植物細胞懸浮培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物積累的研究進展

陳月華，朱 艷，張 翔，秦民堅*

(中國藥科大學(xué)1. 中藥資源學(xué)教研室; 2.天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

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植物細胞懸浮培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物積累的研究進展

陳月華1,2，朱 艷1.2*，張 翔1,2，秦民堅1,2*

(中國藥科大學(xué)1. 中藥資源學(xué)教研室; 2.天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京210009)

摘要我國是植物資源最豐富的國家之一。植物的活性成分主要為其次生代謝產(chǎn)物，并大多依賴于天然植物資源中直接提取獲得。但由于自然環(huán)境的破壞、植物資源的過度開發(fā)及其栽培困難等原因，許多天然植物資源正在以驚人的速度消失。為了既能滿足社會對植物次生代謝物的需求，又能合理開發(fā)利用自然植物資源和保護生態(tài)環(huán)境，懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)為生產(chǎn)藥用植物活性成分提供了一條全新途徑。但受目的產(chǎn)物含量低的限制，能用懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的天然活性物質(zhì)種類也十分有限。因此，進一步研究植物懸浮細胞培養(yǎng)合成活性成分的高產(chǎn)調(diào)控技術(shù)具有重要的意義。本文綜述了近年來國內(nèi)外應(yīng)用懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物及調(diào)控因素研究進展。

關(guān)鍵詞懸浮細胞；次生代謝；誘導(dǎo)子；基因工程；調(diào)控

次生代謝產(chǎn)物是植物在長期進化過程中與環(huán)境相互作用建立防御機制的結(jié)果。植物次生代謝產(chǎn)物種類繁多，如酚類、黃酮類、生物堿、香豆素、木質(zhì)素、糖苷、萜類、甾類、皂苷、有機酸等，這些天然產(chǎn)物在社會生產(chǎn)和生活中占有重要的位置，被加工成藥品、香料、食品添加劑、化妝品、農(nóng)藥、染料等。次生代謝產(chǎn)物大多依賴于天然植物資源中直接提取獲得，但由于生態(tài)環(huán)境的破壞、長期無計劃的砍伐、栽培困難等原因，許多天然藥用植物資源正在以驚人的速度消失。自從1956年，Routine和Nickel首次成功運用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)目的次生代謝產(chǎn)物以來，吸引了眾多國內(nèi)外研究。在中藥現(xiàn)代化飛速發(fā)展的時代，用細胞培養(yǎng)技術(shù)進行藥用植物有效成分的生產(chǎn)取得了很大進展。據(jù)不完全統(tǒng)計應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)研究過的藥用植物超過400 種，分離到的次生代謝物 600 種以上， 其中 60 多種藥用植物次生代謝物含量超過或等于原植物的含量[1]。許多重要的藥用植物如人參、紫草、長春花、黃連等細胞培養(yǎng)十分成功，少數(shù)基本實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。但真正實現(xiàn)植物次生代謝物大規(guī)模生產(chǎn)仍有許多問題亟待解決，本文就植物懸浮細胞培養(yǎng)中生產(chǎn)次生代謝物的重要影響因素及調(diào)控若干重要問題進行探討，以期推動我國植物懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和為研究次生代謝物調(diào)控過程及機制提供技術(shù)手段。

1植物高產(chǎn)細胞系的篩選

在植物細胞懸浮培養(yǎng)體系中，細胞形態(tài)分化受到抑制或者染色體發(fā)生變異等都會導(dǎo)致次生代謝物產(chǎn)量的降低[2]，因此選擇生長性狀穩(wěn)定、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物能力強的細胞系是細胞培養(yǎng)的基本環(huán)節(jié)。高產(chǎn)細胞系篩選的過程如圖1所示，獲得高產(chǎn)細胞系從選擇富含目的產(chǎn)物的植物品種開始。Ramesha等[3]人研究喜樹堿高產(chǎn)植株系時發(fā)現(xiàn)不同品種的植株，即喜樹、洛氏喜樹、云南喜樹和青脆枝，其中有效活性成分喜樹堿的含量(0.03%～0.4%)差異甚大；同時也注意到在青脆枝的不同部位內(nèi)的喜樹堿的積累也不同，葉、莖皮和根皮含有喜樹堿的量也依次遞增。高產(chǎn)植株篩選后通過愈傷組織的誘導(dǎo)，從中再篩選出富含目的產(chǎn)物的細胞系做種子細胞培養(yǎng)。因此，選育高產(chǎn)細胞系，選擇合適的物種和特定部位也是必不可少的。

