白芨多糖磷酸酯化工藝條件的研究

張 潔，沈 勝，沈淑儀

(上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418)

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白芨多糖磷酸酯化工藝條件的研究

張 潔*，沈 勝，沈淑儀

(上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418)

摘要用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合鹽作為磷?；噭瑢Π总付嗵沁M(jìn)行了磷酸酯化。以取代度為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、磷酸鹽用量和尿素用量進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果表明，混合磷酸鹽法對白芨多糖修飾的最佳反應(yīng)條件是：反應(yīng)溫度70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為7 h，尿素用量為10%，磷酸鹽用量為100%。所得產(chǎn)物中的磷的取代度為0.013 8。

關(guān)鍵詞白芨多糖；磷酸酯化；工藝優(yōu)化

白芨[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]，屬于蘭科白芨屬植物，又稱小白芨、蓮及草、雪如末等。千百年來一直作為傳統(tǒng)中藥，用于治療癰疽腫痛、創(chuàng)傷止血、手足皸裂等癥[1]。白芨中含有豐富的多糖類物質(zhì)。白芨多糖是由β-(1→4)-甘露糖、β-(1→4)-葡萄糖和α-(1→6)葡萄糖殘基組成的中性雜多糖[2]。研究結(jié)果證明，白芨多糖不僅具有止血斂創(chuàng)、抗菌消炎的功效；而且是一種理想的中長期血管栓塞的天然材料。白芨多糖對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程都有顯著抑制作用，并可用作化療藥物的載體, 是一種功效強(qiáng)大的抗腫瘤藥物[3-4]。

隨著對白芨多糖的研究不斷深入，對白芨多糖衍生物的研究漸漸引起大家的重視[5-6]。多糖的活性受其分子結(jié)構(gòu)的影響。通過化學(xué)方法，對糖類及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化或轉(zhuǎn)化，可以提高它們的生物活性和生物利用度，改變其理化性能。目前對多糖進(jìn)行修飾的常見方法包括硫酸化、磷酸化、乙?；?、烷基化、羧甲基化等。香菇多糖經(jīng)硫酸化修飾后，其抗腫瘤、抗凝血和免疫調(diào)節(jié)作用得到很大提高，甚至可以抑制HIV-1產(chǎn)生的病變[7]。也有研究成果表明，一些羧甲基化、甲基化，或硫酸酯化的茯苓多糖衍生物所具有的生物活性超過茯苓多糖[8-9]。Nakashima[10]等發(fā)現(xiàn)，去除卡拉膠和肝素等多糖物質(zhì)的硫酸根，它們抑制皰疹病毒復(fù)制的作用也隨之消失。對白芨多糖進(jìn)行分子修飾，不僅可以幫助我們明確它的構(gòu)效關(guān)系，還能夠拓寬白芨多糖的應(yīng)用領(lǐng)域，獲得更好的使用效果。

多糖磷酸酯作為一類重要的多糖衍生物，也具有很強(qiáng)的生物活性。紅芪多糖磷酸酯的體外抗氧化能力高于紅芪多糖[11]。而對堿溶性銀耳多糖進(jìn)行磷酸酯化修飾，也提高了堿溶性銀耳多糖對DPPH自由基的清除效果[12]。N, N-二(2-氯乙基)果糖基磷酰胺酯對L1210細(xì)胞和S2180腹水癌有一定的抑制作用[13]。除此之外，對淀粉的磷酸酯化還能夠提高淀粉的抗凝沉性、透光率和熱穩(wěn)定性[14]。用磷酸作交聯(lián)劑制備的可溶性大豆多糖復(fù)合物可以有效阻止酸奶中酪蛋白聚集，穩(wěn)定體系，提高酸奶的品質(zhì)[15]。而殼聚糖磷酸酯、藻酸鹽磷酸酯[16]、羥甲基纖維素磷酸酯[17]可以調(diào)節(jié)羥基磷灰石的礦化，這將在骨組織工程中發(fā)揮重要作用。白芨多糖磷酸酯也可能具有一定的生物活性。盡管多糖磷酸酯具有優(yōu)良的性質(zhì)和作用，但是目前多糖磷酸酯化反應(yīng)的反應(yīng)效率低，產(chǎn)品中磷酸基團(tuán)的取代度低，束縛了多糖磷酸酯化的研究進(jìn)展[18]。

