非替尼通過何種機(jī)制對(duì)組織中Ki-67及P53蛋白表達(dá)起到靶向作用尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib on tissue P53 and Ki-67 expressions in patients with lung cancer

YU Yi-jianΔ, GAN Mei-fu

(Department of Pathology, Taizhou Hospital of Zhejiang, Taizhou 317000, China)

ObjectiveTo explore the effect of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib on tissue P53 and Ki-67 expressions in patients with lung cancer.Methods67 cases of non-small cell lung cancer were selected and divided into two groups according to different therapy, control group of 28 cases

gefitinib orally, and study group of 39 cases received astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib. The expressions of tissue P53 and Ki-67 were detected immunohistochemical method pre-and post-treatment and the T T lymphocyte subsets were detected at the same time. ResultsThere were no significant difference in rates of effectiveness and disease control between study group and control group. Compared with control group, the positive rate of P53 was higher and the positive rate of Ki-67 was lower post-treatment in study group (allP<0.05). Compared with control group, the CD3+T and CD4+T were lower, the CD8+T,CD4+T /CD8+T were higher post-treatment in study group (allP<0.05).ConclusionThe treatment of astragalus polysaccharide injection combined with gefitinib could significantly reduce tissue Ki-67 and increase tissue P53 expressions in patients with lung cancer.

astragalus polysaccharide injection; gefitinib; lung cancer; Ki-67; P53

虞義建，通信作者，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理，E-mail：poyisb@163.com。

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.47