結核分枝桿菌對巨噬細胞巖藻糖轉移酶家族基因表達的影響

胡鋒，潘勤，章曉聯(lián)

(武漢大學病毒學國家重點實驗室/湖北省過敏及免疫相關疾病重點實驗室/武漢大學醫(yī)學研究院/ 武漢大學基礎醫(yī)學院 免疫學系，湖北 武漢 430071)

結核分枝桿菌對巨噬細胞巖藻糖轉移酶家族基因表達的影響

胡鋒，潘勤，章曉聯(lián)Δ

(武漢大學病毒學國家重點實驗室/湖北省過敏及免疫相關疾病重點實驗室/武漢大學醫(yī)學研究院/ 武漢大學基礎醫(yī)學院 免疫學系，湖北 武漢 430071)

目的 研究結核分枝桿菌標準株H37Rv(inactivated H37Rv, iH37Rv)刺激巨噬細胞RAW264.7細胞后，對巖藻糖轉移酶家族中的10個糖基轉移酶表達的影響。方法 用熱滅活的iH37Rv刺激小鼠巨噬細胞系RAW264.7，用qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測iH37Rv分別刺激RAW264.7細胞0 h、4 h、8 h、12 h后對巨噬細胞中10個巖藻糖基轉移酶的mRNA表達水平的影響。凝集素染色和流式細胞術檢測巖藻糖轉移酶對應的糖苷的表達變化。結果 iH37Rv分別刺激RAW264.7細胞0 h、4 h、8 h、12 h后，巖藻糖轉移酶1(FUT1)基因的表達隨著刺激時間的延長而逐步下調。凝集素染色和流式細胞術檢測顯示特異性結合巖藻糖轉移酶-FUT1對應糖苷的小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin，LCA)在iH37Rv刺激巨噬細胞12 h后結合巨噬細胞上對應的糖苷的能力下降了4.6%。 結論 FUT1糖基轉移酶在iH37Rv刺激巨噬細胞后發(fā)生下調，其有可能作為結核分枝桿菌感染的診斷分子標志和治療新靶點。

結核分枝桿菌；巨噬細胞；糖基轉移酶

結核病(tuberculosis)仍然是世界上傳播得最廣的傳染性疾病之一，全世界大約有1/3的人口感染了結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)[1]，在2012年有近130萬人因感染了MTB而死亡[2]，死亡的患者中大部分是由于感染了多重耐藥性結核(multidrug resistant tuberculosis, MDR TB)、廣譜耐藥性結核(extensive drug resistant tuberculosis, XDR TB)或者同時感染了艾滋病毒[2]。MTB是結核病的主要致病原，患者在感染MTB后，可產生固有免疫應答和適應性免疫應答來清除MTB，而MTB在被患者體內的巨噬細胞吞噬后，部分細菌可因此躲避患者其他免疫殺傷而潛伏起來，在巨噬細胞中長期、緩慢地復制，最終導致巨噬細胞死亡[3-5]。

作為MTB最主要的宿主靶細胞，巨噬細胞是一種功能非常強大的細胞，在吞噬病原體后能分泌多種酶和免疫活性物質來殺傷病原體[6]。糖基轉移酶作為糖基化修飾中重要的一環(huán)，專門負責催化糖基化反應，它們將活性糖基從糖基供體轉移到糖基受體，并形成糖苷鍵[7]，在真核生物的基因組中約有1%的基因編碼糖基轉移酶[8]。蛋白質糖基化參與免疫分子的包裝及蛋白的降解和翻譯的調控過程，與細菌、病毒的感染和腫瘤細胞的轉移密切相關[9-11]。由于巨噬細胞糖基轉移酶參與了免疫分子的加工過程，其本身的表達水平勢必將影響免疫分子正常的結構和功能。有報道[12]，糖基轉移酶的表達水平的不同會影響巨噬細胞的功能和膜表面分子的表達?；颊咴诮邮芰艘浦彩中g后，其體內的巨噬細胞高表達糖基轉移酶2,6-ST(α-2,6-sialyltransferase)，促進患者機體對移植物的殺傷[13]。糖基轉移酶ST6GAL I(β-galactoside α 2-6-sialyltransferase-1)能調節(jié)巨噬細胞的凋亡[14]。