篩選高產(chǎn)細胞系是解決植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物產(chǎn)量低的有效的手段之一。常用的方法有目視法、放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、流動細胞測定儀、高效液相色譜法 (HPLC)等。過去的幾十年主要采用目視法，由于色素的變異通常在愈傷組織和懸浮細胞中就表現(xiàn)出來，因而目視法對含色素的細胞系篩選具有通用性，如花青素、萘醌、類胡蘿卜素和葉綠素等，但比較粗放。RIA方法被認為是最靈敏和最精確的，但由于儀器貴、合成放射性標(biāo)記抗原困難、安全性差等原因，應(yīng)用較少。ELISA測定方便、靈敏，在大規(guī)模篩選中前景廣闊。流動細胞測定法局限于被測定細胞中次生代謝產(chǎn)物在激光處理后能發(fā)出熒光的一類化合物[4]。目前篩選高產(chǎn)細胞系常用的是色譜、光譜定量分析，如紫外-可見分光光度法(UV-VIS)、HPLC和核磁共振等分析技術(shù)在細胞培養(yǎng)的狀態(tài)下就能提供細胞的定性定量信息。Pasqua等[5]運用TLC和UV-HPLC方法成功篩選出貫葉連翹懸浮細胞中的高產(chǎn)細胞系。邵利[6]建立何首烏懸浮細胞系后通過HPLC-MS檢測不同細胞團的二苯乙烯苷，最終獲得高含量二苯乙烯苷的細胞系，比原細胞系提高了29.59%。

圖1 高產(chǎn)細胞系篩選的過程

2培養(yǎng)基的組分對次生代謝產(chǎn)物的影響

培養(yǎng)基的組成是細胞生長和次生代謝物的產(chǎn)生過程中最直接、最重要的影響因素。培養(yǎng)基中碳源、氮源、生長調(diào)節(jié)劑以及其他有機添加物不僅是植物細胞生長以及營養(yǎng)物質(zhì)合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，而且很多都能促進次生代謝產(chǎn)物的積累。

碳源作為細胞的主要能量來源，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境的滲透壓，最近研究[7]認為糖還可以作為信號分子影響懸浮細胞的生長代謝。最常用的碳源雖是蔗糖，但其它碳源對生長和次生代謝產(chǎn)物積累方面也有著重要的影響。研究碳源對迷迭香懸浮細胞系迷迭香酸積累的影響中發(fā)現(xiàn)，30g·L-1蔗糖處理的懸浮培養(yǎng)細胞迷迭香酸含量高出 70g·L-1麥芽糖處理的228倍，但還是略低于40g·L-1葡萄糖處理[8]?？梢姂腋〖毎麑τ诓煌荚吹姆磻?yīng)是不一樣的。在懸浮細胞培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基MS、LS、B5均含有硝酸鹽和銨鹽作為氮源，它們分別提供硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，兩者相對比例對次生代謝產(chǎn)物的積累帶來顯著影響。Sivakumar等[9]研究得到銨態(tài)氮的比例較小時更有利于人參皂苷的合成。如上所述，細胞的次生代謝物合成與碳源及氮源有關(guān)，要得到較高的次生代謝產(chǎn)物積累量，碳源和氮源的組成和濃度都是要考慮的重要影響因素。

在植物懸浮細胞培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度是影響次生代謝產(chǎn)物積累的關(guān)鍵因子。阮氏釧等[10]通過控制基本培養(yǎng)基的種類和激素配方，初步篩選出有利于青錢柳懸浮細胞總黃酮積累的MS基本培養(yǎng)基，同時還得出1.0mg·L-1NAA+ 0.5mg·L-1KT利于青錢柳懸浮細胞總黃酮的積累；1.0mg·L-1IBA+ 0.5mg·L-1TDZ利于青錢柳懸浮細胞多糖的積累；0.5mg·L-12,4 -D+ 0.3mg·L-1NAA利于青錢柳懸浮細胞的總?cè)品e累。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和質(zhì)量濃度對細胞的生長、分化以及次生代謝產(chǎn)物的合成都會產(chǎn)生重要影響，應(yīng)根據(jù)植物的品種和目的次生代謝產(chǎn)物的類型，添加適宜的激素種類和濃度來提高細胞次生代謝物產(chǎn)量。

3培養(yǎng)條件對次生代謝產(chǎn)物的影響

對于植物懸浮細胞培養(yǎng)來說，環(huán)境中的許多物理因素對細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的累積具有很大的影響。如溫度、光照、pH值、通氣狀況、接種密度等，能有效地調(diào)控這些外界因子是植物細胞生長及次生代謝產(chǎn)物積累的必要條件。

溫度既影響植物細胞分裂速度，也影響次生代謝途徑中酶的活性。對于植物細胞懸浮培養(yǎng)，最適溫度通常為( 25 ± 2) ℃。Hoopen等[11]曾對長春花細胞培養(yǎng)過程分別進行溫度的階段性調(diào)控，結(jié)果很大程度上提高了產(chǎn)物的產(chǎn)率。值得注意的是，不同植物的最適溫度不同，且植物細胞生長和次生代謝產(chǎn)物的合成所需的溫度很多時候并不一致，因此選擇合理的培養(yǎng)溫度并進行相應(yīng)的調(diào)控對于細胞生長以及產(chǎn)物合成十分關(guān)鍵。

