染色體核型異常和Y染色體微缺失在男性不育中的臨床研究

裘　娟，李　巖，劉　璐，劉　群，邵小光

(1.大連市婦女兒童醫(yī)療中心 生殖與遺傳醫(yī)學中心，遼寧 大連 116037；2.大連醫(yī)科大學 解剖學教研室，遼寧 大連 116044)

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染色體核型異常和Y染色體微缺失在男性不育中的臨床研究

裘娟1，李巖2，劉璐2，劉群1，邵小光1

(1.大連市婦女兒童醫(yī)療中心 生殖與遺傳醫(yī)學中心，遼寧 大連 116037；2.大連醫(yī)科大學 解剖學教研室，遼寧 大連 116044)

[摘要]目的探討染色體異常及Y染色體微缺失在男性不育中的臨床意義。方法選擇2013年1月至2015年6月來大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學中心要求助孕的90例無精子癥患者(無精子癥組)，62例嚴重少精子癥患者(嚴重少精子癥組)及50例已有生育史或精液常規(guī)檢查正常男性自愿者(正常對照組)，采用外周血常規(guī)染色體制備方法對染色體進行核型分析。其中無精子癥組56例，少精子癥組42例，正常對照組30例，采用多重聚合酶鏈反應進行Y染色體無精子因子(AZF)微缺失檢測。結果90例無精子癥者檢出染色體核型異常16例，異常率為17.8%，均為性染色體異常；62例嚴重少弱精子癥者檢出染色體核型異常9例，異常率為14.5%，分別為性染色體異常6例(9.7%)，常染色異常3例(4.8%)；三組組間比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。9例無精子癥及4例少精子癥患者檢測出Y染色體AZF微缺失，缺失位點為AZFb 1例、AZFc 10例、AZFd 1例、AZFc+d 1例，30例對照組未見缺失。結論染色體異常與Y染色體微缺失是男性不育的重要病因，其檢測為男性不育臨床診斷和治療提供科學依據。

[關鍵詞]男性不育；無精子癥；嚴重少精子癥；染色體異常；Y染色體微缺失

[引用本文]裘娟，李巖，劉璐，等.染色體核型異常和Y染色體微缺失在男性不育中的臨床研究[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(1)：48-51.

育齡夫婦中不孕不育的發(fā)生率為10%～15%，其中男性因素約占50%。染色體異常是男性不育的首要原因，Y染色體微缺失是造成男性不育的第二大遺傳學因素[1]。造成睪丸生精障礙的主要原因：(1)染色體異常，克氏癥為其中的大多數，在不育男性中發(fā)病率為3%[2]；國外文獻報道無精子癥中染色體異常率為12.5%～31%，嚴重少精癥中染色體異常率為1.1%～13.3%。(2)Y染色體微缺失，Y染色體長臂上含有的無精子因子(azoospermia factor，AZF)是導致睪丸精子生成障礙的主要原因。2014年歐洲男科學協會(EAA)和歐洲分子遺傳實驗質控協作網(EMQN)在Y染色體微缺失檢測指南中指出，中國地區(qū)男性Y染色體微缺失發(fā)生率為11.5%[3]。本研究旨在探討男性不育患者精子異常情況與染色體核型及Y染色體微缺失的關系。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年1月至2015年6月于大連市婦女兒童醫(yī)療中心生殖與遺傳醫(yī)學中心要求助孕的無精子癥患者90例作為無精子組；嚴重少精子癥患者62例作為少精子組。無精子組年齡24～43歲，平均年齡(32.8±5.7)歲；不育年限1～14年，平均(4.7±3.7)年；少精子組年齡26～50歲，平均年齡(35.2±6.6)歲；不育年限1～18年，平均(4.1±4.3)年。每名患者詳詢病史及生育史，排除外傷史和家族遺傳病史，排除女方不孕因素，經皮睪丸穿刺精子抽吸術/經皮附睪穿刺精子抽吸術(TESA/PESA)者穿刺之前行生殖器體格檢查。對照組為同期年齡相當、已有生育史或精液常規(guī)檢查正常的健康男性50例。采用外周血常規(guī)染色體制備方法對染色體進行核型分析。其中無精子癥組56例，少精子癥組42例，正常對照組30例，采用多重聚合酶鏈反應進行Y染色體AZF微缺失檢測。