巖藻糖轉移酶是一類功能強大且重要的酶，有報道巖藻糖轉移酶表達的降低會影響單核細胞來源的巨噬細胞的形成[15]。巖藻糖轉移酶FUT4在被沉默后，會通過影響基質金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2，MMP-2)或MMP-9的表達或活性來抑制細胞的遷移[16]。研究[17]通過分別沉默F(xiàn)UT4、FUT7、FUT9這3個巖藻糖轉移酶發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT7和FUT4均參與了對人和小鼠的細胞因子PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand-1)的N端合成, 而FUT9被沉默后，白細胞的粘附功能大幅降低。

但目前國內外尚未有關于MTB感染巨噬細胞后對巖藻糖轉移酶表達影響的相關研究，本課題旨在通過用滅活的MTB標準株H37Rv刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系，研究其對巖藻糖轉移酶家族中的10個糖基轉移酶mRNA的表達的影響，以進一步探討結核分枝桿菌感染的診斷分子標志物，并為探討巨噬細胞在結核感染中的免疫調控機制提供一定線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌和細胞：RAW264.7細胞(鼠巨噬細胞細胞系，由本實驗室保存)，H37Rv(結核分枝桿菌標準株，由武漢大學生物安全三級實驗室經65 ℃，2 h滅活后提供)

1.1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)； Trizol Reagent(Invitrogen，美國)；ReverseTra Ace 逆轉錄試劑盒(Toyobo，日本)。

1.1.3 儀器：SYBR Green Real-time PCR Master Mix(Toyobo，日本)；實時熒光定量PCR儀(step one plus)(ABI 美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及iH37Rv刺激：將RAW 264.7細胞接種于含有10%滅活胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。取處于對數生長期的細胞，以2×105細胞/孔的密度接種到無菌的6孔板，培養(yǎng)過夜，按2×106/mL的濃度加入適量的iH37Rv到每孔中，分別培養(yǎng)4、8、12 h，之后收獲細胞，用無菌的PBS溫和離洗5次除盡殘留的培養(yǎng)基，加入適量的Trizol Reagent重懸。

1.2.2 qRT-PCR檢測10個巖藻糖轉移酶mRNA水平：采用Trizol法分別抽提iH37Rv刺激0、4、8、12 h的RAW264.7細胞的總RNA，用ReverseTra Ace 逆轉錄試劑盒，按照其說明書，取1 μg RNA，以隨機引物反轉錄為cDNA；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)做內參，實時熒光定量PCR法檢測10個巖藻糖轉移酶mRNA的表達。反應體系如下：2 μL cDNA、1μL上游引物(10μm)、1μL下游引物(10 μM)、10 μL 2×SYBR Green mix、6 μL無RNase水。反應條件如下：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 45 s，后3步40次循環(huán)。按ΔΔCT = 2-(Cttarget gene-CtGAPDH)計算。實驗重復3次。

1.2.3 凝集素染色和流式細胞術檢測:以細菌:細胞=10:1的比例加入適量的iH37Rv刺激RAW264.7細胞12 h，收獲細胞，用無菌的PBS溫和離洗3次，調整細胞濃度至106/mL左右，加入生物素標記的LCA凝集素，4 ℃孵育30 min，用無菌的PBS溫和離洗3次，加入FITC標記的鏈霉親和素，4 ℃孵育1 h，用無菌的PBS溫和離洗1次，上流式細胞儀檢測，實驗重復3次。

2 結果

2.1 iH37RV刺激RAW264.7細胞后差異表達的巖藻糖轉移酶的篩選與鑒定 根據NCBI中公布的10個巖藻糖轉移酶的序列設計的引物見表1，采用qRT-PCR檢測10個巖藻糖轉移酶mRNA的表達，結果顯示：iH37Rv分別刺激RAW264.7細胞0、4、8、12 h后，F(xiàn)UT1的mRNA的表達水平隨著刺激時間的延長而逐步下調，12 h時FUT1 mRNA的表達下降為未刺激組(即0 h組)的0.02倍; 其余的糖基轉移酶的表達變化與時間點無相關性。iH37Rv刺激12h后，F(xiàn)UT4和FUT的表達上調，F(xiàn)UT9的表達下調。見圖1、表2。