光是影響植物生理功能的重要環(huán)境因子，還是參與調(diào)控植物的生長發(fā)育的重要信號來源。不同光質(zhì)刺激植物生長發(fā)育的效應(yīng)不一樣。植物在長期進化中形成了多種光感受系統(tǒng)，用于感知周圍環(huán)境的光強、光質(zhì)和光周期，并對其變化做出響應(yīng)。Chan等[12]研究光強對多花野牡丹細胞培養(yǎng)中花青素累積的影響，結(jié)果顯示中等強度的白光(300～600lx)顯著提高花青素的產(chǎn)量，而黑暗條件下花青素產(chǎn)量最低；張進杰等[13]研究了不同光質(zhì)、光強和光期對懸浮培養(yǎng)黃芩細胞的生長及黃芩苷含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白光、紫外光和藍光對黃芩苷的積累具有誘導(dǎo)促進作用，其中紫外光的促進作用最強，而紅光照射對黃芩苷的積累有一定的抑制作用。每天 8h光照強度為 60μmol·m-2·s-1的紫外光、16h光照強度為 50μmol·m-2·s-1的紅光交替處理，在培養(yǎng) 12 天后，細胞的鮮重和黃芩苷含量為黑暗的 1.16 和 3.2 倍。Tassoni等[14]也發(fā)現(xiàn)紅光照射會降低葡萄細胞懸浮液中花青素的積累。這些結(jié)果說明次生代謝產(chǎn)物的積累受不同光強、光質(zhì)和光周期的調(diào)控。

培養(yǎng)基的酸堿度對次生代謝物的分泌很重要，植物的細胞培養(yǎng)都要求一定的pH值，通常高壓滅菌前都在5.6～6.0。不同pH值對不同植物細胞的影響會有差異。如降低培養(yǎng)基的pH值，可有效提高高山紅景天懸浮細胞中紅景天苷的釋放[15]；而Malik等[16]研究卻發(fā)現(xiàn)較高的pH對新疆紫草懸浮細胞生長及紫草寧衍生物合成有促進作用。pH調(diào)控與溫度相同，需要在不同的階段控制不同的值。

通氣狀況是在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中至關(guān)重要，主要有3個作用，即提供細胞所需氧氣、解吸揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，清除代謝熱[17]。Thanh等[18]研究氧氣供應(yīng)對人參細胞培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)40%的溶氧量利于細胞生物量和人參皂苷的累積。Han等[19]研究了氧分壓對三七細胞生長以及人參皂苷和多糖合成的影響，發(fā)現(xiàn)高的氧分壓抑制細胞生長，同時也不利于次生代謝物的合成。合適的供氧量能顯著影響植物懸浮細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累。

植物懸浮培養(yǎng)細胞生長的啟動需要有一個最低的起始密度，細胞密度太低，細胞生長緩慢還浪費空間資源；細胞密度過高，細胞生長速度過快，競爭養(yǎng)分激烈，致使一部分細胞褐變，不利于次生代謝產(chǎn)物的合成。李鐵軍等[20]研究初始接種量對人參細胞皂苷合成的影響時發(fā)現(xiàn)接種量在6g時人參皂苷含量最高，高于或低于6g時不利于人參皂苷含量的提高。

植物細胞懸浮培養(yǎng)中，許多理化因子都可能對細胞的生長及次生代謝物累積產(chǎn)生影響和調(diào)控，如搖床轉(zhuǎn)速、細胞生長繼代周期、細胞的分散程度、滲透壓及有機添加物等。因此，針對特定的植物細胞需要通過系統(tǒng)的實驗探討各因素與細胞生長及次生代謝產(chǎn)物積累之間的關(guān)系，以便篩選出最適宜的培養(yǎng)條件。

4植物懸浮細胞兩相系統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)

植物細胞兩相培養(yǎng)是指在植物細胞懸浮培養(yǎng)中，加入萃取次生代謝產(chǎn)物的有機化合物(與培養(yǎng)液不溶的液體)或多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成有機相與水相兩相，也就是說細胞外創(chuàng)造一個儲藏次生代謝產(chǎn)物單元。從而打破原有產(chǎn)物在細胞內(nèi)、外水相的平衡，可很大程度提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。采用兩相培養(yǎng)技術(shù)可以減少次生代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用，保護次生代謝產(chǎn)物免受酶的分解，簡化下游加工處理過程降低生產(chǎn)成本，除去培養(yǎng)基中的非目的有害次生代謝產(chǎn)物[21]。建立和利用兩相培養(yǎng)技術(shù)的關(guān)鍵是選擇滿足要求的萃取劑或吸附劑，即對植物細胞無毒害作用、對產(chǎn)物有較大的分配系數(shù)、所加有機相與培養(yǎng)水相易分離、高度的吸收或吸附選擇性。所加的吸附劑主要是離子交換樹脂XAD-7[23-26]和XAD-4[27-28]，所加的萃取劑主要是十六烷[29]，目前國內(nèi)植物懸浮細胞兩相培養(yǎng)的研究報道非常少(表1)，具有很好的研究前景。