1.2精液分析

排精后2～7 d手淫法收集精液，手工精液分析參照WHO標準指南，所有病例均常規(guī)進行至少2次以上的精液分析檢查。鏡下檢查未見精子者的精液，1500 r/min離心15 min沉淀后仍未發(fā)現精子者為無精子癥，并排除逆向射精；精子濃度<5×106/mL為嚴重少精子癥。

1.3染色體檢查

外周血染色體常規(guī)制備方法對染色體進行核型分析，G顯帶分析計數20個中期分裂象，分析5個細胞核型，異常核型則分析20個分裂象，根據《人類細胞遺傳學國際命名體制》描述染色體異常核型。

1.4Y染色體微缺失檢測

從外周血淋巴細胞提取DNA，參考歐洲生殖協會(EAA)2014版指導原則和EMQN標準，選擇Y染色體微缺失共4個區(qū)域9個位點設計引物，9個選擇位點分別是AZFa(SY84、SY86)、AZFb(SY127、SY134、SY143)、AZFc(SY157、SY254、SY255)、AZFd(SY152)，以SRY和ZFX/Y的擴增作為PCR質控對照，正常男性的DNA作為陽性對照，正常女性DNA作為陰性對照，滅菌蒸餾水作為空白對照，與患者DNA同時進行以上各位點的多重PCR，分兩組進行擴增，擴增后電泳檢查PCR擴增產物。

1.5睪丸/附睪穿刺

會陰局部皮膚消毒，檢查附睪尋找穿刺位點，用注射器連接5號半頭皮針經皮直接穿刺抽吸附睪組織飽滿處抽吸附睪液尋找活動精子；若一側附睪穿刺取精失敗則檢查對側附睪穿刺取精；以上均失敗則用注射器連接7號頭皮針經皮直接穿刺睪丸抽取生精小管尋找活動精子。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。比較各組染色體異常的發(fā)病率。n≥40,且所有期望值T≥5時，采用pearson卡方檢驗；n≥40，1≤T≤5時，采用連續(xù)校正卡方檢驗。P<0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1染色體異常核型檢出率及分布

90例無精子癥患者檢出染色體異常核型16例，異常率為17.8%，均為性染色體異常。其中克氏綜合征10例(11.1%)；47,XYY 1例；Y染色體部分缺失5例(5.5%)。另外有染色體多態(tài)性4例(4.4%),見表1。62例嚴重少精子癥患者染色體異常核型9例，異常率為14.5%，分別為性染色體6例(9.7%)，常染色體3例(4.8%),另外有染色體多態(tài)性3例(4.8%)，見表2。50例對照組中未發(fā)現染色體異常核型，檢出染色體多態(tài)性2例(4%)，分別是21ps+和小Y。3組間異常核型染色體檢出率差異有顯著性意義(P<0.01)。見表3。

表1無精子癥患者染色體異常核型分類及分布

Tab 1 Classification and distribution of chromosomal anomalies in 90 azoospermia patients

分類及染色體核型例數率(%)總異常染色體1617.8 性染色體異常 47,XXY1011.1 47,XYY11.1 46,XY,del(Y)(q12)55.5染色體多態(tài)44.4 46,XY,小Y22.2 46,XY,大Y11.1 46,XY,21ps+11.1

表2嚴重少精子癥患者染色體異常核型分類及分布

Tab 2 Classification and distribution of chromosomal anomalies in 62 severe oligozoospermia patients

分類及染色體核型例數率(%)總異常染色體914.5 性染色體異常 47,XXY11.6 47,XYY23.2 46,XY,del(Y)(q12)23.2 46,XY,t(1;Y)(q21;q12)11.6 常染色體異常 45,XY,rob(13;14)23.2 45,XY,rob(14;15)11.6染色體多態(tài)34.8 46,XY,小Y11.6 46,XY,大Y11.6 46,XY,16qh+11.6

表3三組之間異常染色體發(fā)生率的比較

Tab 3 Comparison of chromosomal anomaly occurrence rate in three groups

n(%)