本實(shí)驗(yàn)用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉作為磷?；噭?，對白芨多糖進(jìn)行了磷酸酯化。旨在提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和結(jié)合磷含量，獲得取代度更高的白芨多糖磷酸酯產(chǎn)品，從而為白芨資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1原料與試劑

白芨鱗莖，干制品，市購；乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、考馬斯亮藍(lán)G-250、鉬酸銨等均為分析純試劑。

1.2主要儀器

TENSOR27型傅立葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER光譜儀器公司)；UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司)；PL203型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HPX-9272MBE型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；RE-2002B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)；L-530型高速離心機(jī)(上海江東儀器廠)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1白芨多糖的提取

根據(jù)芮海云等人的方法改進(jìn)白芨多糖提取方法[2]。將白芨塊莖粉碎，過80目篩。白芨粉末加入20倍體積的蒸餾水中，在70 ℃下攪拌浸提。所得提取液經(jīng)過離心，取上清液。藥渣用相同的方法浸提2次，合并3次上清液。在60 ℃下減壓蒸餾，上清液濃縮至原體積的1/3。向濃縮液中加入3倍體積95%乙醇，4 ℃靜置過夜、過濾收集沉淀、洗滌。用Sevage法去除所得白芨多糖中游離的蛋白質(zhì)，再通過透析處理去除其中的小分子雜質(zhì)，得到白芨多糖產(chǎn)品。

1.3.2白芨多糖磷酸酯的制備

本文采用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的混合鹽為磷酸酯化劑，尿素為催化劑，對白芨多糖進(jìn)行磷酸酯化修飾，制備白芨多糖磷酸酯。

常溫下將自制白芨多糖產(chǎn)品與混合磷酸鹽混合，加入尿素，混合均勻。將混合物放入烘箱中反應(yīng)一定時(shí)間后取出。向所得固體混合物中加入適量蒸餾水，加熱到40 ℃復(fù)溶。溶液經(jīng)過濃縮，95%乙醇浸提，離心分離，干燥得到微黃色固體，即為白芨多糖磷酸酯粗產(chǎn)品。

1.3.3白芨多糖和白芨多糖磷酸酯的定性

分別稱取約2 mg白芨多糖和白芨多糖磷酸酯粗產(chǎn)品，用KBr混合壓片法在4000 cm-1～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.3.4結(jié)合磷含量的測定方法

本實(shí)驗(yàn)中白芨多糖磷酸酯的取代度主要從結(jié)合磷來計(jì)算。根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]，用分光光度法測定分子結(jié)構(gòu)中的結(jié)合磷含量，所得結(jié)果更準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。測得白芨多糖磷酸酯粗產(chǎn)品中的總磷和游離磷含量，即可求算結(jié)合磷的量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取無水磷酸二氫鉀0.4393 g，用蒸餾水溶解后準(zhǔn)確稀釋至1000 mL。取該溶液5 mL于100 mL容量瓶中，定容搖勻，作為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)磷溶液。吸取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 mL標(biāo)準(zhǔn)磷溶液，分別移入50 mL容量瓶中，依次加入10 mL 26%的硫酸溶液、5 mL 2%的鉬酸銨溶液、2 mL 5%的抗壞血酸溶液，混合均勻，用沸水浴加熱10 min，迅速冷卻，定容至50 mL。用紫外可見分光光度計(jì)，對磷酸二氫鉀溶液的吸光度進(jìn)行全波段連續(xù)掃描，溶液在波長824 nm附近出現(xiàn)最大吸收峰。因此本實(shí)驗(yàn)選擇824 nm為最大吸收波長。在此波長位置測定磷酸二氫鉀溶液的吸光度A，所得吸光度-磷含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。此標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是：

y=0.018 14x-0.001 83R2=0.997

圖1　磷含量與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

總磷含量的測定：準(zhǔn)確稱取0.50 g試樣放入50 mL的凱氏瓶中；加7.5 mL H2SO4-HNO3混合液，消化到液體清亮；加入蒸餾水約5 mL，冷卻后稀釋；轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容。取1 mL液體移至50 mL容量瓶中，加入10 mL蒸餾水，混勻后與鉬酸銨發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到總磷的含量。