5前體或誘導(dǎo)子對次生代謝產(chǎn)物合成積累的調(diào)控

5.1前體飼喂

在植物懸浮細胞中，前體物可作為底物或催化代謝途徑中關(guān)鍵酶而發(fā)揮作用來提高次生代謝物產(chǎn)量。因此，前體飼喂也是調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物合成和積累的重要調(diào)控因子。不同類型次生代謝物的代謝

途徑不同，應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物飼喂前體物。所加入的前體物要根據(jù)次生代謝產(chǎn)物的合成途徑確定，要求對細胞生長無明顯抑制作用，又要促進目的產(chǎn)物的合成。值得注意的是植物代謝途徑是個連續(xù)的過程，次生代謝物的合成也就存在時間和空間上的變化，前體物的飼喂也必將存在一個最適時間和最適飼喂量的問題，在具體的實驗中應(yīng)重視最適時間和最佳濃度的確定。通常前體在培養(yǎng)初始時飼喂，并且添加的濃度與接種細胞的量有關(guān)[22]。近年來，愈來愈多的研究證明最適時間和濃度下對懸浮細胞飼喂前體來提高目的產(chǎn)物量是非常有效的。應(yīng)用較多的前體物主要有苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸等參與黃酮的合成。具體研究見表2。

表1　植物懸浮細胞兩相培養(yǎng)實例

表2　前體飼喂對植物次生代謝物生物合成與積累的影響

5.2誘導(dǎo)子添加

植物次生代謝產(chǎn)物的合成具有全能性和多條代謝途徑，凡能引起植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的脅迫因子統(tǒng)稱為誘導(dǎo)子，是一類特殊的觸發(fā)因子，它能夠開啟合成次生代謝產(chǎn)物過程中關(guān)鍵酶的活性，并刺激表達，提高次生代謝產(chǎn)物的含量。根據(jù)來源誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子兩類。生物誘導(dǎo)子主要是來自真菌的誘導(dǎo)子，包括真菌菌體、菌絲、菌液提取物和菌液濃縮物等。非生物誘導(dǎo)子是指理化因素如水楊酸(salicylicacid,SA)、茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MJ)、滲透劑、紫外線、高溫、低溫、重金屬、鹽脅迫等[36]。現(xiàn)有的單一的生物誘導(dǎo)子或非生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)的方法，存在作用弱、產(chǎn)量較低等缺點，而聯(lián)合使用可以對蒽醌類、生物堿類、黃酮類和萜類等次生代謝物的誘導(dǎo)作用增強，為通過植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝活性成分提供了有益的途徑[37]。目前利用誘導(dǎo)子調(diào)控植物次生代謝物的合成與積累方面已成為國內(nèi)外的研究熱點，并取得了較多成果。近十年國內(nèi)外研究進展具體實例見表3、表4。

表3　生物誘導(dǎo)子對植物次生代謝物積累的影響

表4　非生物誘導(dǎo)子對植物次生代謝物積累的影響

6植物懸浮細胞生物轉(zhuǎn)化技術(shù)

生物轉(zhuǎn)化(biotransformation)是指以外源性的有機化合物為底物，添加微生物細胞或酶，在適宜的條件下培養(yǎng)，對外源性底物進行結(jié)構(gòu)修飾，從而獲得目的產(chǎn)物。該技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、低毒、低污染、后處理簡單等優(yōu)點，更重要的是，重現(xiàn)性好、細胞增殖快、次生代謝物產(chǎn)量大[54]。因此，生物轉(zhuǎn)化在懸浮細胞培養(yǎng)體系中已成為獲取次生代謝活性產(chǎn)物的重要途徑。目前已知植物懸浮培養(yǎng)體系的生物轉(zhuǎn)化具有諸如羥基化、氧化還原反應(yīng)、糖基化和水解等多種反應(yīng)類型，其中羥基化是主要反應(yīng)類型。雖然植物細胞培養(yǎng)擁有生產(chǎn)高產(chǎn)量特定次生代謝物的巨大潛能，但由于自身代謝的原因，目的產(chǎn)物的積累有時就滿足不了人們的需求。然而，懸浮細胞可利用植物細胞的酶系統(tǒng)對外源底物進行修飾生產(chǎn)有意義的化合物。有研究[55]利用人參懸浮細胞培養(yǎng)對芍藥醇進行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)得到具有清除自由基活性的人參皂苷。Li等[56]以楊桃懸浮培養(yǎng)細胞為體系進行生物轉(zhuǎn)化研究，選擇二氫去氧青蒿素B為底物，發(fā)生兩個羥基化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為7α-羥基二氫去氧青蒿素B和 3α-羥基二氫去氧青蒿素B，其中 7α-羥基二氫去氧青蒿素B為新化合物。兩個產(chǎn)物對腫瘤細胞系K562 和HeLa均有較好的抑制作用。