1)與正常對照組比較，P<0.01；2)與嚴重少精子癥組比較，P<0.01

2.2Y染色體微缺失檢測

共128例進行AZF微缺失檢查，發(fā)現有13例存在微缺失，其中9例為無精子癥，4例為嚴重少精子癥。包括AZFb、AZFc、AZFd及AZFc+d區(qū)缺失。見表4。

表 4Y染色體微缺失發(fā)生率的比較

Tab 4 Comparison of Yq microdeletion occurrence rate in three groups

n(%)

3討論

染色體異常是引起男性生殖功能障礙的重要原因，尤其是性染色體異常。本文中無精子癥患者中異常染色體的檢出率為17.8%，顯著高于嚴重少弱精子癥患者的異常核型檢出率14.5%，對照組中未發(fā)現染色體異常核型。結果表明精液情況越差，其染色體異常核型檢出率越高，尤其是性染色體的異常對生精功能影響最大，這與其他一些文獻報道相符[4-5]。此外，本文在無精子癥患者中檢出染色體多態(tài)性4例(4.6%)，在嚴重少精子癥患者中檢出染色體多態(tài)性3例(4.8%)，與正常對照組2例(4.0%)相比差異無顯著性意義，驗證了染色體多態(tài)性是異染色質的高度重復，從分子水平上看結構異染色質所含DNA主要是“非編碼”的高度重復序列，不含有結構基因，沒有轉錄活性，這與其他文獻報道相符[6]。

克氏綜合征，全名克萊恩費爾特氏綜合征(Klinefelter's征、先天性睪丸發(fā)育不全)，最常見的染色體核型是47，XXY。報道稱其發(fā)生率在不育男性中占3%，無精子癥患者中占13%。本文90例無精子癥患者中檢出10例47，XXY，占無精子癥患者的11.1%，與文獻報道相符。染色體核型的異常發(fā)生原因推測是卵子或精子在減數分裂時染色體未分離，從而導致子代多出1條X染色體。病人在出生時和兒童期與正常人沒有什么差別，只是到了青春期，才顯露出一些病態(tài)，外觀是男性，但睪丸小，陰莖可有一定程度的發(fā)育，但也較正常人小，多數患者陰莖能勃起，也可射精，但精液中無精子或精子量極少，因故稱無精癥，大多數患者不能自然生育。通過輔助生殖技術，胞漿內單精子顯微注射技術(ICSI)，可能使少部分克氏綜合征患者生產自己的后代[7]。如果精液中有精子，大部分都是正常染色體的精子；如果患者射出精液中無精子，這其中也有少部分患者能從睪丸活檢得到所需要的精子或精子細胞。迄今有文獻報道487例采用父親精子行ICSI助孕，200例患者獲得妊娠，其中4例流產，2例產前診斷發(fā)現胎兒染色體為47,XXY，行減胎手術。194個嬰兒出生，核型均正常。本文中有3例47，XXY的無精癥患者穿刺見到成熟活精子，3例穿刺未見精子，4例患者拒絕睪丸/附睪穿刺。本實驗室同時為穿刺取出的精子做FISH檢測，均見到正常染色體的精子，遂行ICSI治療，其中2例妊娠，妊娠中期行羊水穿刺查胎兒染色體均正常，分娩2個健康活嬰。

