Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達與臨床意義

王一，郭琳，劉乙蒙，任麗莉，劉超，肖建英Δ

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生院，遼寧 錦州 121001；2.錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達與臨床意義

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院 研究生院，遼寧 錦州 121001；2.錦州市食品藥品檢驗所，遼寧 錦州 121000)

目的 研究蛋白激酶1活化受體(protein kinase 1 activation receptors，Rack1)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在胃癌組織中的表達情況，以及與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，探討二者的相關(guān)性及臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測Rack1與β-catenin在70例胃癌組織和30例距癌組織邊緣10 cm以上的癌旁胃組織中的表達情況。結(jié)果 與癌旁胃組織相比，Rack1在胃癌組織中的表達明顯降低(P<0.01)，β-catenin在胃癌組織中出現(xiàn)明顯的膜表達缺失(P<0.01)。胃癌組織中Rack1蛋白的高表達率、β-catenin膜表達的缺失率均在不同TNM分期、腫瘤的分化程度以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而Rack1和β-catenin在胃癌組織的表達水平與不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤浸潤深度方面的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。胃癌組織中Rack1蛋白表達與β-cantenin膜表達缺失呈顯著負相關(guān)(r=-0.691，P=0.000)。結(jié)論 Rack1和β-catenin蛋白的異常表達可能共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并影響胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。

胃癌；Rack1；β-catenin；免疫組織化學(xué)

胃癌是一類常見的消化道惡性腫瘤，每年死亡人數(shù)在各類惡性腫瘤中位居第二[1]。在臨床表現(xiàn)中，各種病理類型的胃癌發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)歸有所不同，其調(diào)控的分子機制尚不清楚。蛋白激酶1活化受體(protein kinase 1 activation receptors，Rack1)是一種細胞構(gòu)架蛋白并且參與諸多細胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)，Rack1有助于使與其結(jié)合的蛋白質(zhì)或分子穩(wěn)定在失活或者活化狀態(tài)[2]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是調(diào)控Wnt信號傳導(dǎo)的核心分子，Wnt/β-catenin通路是最經(jīng)典的一條Wnt信號通路，廣泛存在于多細胞生物體內(nèi)[3]，此通路的障礙或異常調(diào)控影響著腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在目前的研究中，有關(guān)Rack1在胃癌組織中的表達以及對胃癌預(yù)后影響的報道極為少見。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達及分析二者的相關(guān)性，并探討二者表達水平與胃癌不同臨床病理特征間的關(guān)系，為胃癌早期診斷、治療及預(yù)后判斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2012年3月7日～2013年6月20日期間，病理科切除的70例胃癌標(biāo)本。其中男性43例，女性27例；年齡≥60歲的26例，<60歲的44例；腫瘤直徑≤5 cm的28例，>5 cm的42例；未侵及漿膜的34例，侵及漿膜的36例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的23例；有遠隔轉(zhuǎn)移的33例，無遠隔轉(zhuǎn)移的37例；高-中分化30例，低分化40例；Ⅰ-Ⅱ期41例，Ⅲ-Ⅳ期29例；患者術(shù)前均未接受過化療與放療。另選取30例距癌組織邊緣10 cm以上的癌旁正常胃組織標(biāo)本作為對照，以上標(biāo)本臨床病例資料完整。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：鼠抗人β-catenin單克隆抗體購于美國BD公司(產(chǎn)品編號：262505)，兔抗人單克隆Rack1抗體購自MILLIPORE公司(產(chǎn)品編號：MABN1036)；DAB顯色試劑盒購置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號：ZLI-9017)。PV二步法試劑盒購置于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(產(chǎn)品編號：PV-9003)。

1.2.2 儀器：OlympusDP72型顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組織化學(xué)SP法，將組織切片置于60 ℃烤箱中2 h，組織切片按實驗常規(guī)步驟脫蠟水化。高壓鍋將抗原修復(fù)液加熱至沸騰，140 ℃高壓修復(fù)3 min后冷卻至50 ℃以下。3%的H2O2去除氫化物酶，去背景染色。加入一抗，Rack1(1：200)，β-catenin(1：200)4 ℃過夜保存。從4 ℃冰箱取出，室溫復(fù)溫1 h后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染10 min、鹽酸酒精分化5 s、自來水沖洗、脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片、顯微鏡下觀察。同時用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對照，用已知的Rack1與β-catenin的陽性表達標(biāo)本做陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 Rack1表達：Rack1蛋白的陽性表達主要定位于細胞漿，Rack1陽性細胞計數(shù)是指在400倍光鏡下隨機選取每張切片的5個視野，每個高倍視野計數(shù)多于300個細胞。采用雙評分法，陽性細胞所占的百分比<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。陽性細胞染色強度評分，無著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。綜合評分由兩類積分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～9分為陽性(++)，>10分為強陽性(+++)。(+)～(++)為低表達，(+++)以及(+++)以上為高表達。