由于懸浮細胞培養(yǎng)受環(huán)境因子制約，易被污染，特別是體細胞克隆容易變異導(dǎo)致生物轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定，從而限制了部分植物懸浮細胞體系的生物轉(zhuǎn)化在工業(yè)生產(chǎn)上的大規(guī)模應(yīng)用。因此，今后應(yīng)繼續(xù)研究較為重要的培養(yǎng)體系中酶系統(tǒng)種類以及外源底物本身的結(jié)構(gòu)特點外，也需優(yōu)化投入底物的時間、底物濃度、共培養(yǎng)時間、基本的細胞培養(yǎng)環(huán)境，并結(jié)合基因重組技術(shù)，發(fā)揮生物轉(zhuǎn)化的優(yōu)勢，相信生物轉(zhuǎn)化研究將在有效活性成分合成和結(jié)構(gòu)修飾中繼續(xù)發(fā)揮重要作用。

7植物次生代謝相關(guān)功能基因的研究

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因調(diào)控越來越多地被引入植物細胞培養(yǎng)。從分子水平上研究有關(guān)次生代謝物生物合成的機理并從基因水平上對其生物合成進行調(diào)控，可有效的增加次生代謝物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達量，增加懸浮細胞次生代謝物的累積，篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的細胞系，從而徹底解決植物懸浮細胞培養(yǎng)次生代謝物產(chǎn)量低、不穩(wěn)定的問題。目前，在次生代謝產(chǎn)物合成途徑中涉及的相關(guān)功能基因的克隆和調(diào)控是研究的重點。

黃酮類化合物具有很好的抗氧化活性，研究者把目光主要聚焦到調(diào)控這類次生代謝物的生物合成途徑上。已研究得到通過植物代謝生物合成途徑中的基因過表達來實現(xiàn)花色的調(diào)控，還有黃酮合成途徑中的査耳酮合酶過表達可顯著提高黃酮類化合物的產(chǎn)量。劉飛等[57]建立了紅花的懸浮細胞培養(yǎng)體系，并利用該體系研究黃酮類化合物的生物合成；克隆得到紅花黃酮類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基，添加50μmol/L的MJ到懸浮細胞體系中對CtCHI3626 基因的表達量進行測量。結(jié)果顯示，MJ能有效提高編碼查爾酮異構(gòu)酶基因 CtCHI3626的表達量。并對紅花進行遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得了轉(zhuǎn) CHI 的紅花轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)CHI的轉(zhuǎn)入，促進了紅花中黃酮類化合物產(chǎn)量的顯著增加。目前，功能基因克隆黃酮類合成酶、酚類合成酶等基因的克隆相對較多，如紫杉醇、長春花堿、紫草寧、青蒿素以及嗎啡等多種次生代謝產(chǎn)物緊密相關(guān)的合成關(guān)鍵酶基因。

8總結(jié)與展望

在植物細胞懸浮培養(yǎng)中調(diào)控培養(yǎng)基的組分、植物生長調(diào)節(jié)劑水平、碳源與氮源的水平、酸堿度、光質(zhì)、光強、誘導(dǎo)子與前體種類與濃度等等來提高次生代謝物的積累已經(jīng)取得了不錯的進展，然而只有人參、紫草、黃連等少數(shù)幾種植物的懸浮細胞培養(yǎng)達到了商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。主要原因是一些植物目的次生代謝產(chǎn)物含量低，后提取困難，缺乏經(jīng)濟的可行性；植物的代謝機制復(fù)雜，很多有效成分的次生代謝物的生物合成途徑不明，難以從根本上解決問題，這就需要借助于生物轉(zhuǎn)化技術(shù)以及基因工程技術(shù)等。今后，應(yīng)該在建立與完善高產(chǎn)細胞系篩選的基礎(chǔ)上，從分子水平上研究有關(guān)次生代謝物生物合成的機理并從基因水平上對其生物合成進行調(diào)控：通過導(dǎo)入有效次生代謝物生物合成途徑中單個或多個關(guān)鍵酶基因，使宿主細胞中該酶的催化活性提高，從而催化更多的前體物質(zhì)合成下游目標(biāo)次生代謝產(chǎn)物；運用基因沉默(反義RNA、RNAi) 技術(shù)抑制競爭性代謝途徑，使更多的前體物質(zhì)流向目的產(chǎn)物的通路；也可以在生物合成途徑中增加新基因調(diào)節(jié)次生代謝[58]。伴隨著生物轉(zhuǎn)化技術(shù)以及基因工程技術(shù)研究的深入，我們有理由相信更多植物懸浮細胞培養(yǎng)實現(xiàn)工業(yè)化和產(chǎn)業(yè)化，以滿足社會發(fā)展對次生代謝產(chǎn)物的需求。

參考文獻：

[1]王娟, 高文遠, 尹雙雙, 等. 藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2012, 37(24): 3683-3685.

[2]李燕, 王春蘭, 郭順星, 等. 植物組織和細胞培養(yǎng)物中黃酮類物質(zhì)積累影響因素的研究進展[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(9): 651-655.

[3]RAMESHABT,AMNAT,RAVIKANTHG,etal.ProspectingforcamptothecinesfromNothapodytes nimmonianaintheWesternGhats,SouthIndia:identificationofhigh-yieldingsourcesofcamptothecinandnewfamiliesofcamptothecines[J].JournalofChromatographicScience, 2008, 46(4): 362-368.