表1 10個小鼠巖藻糖轉移酶的引物

圖1 iH37RV刺激RAW264.7細胞后10個巖藻糖轉移酶的mRNA表達的變化Fig.1 Measurement of mRNA expressions of 10 kinds of fucosyltransferases in iH37Rv stimulated RAW264.7 ±s,n=3)

編號糖基轉移酶倍數0hr4hr8hr12hr1FUT13 82±0 171 67±0 120 50±0 100 08±0 032FUT21 28±0 142 15±0 070 81±0 050 57±0 013FUT40 69±0 021 62±0 090 85±0 042 53±0 254FUT70 13±0 031 41±0 160 51±0 070 33±0 045FUT80 01±0 010 02±0 010 05±0 010 11±0 026FUT93 91±0 270 51±0 050 73±0 020 50±0 047FUT100 71±0 020 60±0 030 99±0 080 06±0 018FUT110 01±0 010 23±0 020 25±0 020 03±0 019POFUT10 49±0 030 40±0 010 14±0 030 77±0 1010POFUT20 77±0 120 34±0 021 24±0 110 67±0 05

2.2 凝集素染色和流式細胞儀檢測iH37RV刺激后RAW264.7細胞表面巖藻糖轉移酶對應的糖蛋白表達的變化 通過熒光FITC標記的LCA凝集素染色結果顯示：凝集素LCA結合iH37Rv刺激后的巨噬細胞中巖藻糖轉移酶催化的糖配體的能力從91.3%下降到86.7%，結合能力下降了4.6%。熒光強度的變化也顯示iH37Rv刺激12 h后，LCA結合巨噬細胞上對應的糖配體的能力下降。見圖2。

圖2 iH37RV刺激RAW264.7細胞后LcA凝集素結合RAW264.7細胞表面糖配體的結合力的變化Fig.2 Expression levels assessed by lectin binding analysis of membrane glycoproteins of fucosyltransferases when RAW264.7 cells were stimulated by iH37Rv

3 討論

結核病作為一種潛伏性疾病，其發(fā)病是一個長期而緩慢的過程，結核分枝桿菌在進入人體后，僅在少數人中發(fā)展為活動性結核，而在大部分的宿主中潛伏下來[18]，當宿主的免疫力低下時，發(fā)展為活動性結核的幾率增加，合并感染HIV的患者發(fā)展為活動性結核的幾率隨著感染年數的增長，每年增加10%[19-20]。

結核分枝桿菌在人體內的主要宿主是巨噬細胞，正是因為巨噬細胞的吞噬，結核分枝桿菌能躲避其他免疫途徑的攻擊，而結核分枝桿菌在巨噬細胞內存活、逃逸巨噬細胞的殺傷的具體分子機制尚未明確。在結核分枝桿菌進入巨噬細胞后，巨噬細胞的糖基轉移酶的表達及活性均發(fā)生了改變，本研究擬通過研究這些糖基轉移酶，探討結核病逃逸巨噬細胞殺傷的分子機制。

有報道稱，F(xiàn)UT1的表達降低會促進感染[21]，這與本研究結果一致。有研究稱[22]，F(xiàn)UT1能促進血管的生成并能調節(jié)炎癥因子ICAM-1的表達，有報道稱[23]，F(xiàn)UT1還參與了MUC-1和整合素等粘附分子的合成和結構調整，F(xiàn)UT1在血管生成、細胞粘附中發(fā)揮重要調節(jié)作用，并參與調節(jié)類風濕關節(jié)炎患者的成纖維細胞的增殖[24]，F(xiàn)UT1被沉默后會對細胞的粘附及復制產生負面影響[25]，這說明FUT1在細胞粘附中發(fā)揮了非常重要的作用，而免疫系統(tǒng)在發(fā)揮功能時，免疫細胞需要通過粘附分子與病原微生物或者靶細胞相接觸，F(xiàn)UT1的表達的下調可能會影響免疫細胞正常的細胞粘附功能和某些炎癥因子的表達，從而影響機體抗感染的免疫應答水平。還有報道稱FUT1的存在對于細胞的內吞作用必不可少[26]，而本研究表明iH37Rv刺激巨噬細胞12 h后，其FUT1的表達是下調的，這說明iH37Rv導致巨噬細胞的FUT1下調可能會影響巨噬細胞正常的吞噬功能，從而使結核分枝桿菌持續(xù)刺激機體，導致巨噬細胞聚集和更多的巨噬細胞被結核分枝桿菌感染。