1.4.2 β-catenin表達：從細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核著色3個方面判斷β-catenin的表達特征。β-catenin的免疫組織化學(xué)結(jié)果參照文獻[4]評定，陽性染色呈棕黃色。在光學(xué)顯微鏡下，隨機選擇5個高倍視野進行觀察，每一視野計數(shù)多于300個細胞，細胞膜陽性細胞率>70%評定為正常表達，反之為膜表達缺失。細胞質(zhì)或細胞核陽性表達，陽性細胞數(shù)>10%為異位表達。膜表達缺失與異位表達均為陽性表達。所有切片均由兩位資深病理科醫(yī)生應(yīng)用雙盲法進行臨床評價。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用例數(shù)或率表示，2組間比較采用χ2檢驗分析,2指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rack1在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 Rack1蛋白在癌旁胃組織和胃癌組織中的陽性表達均定位于細胞質(zhì)(見圖1B、C、D)。Rack1在胃癌組織(圖1C、D)中的表達明顯低于癌旁胃組織(圖1B)，并且Rack1在高中分化的胃癌組織(圖1C)中的表達量高于低分化胃癌組織(圖1D)。

圖1 Rack1在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達(SABC×400)A：陰性對照；B：癌旁胃組織；C：高中分化胃癌組織；D：低分化胃癌組織Fig.1 Expressions of Rack1 in tissues of carcinoma and para-carcinoma(SABC×400)A：negative control; B：para-carcinoma tissue；C：well-differentiated and severe-differentiated gastric carcinoma tissue；D: poorly differentiated gastric carcinoma tissue

分析結(jié)果顯示，Rack1在癌旁胃組織中高表達率為86.7%(26/30)，在胃癌組織中高表達率為34.3%(24/70)，胃癌組織中Rack1的高表達率明顯低于癌旁胃組織(χ2=23.048，P<0.05)。見表1。

表1 70例胃癌組織和30例癌旁胃組織中Rack1表達

*P<0.05，與癌旁胃組織比較，compared with para-carcinoma tissue

2.2 β-catenin在胃癌組織和癌旁胃組織中的表達 β-catenin在癌旁胃組織中的陽性表達主要定位于細胞膜(圖2B)，而在胃癌組織中的陽性表達主要定位于細胞質(zhì)和細胞核(圖2C、D)，即β-catenin在胃癌組織中出現(xiàn)明顯的膜表達缺失。

圖2 β-catenin在胃癌組織和癌旁正常胃組織中的表達(SABC×400) E：陰性對照；F：癌旁胃組織；G：高中分化胃癌組織；H：低分化胃癌組織 Fig.2 Expressions of β-catenin in tissues of carcinoma and para-carcinoma(SABC×400)A：negative control; B：para-carcinoma tissue；C：well-differentiated and severe-differentiated gastric carcinoma tissue；D: poorly differentiated gastric carcinoma tissue

分析結(jié)果顯示，β-catenin在癌旁胃組織中發(fā)生膜表達缺失率為10.0%(3/30)，在胃癌組織中發(fā)生膜表達缺失率為62.9%(44/70)。胃癌組織中β-catenin的膜表達缺失率明顯高于癌旁胃組織(χ2=23.048，P<0.05)。見表2。

表2 70例胃癌組織和30例癌旁胃組織中β-catenin表達

*P<0.05，與癌旁胃組織比較，compared with para-carcinoma tissue

2.3 Rack1與β-catenin蛋白在胃癌組織的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 胃癌組織中Rack1蛋白表達的高低與TNM分期、腫瘤的分化程度以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Rack1在Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織中的表達高于在Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織中的表達(P<0.01)；在高-中分化胃癌組織中Rack1的表達高于低分化胃癌組織(P<0.01)；Rack1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P<0.01)。

同時，β-catenin膜表達的缺失率也與腫瘤的分化程度、TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。β-catenin在低分化胃癌組織的膜表達缺失明顯高于高中分化的胃癌組織(P<0.01)；β-catenin在Ⅲ、Ⅳ期胃癌標(biāo)本中的膜表達缺失明顯高于Ⅰ、Ⅱ期胃癌標(biāo)本(P<0.01)；并且β-catenin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的膜表達缺失顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的膜表達缺失(P<0.01)。而Rack1和β-catenin在胃癌組織的表達水平與年齡、性別等因素?zé)o關(guān)。見表3。

表3 Rack1與β-catenin蛋白在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

2.4 胃癌組織中Rack1蛋白表達與β-catenin膜表達缺失的相關(guān)性分析 在70例胃癌組織中，Rack1蛋白高表達、β-catenin膜表達缺失為4例；β-catenin蛋白高表達、β-catenin膜表達正常為20例；Rack1蛋白低表達、β-catenin膜表達缺失為40例；Rack1蛋白低表達、β-catenin膜表達正常為6例。采用Spearman相關(guān)分析表明，Rack1蛋白表達水平越低，β-catenin膜表達缺失越高；相反Rack1蛋白表達越高，β-catenin膜表達缺失越低，二者呈顯著負相關(guān)(r=-0.691，P=0.000)。見表4。

表4 胃癌組織中Rack1蛋白表達水平與β-catenin蛋白膜表達缺失的相關(guān)性(n)