[4]郭肖紅, 高文遠, 陳海霞, 等. 藥用植物培養(yǎng)高產(chǎn)細胞系的選育[J]. 世界科學(xué)技術(shù): 中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2005, 7(1): 60-66.

[5]PASQUAG,AVATOP,MONACELLIB,etal.Metabolitesincellsuspensioncultures,calli,andinvitroregeneratedorgansofHypericum perforatumcv.Topas[J].PlantScience, 2003, 165(5): 977-982.

[6]邵利. 何首烏懸浮細胞系的建立和穩(wěn)定同位素示蹤研究二苯乙烯苷合成路徑[D]. 廣州:華南理工大學(xué), 2012.

[7]PRAVEENN,MURTHYHN.SynthesisofwithanolideAdependsoncarbonsourceandmediumpHinhairyrootculturesofWithania somnifera[J].IndustrialCropsandProducts, 2012, 35(1): 241-243.

[8]曲丹, 王慧梅, 任潔. 碳源對迷迭香懸浮培養(yǎng)細胞的生長, 迷迭香酸積累及抗氧化酶活性的影響[J]. 植物研究, 2015, 35(4): 623-627.

[9]SIVAKUMARG,YUKW,PAEKKY.ProductionofbiomassandginsenosidesfromadventitiousrootsofPanax ginsenginbioreactorcultures[J].EngineeringinLifeSciences, 2005, 5(4): 333-342.

[10]阮氏釧, 楊萬霞, 方升佐, 等. 培養(yǎng)基種類及激素配方對青錢柳懸浮細胞次生代謝物質(zhì)積累的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版), 2015(2): 8.

[11]TENHOOPENHJG,VINKEJL,MORENOPRH,etal.InfluenceoftemperatureongrowthandajmalicineproductionbyCatharantus roseussuspensioncultures[J].EnzymeandMicrobialTechnology, 2002, 30(1): 56-65.

[12]CHANLK,KOAYSS,BOEYPL,etal.EffectsofabioticstressonbiomassandanthocyaninproductionincellculturesofMelastoma malabathricum[J].BiologicalResearch, 2010, 43(1): 127-135.

[13]張進杰, 徐茂軍, 周桂飛. 光質(zhì)對懸浮培養(yǎng)黃岑細胞生長及黃芩苷積累的影響[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報 2007,5(2): 135-140.

[14]TASSONIA,DURANTEL,FERRIM.Combinedelicitationofmethyl-jasmonateandredlightonstilbeneandanthocyaninbiosynthesis[J].JournalofPlantPhysiology, 2012, 169(8): 775-781.

[15]許建峰, 劉傳斌. 高山紅景天細胞懸浮培養(yǎng)中pH值對紅景天苷胞外釋放及細胞活性[J]. 植物學(xué)報(英文版), 1997, 39(11): 1022-1029.

[16]MALIKS,BHUSHANS,SHARMAM,etal.Physico‐chemicalfactorsinfluencingtheshikoninderivativesproductionincellsuspensionculturesofArnebia euchroma (Royle)Johnston,amedicinallyimportantplantspecies[J].CellBiologyInternational, 2011, 35(2): 153-158.

[17]GEORGIEVMI,WEBERJ,MACIUKA.Bioprocessingofplantcellculturesformassproductionoftargetedcompounds[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2009, 83(5): 809-823.

[18]THANHNT,MURTHYHN,YUKW,etal.EffectofoxygensupplyoncellgrowthandsaponinproductioninbioreactorculturesofPanax ginseng[J].JournalofPlantPhysiology, 2006, 163(12): 1337-1341.

[19]HANJ,ZHONGJJ.EffectsofoxygenpartialpressureoncellgrowthandginsenosideandpolysaccharideproductioninhighdensitycellculturesofPanax notoginseng[J].EnzymeandMicrobialTechnology, 2003, 32(3): 498-503.

[20]李鐵軍, 廉美蘭, 于丹, 等. 幾種因素對懸浮培養(yǎng)人參細胞生長和皂苷積累的影響[J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(23): 66-70.

[21]KIMJH,KANGIS,CHOIHK,etal.Anovelprepurificationforpaclitaxelfromplantcellcultures[J].ProcessBiochemistry, 2002, 37(7): 679-682.

[22]谷榮輝, 洪利亞, 龍春林. 植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的途徑[J]. 植物生理學(xué)報, 2013, 49(9): 869-881.

[23]KLVANAM,LEGROSR,JOLICOEURM.InsituextractionstrategyaffectsbenzophenanthridinealkaloidproductionfluxesinsuspensionculturesofEschscholtzia californica[J].BiotechnologyandBioengineering, 2005, 89(3): 280-289.

[24]CHAKRABORTYA,CHATTOPADHYAYS.StimulationofmentholproductioninMentha piperitacellculture[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant, 2008, 44(6): 518-524.

[25]KOMARAIAHP,RAMAKRISHNASV,REDDANNAP,etal.EnhancedproductionofplumbagininimmobilizedcellsofPlumbago roseabyelicitationandinsituadsorption[J].JournalofBiotechnology, 2003, 101(2): 181-187.