本研究發(fā)現(xiàn)RAW264.7細胞受到iH37Rv刺激后，隨著刺激時間的延長，而FUT1的表達逐步下調，說明FUT1這個巖藻糖轉移酶可能在RAW264.7細胞對抗H37Rv的感染中發(fā)揮了重要作用，從而有作為治療結核新靶點的潛力，下一步將研究iH37Rv刺激與FUT1表達變化的內在關系和具體的分子機制，以及FUT1在H37Rv感染中的具體功能，并在結核病患者的臨床血液樣本中驗證，以期找到結核感染的診斷新分子標志物以及治療結核感染的新藥物靶點。

[1] Guideline. Nutritional care and support for patients with tuberculosis[M].Geneva: World Health Organization，2013.

[2]Alderwick LJ, Lloyd GS, Ghadbane H, et al. The C-terminal domain of the Arabinosyltransferase Mycobacterium tuberculosis EmbC is a lectin-like carbohydrate binding module[J]. PLoS Pathog, 2011,7(2):e1001299.

[3]Xiong X, Zhang HM, Wu TT, et al. Titer dynamic analysis of D29 within MTB-infected macrophages and effect on immune function of macrophages[J]. Exp Lung Res, 2014, 40(2):86-98.

[4]Danelishvili L, Everman J, Bermudez LE. Mycobacterium tuberculosis PPE68 and Rv2626c genes contribute to the host cell necrosis and bacterial escape from macrophages[J]. Virulence, 2015(25):1-10.

[5]Chandra P, Ghanwat S, Matta SK, et al. Mycobacterium tuberculosis Inhibits RAB7 Recruitment to Selectively Modulate Autophagy Flux in Macrophages[J]. Sci Rep, 2015(5):16320.

[6]Krapp S, Mimura Y, Jefferis R, et al. Structural analysis of human IgG-Fc glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity[J].J Mol Biol, 2003, 325(5):979-989.

[7]Coutinho PM, Deleury E, Davies GJ, et al. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases[J].J Mol Biol, 2003,328(2):307-317.

[8]Gan Y, Guo S. Controlling strategy of dormant Mycobacterium tuberculosis[J].Chin Med J(Engl), 2014,127(18):3316-3321.

[9]Kim YS, Yoo HS, Ko JH. Implication of aberrant glycosylation in cancer and use of lectin for cancer biomarker discovery[J].Protein Pept Lett, 2009,16(5):499-507.

[10]Taniguchi N, Korekane H. Branched N-glycans and their implications for cell adhesion, signaling and clinical applications for cancer biomarkers and in therapeutics[J].BMB Rep, 2011,44(12):772-781 .

[11]Takahashi M, Kuroki Y, Ohtsubo K, et al. Core fucose and bisecting GlcNAc, the direct modifiers of the N-glycan core: their functions and target proteins[J]. Carbohydr Res, 2009, 344(12):1387-1390.

[12]Maeda A, Kawamura T, Nakahata K, et al. Regulation of macrophage-mediated xenocytotoxicity by overexpression of alpha-2,6-sialyltransferase in swine endothelial cells[J]. Transplant Proc, 2014, 46(4):1256-1258.

[13]Trottein F, Schaffer L, Ivanov S, et al. Glycosyltransferase and sulfotransferase gene expression profiles in human monocytes, dendritic cells and macrophages[J]. Glycoconj J, 2009, 26(9):1259-1274.

[14]Liu Z, Swindall AF, Kesterson RA, et al. ST6Gal-I regulates macrophage apoptosis via α2-6 sialylation of the TNFR1 death receptor[J]. J Biol Chem, 2011,286(45):39654-39662.

[15]Cullen P, Mohr S, Brennhausen B, et al.Downregulation of the selectin ligand-producing fucosyltransferases Fuc-TIV and Fuc-TVII during foam cell formation in monocyte-derived macrophages[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997,17(8):1591-1598.

[16]Hu Y, Blair JD, Yuen RK, et al. Genome-wide DNA methylation identifies trophoblast invasion-related genes: Claudin-4 and Fucosyltransferase IV control mobility via altering matrix metalloproteinase activity[J].Mol Hum Reprod, 2015, 21(5):452-465.