3 討論

研究表明，Rack1與G蛋白β亞基具有高度同源性，并且Rack1所具有的七葉螺旋槳結(jié)構(gòu)，可促進Rack1與其它蛋白質(zhì)相結(jié)合[5]。Rack1作為調(diào)控多條重要腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移信號通路的關(guān)鍵基因，亦可整合不同的信號通路，協(xié)調(diào)關(guān)鍵信號分子相互作用，在腫瘤細胞功能活動中發(fā)揮重要作用[6-7]。Rack1可以通過激活蛋白激酶C(PKC)來促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和多種細胞功能[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，Rack1在胃癌組織中表達下調(diào)，且其表達水平與腫瘤的分化程度和浸潤深度顯著相關(guān)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)Rack1在胃癌組織中的表達量明顯低于癌旁正常胃組織(P<0.05)，且表達水平的高低與TNM分期、腫瘤的分化程度、以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。即：Rack1在Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織中的表達高于在Ⅲ-Ⅳ期胃癌組織中的表達(P<0.01)；在高-中分化組中Rack1的表達高于低分化組(P<0.01)；Rack1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，提示Rack1表達水平可能影響胃癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。

Wnt/β-catenin通路是Wnt通路中一條最經(jīng)典的通路，其核心部件在進化中是高度保守的。當(dāng)Wnt信號通路發(fā)生異常調(diào)控時，會影響細胞正常的生長、分化、增殖與遷移，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[12-13]。有文獻報道，在Wnt信號缺失的情況下，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin會被磷酸化而降解，隨β-catenin含量的上升，它進入并聚集在細胞核內(nèi)，與特定的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起細胞遷移能力和細胞極性的改變，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[14]。本研究表明，胃癌組織中β-catenin膜表達的缺失率與腫瘤的分化程度、TNM分期以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。β-catenin膜表達的缺失率隨胃癌分化程度的降低而升高(P<0.05)； β-catenin在Ⅲ期-Ⅳ期胃癌標(biāo)本中的膜表達缺失率明顯高于Ⅰ期-Ⅱ期胃癌標(biāo)本(P<0.01)；并且β-catenin的膜表達缺失率也與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的膜表達缺失率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的膜表達缺失率(P<0.05)。本實驗結(jié)果提示，β-catenin膜表達缺失率的高低可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)。

文獻報道[15]， Rack1顯著促進Wnt/ β-catenin信號通路，并促進其核心分子β-catenin的降解，使其信號通路的活化受到抑制。由于Rack1與β-catenin在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，所以本研究聯(lián)合檢測Rack1與β-catenin在胃癌中表達的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Rack1表達水平與β-catenin膜表達缺失呈顯著負相關(guān)(r=-0.691，P=0.000)。提示二者表達量的變化可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程有關(guān)，所以聯(lián)合檢測Rack1與β-catenin在胃癌組織中的表達情況有助于進一步探討胃癌發(fā)展趨勢，為預(yù)后判斷提供有利的實驗依據(jù)。

綜上所述， Rack1和β-catenin蛋白的異常表達可能共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并影響胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移。因此，深入研究Rack1與β-catenin蛋白，將有助于進一步探討胃癌發(fā)生的分子機制。在臨床治療中，聯(lián)合檢測這兩個蛋白，有望為腫瘤的治療提供有效的新靶點。

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(編校：王儼儼)

Expressions and clinical significance of Rack1 and β-catenin in gastric carcinoma tissue

WANG Yi-zhao1, GUO Lin2, LIU Yi-meng1, REN Li-li1, LIU Chao1, XIAO Jian-ying1Δ

(1.School of Graduates,Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2.Jinzhou Institute for Food and Drug Control, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the expression levels of protein kinase 1 activation receptors(Rack1)and β-catenin in gastric carcinomas and the relations with clinical pathological parameters, and correlation between Rack1 and β-catenin and their significance.MethodsImmunohistochemical SP method was used to detect the expressions of Rack1 and β-catenin protein in 70 cases of human gastric carcinomas and 30 cases of gastric mucosa(distance from tumor edge ≥10 cm).ResultsCompared to the gastric surrounding tissues, the expression of Rack1 in gastric cancer decreases apparently(P<0.01)，and the expression of β-catenin deletion was more significant in the membrane of gastric cancer(P<0.01).There were significant difference in high expression of Rack1 protein and deletion expression of β-catenin of gastric carcinomas between different TNM stage, tumor differentiation and lymphatic metastasis(P<0.01),while there were no significant difference between different age, gender, diameter of tumor and the depth of neoplasm invasiveness.The expression of Rack1 and the deletion of β-catenin in membrane had a negative correlation(r=-0.691，P=0.000).ConclusionThe abnormal expression of Rack1 and β-catenin may be relevant to the occurrence and development of gastric carcinomas It also affects the lymphatic metastasis of gastric carcinomas.

gastric carcinomas; Rack1; β-catenin; immunohistochemical

遼寧省科技廳項目(2013225305)

王一曌，女，碩士在讀，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué),E-mail：babyyizhao@126.com；肖建英，通信作者，女，博士，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：xiaojianying@lumn.edu.cn。

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.08