[26]GAOMB,ZHANGW,RUANC.SignificantlyimprovedtaxuyunnanineCproductionincellsuspensionculturesofTaxus chinensisbyprocessintensificationofrepeatedelicitation,sucrosefeeding,andinsituadsorption[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2011, 27(10): 2271-2279.

[27]PAVLOVA,ILIEVAM,MINCHEVAM.ReleaseofrosmarinicacidbyLavandula veraMMcellsuspensionintwo-phaseculturesystems[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2001, 17(4): 417-421.

[28]CHIANGL,ABDULLAHMA.Enhancedanthraquinonesproductionfromadsorbent-treatedMorinda ellipticacellsuspensionculturesinproductionmediumstrategy[J].ProcessBiochemistry, 2007, 42(5): 757-763.

[29]PRAKASHG,SRIVASTAVAAK.IntegratedyieldandproductivityenhancementstrategyforbiotechnologicalproductionofazadirachtinbysuspensioncultureofAzadirachta indica[J].Asia‐PacificJournalofChemicalEngineering, 2011, 6(1): 129-137.

[30]高麗華, 胡顯文, 胥照平, 等. 喂飼前體提高懸浮培養(yǎng)水母雪蓮細胞的黃酮產(chǎn)量[J]. 高技術(shù)通訊, 2007, 17(4):418-423.

[31]楊英, 何峰, 季家興, 等. 四種前體對脹果甘草細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2007, 25(5): 484-489.

[32]胡燕梅, 韓曉紅, 周全. 銀杏液體懸浮細胞培養(yǎng)產(chǎn)生黃酮的研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 33(2): 360-363.

[33]MASOUMIANM,ARBAKARIYAA,SYAHIDAA,etal.EffectofprecursorsonflavonoidproductionbyHydrocotyle bonariensiscallustissues[J].AfricanJournalofBiotechnology, 2013, 10(32): 6021-6029.

[34]INDUS,VIJAYAL,MEETAB,etal.ProductionofflavonoidsincalluscultureofAnthocephalus indicusA.Rich[J].AsianJournalofPlantSciences, 2013, 12(1): 40-45.

[35]GUOS,MANS,GAOW,etal.ProductionofflavonoidsandpolysaccharidebyaddingelicitorindifferentcellularcultivationprocessesofGlycyrrhiza uralensisFisch.[J].ActaPhysiologiaePlantarum, 2013, 35(3): 679-686.

[36]張瑞芬, 李培琴, 周立剛. 真菌誘導(dǎo)子對植物培養(yǎng)物生長和次生代謝產(chǎn)物合成影響之研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2008, 9.

[37]葉龍飛, 王金海, 張景紅. 聯(lián)合誘導(dǎo)子提高藥用植物代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究進展[J]. 廣東化工, 2014, 41(10): 207-208.

[38]ASHTIANISR,HASANLOOT,MOHAMMADRB.UsingyeastextractasanapproachtoincreaseflavonolignanscontentincellsuspensioncultureofMilk Thistleplantviaelicitationmechanism[J].JournalofMedicinalPlants, 2009, 8(32): 108-119, 184.

[39]SILJAPK,GISHAGP,SATHEESHKUMARK.EnhancedplumbaginaccumulationinembryogeniccellsuspensionculturesofPlumbago roseaL.followingelicitation[J].PlantCell,TissueandOrganCulture, 2014, 119(3): 469-477.

[40]GOYALS,RAMAWATKG.IncreasedisoflavonoidsaccumulationincellsuspensionculturesofPueraria tuberosabyelicitors[J].IndianJBiotechnol, 2008, 7: 378-382.

[41]潘學(xué)武, 董妍玲, 石亞亞. 真菌誘導(dǎo)子和抗褐變劑對喜樹懸浮細胞生長及喜樹堿生物合成的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26(20): 21-26.

[42]KOMARAIAHP,AMRUTHARN,KISHORPBK,etal.ElicitorenhancedproductionofplumbagininsuspensionculturesofPlumbago roseaL.[J].EnzymeandMicrobialTechnology, 2002, 31(5): 634-639.

[43]陶金華, 汪冬庚, 濮雪蓮, 等. 一氧化氮和水楊酸依次介導(dǎo)內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子促進蒼術(shù)細胞中蒼術(shù)素生物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J]. 中草藥, 2014, 45(5): 701-708.

[44]劉英甜, 王曉東, 周文洋, 等. 多胺介導(dǎo)真菌誘導(dǎo)子促進白樺三萜積累的初步研究[J]. 中草藥, 2014, 5: 21.

[45]郝崗平, 杜希華, 史仁玖.NO對銀杏懸浮細胞生長及黃酮類物質(zhì)合成的影響[J]. 西北植物學(xué)報, 2007, 27(2): 272-277.