[17]Buffone A Jr, Mondal N, Gupta R, et al. Silencing α1,3-fucosyltransferases in human leukocytes reveals a role for FUT9 enzyme during E-selectin-mediated cell adhesion[J]. J Biol Chem, 2013,288(3):1620-1633.

[18]Mariotti S, Pardini M, Gagliardi MC, et al. Dormant Mycobacterium tuberculosis fails to block phagosome maturation and shows unexpected capacity to stimulate specific human T lymphocytes[J]. J Immunol, 2013,191(1):274-282.

[19]Joshi RR, Barchha A, Khedkar VM, et al. Targeting dormant tuberculosis bacilli: results for molecules with a novel pyrimidone scaffold[J]. Chem Biol Drug Des, 2015, 85(2):201-207.

[20]Collins HL, Kaufmann SH. Prospects for better tuberculosis vaccines[J].Lancet Infect Dis, 2001, 1(1):21-28.

[21]Wang SJ, Liu WJ,Yang LG, et al. Effects of FUT1 gene mutation on resistance to infectious disease[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(3):2805-2810.

[22]Amin MA, Campbell PL, Ruth JH, et al. A key role for Fut1-regulated angiogenesis and ICAM-1 expression in K/BxN arthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2015,74(7):1459-1466.

[23]López-Ferrer A, de Bolós C. The expression of human FUT1 in HT-29/M3 colon cancer cells instructs the glycosylation of MUC1 and MUC5AC apomucins[J]. Glycoconj J, 2002,19(1):13-21.

[24]Isozaki T, Ruth JH, Amin MA, et al. Fucosyltransferase 1 mediates angiogenesis, cell adhesion and rheumatoid arthritis synovial tissue fibroblast proliferation[J]. Arthritis Res Ther, 2014,16(1):R28.

[25]Palumberi D, Aldi S, Ermini L, et al. RNA-mediated gene silencing of FUT1 and FUT2 influences expression and activities of bovine and human fucosylated nucleolin and inhibits cell adhesion and proliferation[J]. J Cell Biochem, 2010,111(1):229-238.

[26]Sasamura T, Ishikawa HO, Sasaki N, et al. The O-fucosyltransferase O-fut1 is an extracellular component that is essential for the constitutive endocytic trafficking of Notch in Drosophila[J]. Development, 2007,134(7):1347-1356.

(編校：譚玲)

Influence ofMycobacteriumtuberculosisstimulation on the expression of fucosyltransferases in macrophages

HU Feng, PAN Qin, ZHANG Xiao-lianΔ

(The State Key Laboratory of Virology/Hubei Province Key Laboratory of Allergy and Immunology/Medical Rresearch Institute, Wuhan University/Department of Immunology, Wuhan University School of Medicine, Wuhan 430071, China)

ObjectiveTo study afterMycobacteriumtuberculosis(MTB) H37Rv stimulation on mouse macrophage RAW 264.7 cell lines, the effect on the expression of Fucose transfer 10 glycosyl transferase enzyme family.MethodsRAW264.7 cell lines were treated with heat inactivated H37Rv(iH37Rv) stimulation for 0 h, 4 h, 8 h and 12 h, qRT-PCR was used to measure the expressions of mRNA of fucosyltransferases. Lectin staining and flow cytometry were used to examine the binding ability of lectin Lens culinaris agglutinin(LCA)to glycoprotein ligand by fucosyltransferase on macrophages.ResultsThe expression of FUT1 were found progressively decreased in RAW 264.7 cells at different time points of iH37Rv stimulation and the macrophage binding ability of lectin LCA which specifically binds to glycoprotein ligand by fucosyltransferase decreased 4.6% after 12 h of iH37Rv stimulation.ConclusionThe expression of FUT1 in macrophages decrease after iH37Rv stimulation and thus FUT1 has potentials as a diagnosis molecular marker or drug target for tuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; Macrophages; glycosyltransferases

國家重大傳染病專項(2012ZX10003002-015)；國家自然科學基金項目(31221061，31270176，81471910，31370197，21572173)和湖北省醫(yī)學領軍人才項目(523-276003)

胡鋒，男，碩士，研究方向：感染與分子免疫，E-mail：fenghu5818@163.com；章曉聯(lián)，通信作者，女，博士，二級教授，研究方向：病原微生物糖生物學和感染免疫，E-mail：zhangxiaolian@whu.edu.cn。

S852.61

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.05