Y染色體微缺失是導致生精障礙的重要因素。此類患者大都不育，但可通過ICSI技術生育后代。研究表明Y染色體微缺失發(fā)生的AZF區(qū)域不同，相應的臨床表型也有所不同，因此AZF缺失位點檢測可為男性不育癥臨床診治方案的選擇提供依據。AZFa區(qū)缺失患者比較罕見，約占Y染色體微缺失的1%～5%，臨床表現為唯支持細胞綜合征(SCOS)，幾乎不可能通過睪丸穿刺得到精子[8]。AZFb缺失的患者約占Y染色體微缺失的3%～5%，表現為精子成熟障礙，也不能通過外科技術取到成熟精子。AZFc缺失是較常見的缺失類型，約占60%以上[9]，該類患者生精表型變異比較大，從無精癥、嚴重少精、少弱精以及正常精子都有可能。在AZFc缺失的無精癥患者中50%以上的患者可通過附睪穿刺獲得精子。AZFa、AZFb和AZFc三個區(qū)全部缺失患者，主要見于異常核型患者，如46,XX或iso(Y)男性患者，因此100%表現為無精子癥[10]。AZFb和AZFc完全缺失患者表現為唯支持細胞綜合征或生精障礙導致的無精癥，也不能進行經睪丸或附睪穿刺取得精子。這些區(qū)域的微缺失或聯合缺失均會影響男性胚細胞發(fā)育和維持，影響精子的產生。在生育方面，前文提到AZFa、AZFb缺失者活檢到精子可能性很小，因此可以通過供精人工授精(AID)或供精體外受精(IVF-D)技術來獲得妊娠，獲得下一代。而AZFc缺失者75%可以檢到成熟精子，可以用丈夫精子行ICSI獲得妊娠。但有研究表明Y染色體微缺失患者子代的生育力比父代更差。且ICSI子代可出現Y染色體微缺失的垂直遺傳、擴大和新生缺失。因此，Y染色體微缺失患者男性后代生精障礙的嚴重程度不可預知。所以，對嚴重少精和無精的男性不育患者，應常規(guī)行Y染色體微缺失檢測，并在其行ICSI治療前充分告知其男性后代可能發(fā)生的基因和睪丸表型異常。本研究中檢測到Y染色體微缺失的類型大多為AZFc，有10例，另外有AZFb、AZFd、AZFc+d各1例，其中7例AZFc缺失的無精子患者中，有3例穿刺見成熟精子，與報道相符。

綜上所述，無精子癥、重度少弱精子癥與染色體核型高度相關，與Y染色體微缺失也密切相關，另外，由于Y染色體是單倍體，會垂直遺傳給下一代男性，所以為了避免將這種微缺失遺傳給男性子代，避免原發(fā)性無精子癥患者做無必要穿刺，對于男性不育癥患者在提供輔助生殖技術之前進行染色體核型分析、Y染色體微缺失檢查，是非常有意義的。

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Clinical signification of chromosomal anomalies and Y chromosomal microdeletions in male infertility

QIU Juan1, LI Yan2, LIU Lu2, LIU Qun1, SHAO Xiao-guang1

(1.ReproductiveandGeneticMedicalCenter，DalianMunicipalWomenandChildren'sMedicalCenter，Dalian116037，China；2.DepartmentofAnatomy，DalianMedicalofUniversity，Dalian116044，China)

[Abstract]Objective To assess the relevant relationship and clinical significance of Y chromosomal microdeletions and chromosomal anomalies in male infertility. Methods 90 cases of azoospermia, 62 cases of severe oligozoospermia and 50 normal fertile men in our reproductive center were recruited. Karyotype analysis was performed in peripheral blood lymphocytes using standard G-banding on all cases. Y chromosome AZF microdeletions were detected using multiplex PCR on 56 cases of azoospermia, 42 cases of severe oligozoospermia and 30 normal control. Results Chromosomal anomalies were identified in 16 of 90 azoospermia patients (17.8%). All abnormalities were on sex chromosomes. Chromosomal anomalies were identified in 9 of 62 oligozoospermia patients (14.5%), including sex chromosomal abnormalities in 6 patients (9.7%) and euchromosomal abnormalities in 3 patients (4.8%). The chromosome abnormal rates in both azoospermia and severe oligozoospermia groups were significant higher than that in the healthy men (P<0.01). AZF microdeletions were identified in 9 azoospermia patients and 4 severe oligozoospermia patients. The microdeletion sites were AZFb 1 case, AZFc 10 cases, AZFd 1 case, and AZFc+d 1 case. No such deletions were observed among the 30 normal fertile men in the contral group. Conclusion Chromosomal anomalies and Y chromosome microdeletions are major causes for male infertility. Chromosomal analysis will provide scientific indications for diagnosis and treatment of male infertility.

[Key words]infertile men; azoospermia; severe oligozoospermia; chromosomal anomaly; Y chromosome microdeletion

doi:論著10.11724/jdmu.2016.01.12

作者簡介:裘 娟(1982-)，女，遼寧大連人，主管技師。E-mail：21632277@qq.com 通信作者:邵小光，主任醫(yī)師。E-mail：shaoxiaoguang03@sina.com

[中圖分類號]R615

[文獻標志碼]A

文章編號：1671-7295(2016)01-0048-04

(收稿日期:2015-10-29；修回日期：2015-12-24)