[46]KORSANGRUANGS,SOONTHORNCHAREONNONN,CHINTAPAKORNY,etal.EffectsofabioticandbioticelicitorsongrowthandisoflavonoidaccumulationinPueraria candolleivar. candolleiandP. candolleivar. mirificacellsuspensioncultures[J].PlantCell,TissueandOrganCulture, 2010, 103(3): 333-342.

[47]劉連成, 董娟娥, 張婧一, 等.Ca2+對丹參培養(yǎng)細胞中迷迭香酸合成及其相關(guān)酶活性的影響[J]. 生物工程學(xué)報, 2012, 28(11): 1359-1369.

[48]RUANJ,ZHANGJ,LIM,etal.DependenceofUV-B-inducedcamptothecinproductiononnitratereductase-mediatednitricoxidesignalinginCamptotheca acuminatasuspensioncellcultures[J].PlantCell,TissueandOrganCulture, 2014, 118(2): 269-278.

[49]楊靜, 孫皓. 不同誘導(dǎo)子對黃芪懸浮培養(yǎng)細胞中黃芪多糖積累的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(26): 8954-8956.

[50]JALALPOURZ,SHABANIL,AFGHANIL,etal.StimulatoryeffectofmethyljasmonateandsqualestatinonphenolicmetabolismthroughinductionofLOXactivityincellsuspensioncultureofyew[J].TurkishJournalofBiology, 2014, 38(1): 76-82.

[51]BOTAC,DELIUC.TheeffectofcoppersulphateontheproductionofflavonoidsinDigitalislanatacellcultures[J].Farmacia, 2011, 59(1): 113-118.

[52]PENGX,HEJY.TheinhibitoryeffectofCa2+ontheflavonoidproductionofTetrastigma hemsleyanumsuspensioncellsinducedbymetalelicitors[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant, 2013, 49(5): 550-559.

[53]楊兆春, 袁媛, 陳敏, 等.PEG脅迫對黃芩黃酮類有效成分積累及相關(guān)基因表達的影響[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(16): 2157-2161.

[54]嚴(yán)春艷, 于榮敏. 植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與中藥活性化合物研究[J]. 食品與藥品, 2005, 7(10A): 4-8.

[55]LIW,KOIKEK,ASADAY,etal.BiotransformationofpaeonolbyPanax ginsengrootandcellcultures[J].JournalofMolecularCatalysisB:Enzymatic, 2005, 35(4): 117-121.

[56]LIX,YANGL,YUR,etal.Biotransformationofdihydro-epi-deoxyarteannuinBbysuspension-culturedcellsofAverrhoa carambola[J].AfricanJournalofBiotechnology, 2014, 11(7): 1724-1728.

[57]劉飛. 紅花黃酮類化合物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與功能驗證[D]. 上海:第二軍醫(yī)大學(xué), 2014.

[58]JAWAHARG,MADHAVID,AMRUTHARN,etal.Currentapproachesforenhancingsecondaryplantproductioninvitro[J].AnnalsofPhytomedicine, 2014, 3(2): 26-34.

ResearchProgressinPlantCellSuspensionCultureforProductionofSecondaryMetabolites

ChenYuehua,2,ZhuYan1,2*,ZhangXiang1,2,QinMinjian1,2*

(1.DepartmentofResourcesScienceofTraditionalChineseMedicines; 2.StateKeyLaboratoryofNaturalMedicines,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

AbstractChinaisrichinplantresources.Theactiveconstituentsofplantsaremainlysecondarymetabolites,andmostofthemdependonthedirectextractionfromtheplants.However,becauseofthedestructionofenvironment,theexcessiveexploitationofplantsandthedifficultyofcultivation,manyplantresourcesaredisappearingatanalarmingrate.Inordertomeettheneedsofplantsecondarymetabolitesandavoidoverconsumptionofplantresources,thesuspensioncellculturetechnologyhavearisenandprovidedanewwayfortheproductionofactiveconstituents.Nevertheless,duetothelowproductivityoftargetproductsbythistechnology,thesuccessfulexamplesofproducingactivesubstancesarelimited.Therefore,itishighlyimportanttodevelopnewtechnologyofregulatingplantstoproducemoreactiveconstituents.Inthispaper,wereviewedtheprogressofthesecondarymetabolitesproductionwithsuspensioncellculturetechnologyandtheimportantfactorsofregulatingthesynthesisofsecondarymetabolitesinrecentyears.

Keywordssuspensioncell;secondarymetabolites;elicitors;geneticengineering;regulation

收稿日期：2015-09-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81373918)；國家“十二五”規(guī)劃科技重大專項創(chuàng)新藥物研究(2012ZX09304006)；中央高?？蒲袠I(yè)務(wù)費項目(JKQ2011038)。

作者簡介：陳月華，女，碩士生，研究方向：藥用植物資源與質(zhì)量研究。E-mail:chenyuehua527@126.com *通訊作者：秦民堅，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥資源與開發(fā)。E-mail:minjianqin@163.com; 朱艷，女，博士，研究方向：藥用植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)。E-mail:cpuzy@126.com

中圖分類號：Q943.1;Q946.8

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-9690(2016)03-0041-07

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.03.015