游離磷含量的測定：準(zhǔn)確稱取0.3 g試樣，置于50 mL燒杯中。用1 mol/L的稀鹽酸將試樣溶解，用蒸餾水將試樣全部洗進(jìn)50 mL容量瓶中，充分搖勻，定容。過濾后，移取10 mL濾液于50 mL容量瓶中，發(fā)生顯色反應(yīng)。測定樣品在波長824 nm處的吸光值，計(jì)算出游離磷含量。

取代度(DS)的計(jì)算：已知樣品中結(jié)合磷含量、總磷含量和游離磷含量之間的關(guān)系是：

結(jié)合磷含量(%)=總磷含量-游離磷含量

(1)

又有取代度DS的計(jì)算公式如下：

(2)

其中：162—白芨多糖分子中每個(gè)葡萄糖摩爾質(zhì)量；

31-磷摩爾質(zhì)量；

磷含量為結(jié)合磷含量，%。

根據(jù)(1)、(2)式，可以計(jì)算出白芨多糖磷酸酯粗產(chǎn)品中的結(jié)合磷含量和取代度。

2結(jié)果與討論

2.1白芨多糖磷酸酯化前后的紅外光譜

磷酸酯化前后，白芨多糖與白芨多糖磷酸酯的紅外圖譜有明顯不同。

圖2顯示了白芨多糖的紅外光譜圖。在3600～3200 cm-1處有強(qiáng)的O—H伸縮振動特征吸收峰。3000～2800 cm-1處有C—H的特征吸收峰，1200～1000 cm-1處有C—O—H和C—O—C伸縮振動強(qiáng)吸收峰。1100～1010 cm-1范圍的吸收峰表明分子結(jié)構(gòu)中含有吡喃型糖基。950 cm-1附近的吸收，表明了葡萄糖吡喃殘基的存在。而870 cm-1的吸收峰是甘露糖殘基的特征吸收峰。在880 cm-1左右的吸收峰，說明分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵構(gòu)型主要為β型。因此可以確定此物質(zhì)為白芨多糖。

圖2　白芨多糖紅外光譜圖

圖3　白芨多糖磷酸酯產(chǎn)品紅外光譜圖

2.2混合磷酸鹽法制備白芨多糖磷酸酯的正交試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合鹽為磷酸酯化試劑，尿素為催化劑，對白芨多糖進(jìn)行磷酰化改性。磷酸鹽在反應(yīng)過程中的變化復(fù)雜，一般認(rèn)為各種無機(jī)磷酸鹽都是通過焦磷酸鹽的途徑與多糖發(fā)生反應(yīng)的[21]。在高溫條件下，磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉的混合鹽脫水生成焦磷酸鈉(Na3HP2O7)，生成的焦磷酸鈉與白芨多糖分子結(jié)構(gòu)中的—OH發(fā)生反應(yīng)，得到白芨多糖磷酸酯。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[21]，不同比例的混合磷酸鹽可制得不同取代度的多糖磷酸酯，磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的質(zhì)量比為3∶1時(shí)的取代度較高，所以在實(shí)驗(yàn)中固定兩種磷酸鹽的質(zhì)量比為3∶1，僅研究磷酸鹽總量對產(chǎn)物的影響。延長反應(yīng)時(shí)間、提高溫度，產(chǎn)物取代度會增加，但多糖在高溫條件下會裂解，顏色加深。所以，反應(yīng)時(shí)間不宜過長，溫度也不宜過高。本實(shí)驗(yàn)選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、磷酸鹽用量和尿素用量作為正交試驗(yàn)的四個(gè)因素進(jìn)行分析比較。實(shí)驗(yàn)中所選因素與水平見表1。

表1　白芨多糖磷酸酯化反應(yīng)正交試驗(yàn)的因素水平表

表2　白芨多糖磷酸酯化反應(yīng)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　白芨多糖磷酸酯化反應(yīng)正交試驗(yàn)的方差分析表

根據(jù)表2中的正交試驗(yàn)結(jié)果，得出混合磷酸鹽法制備白芨多糖衍生物的最佳反應(yīng)條件是：反應(yīng)溫度70 ℃，反應(yīng)時(shí)間為7 h，磷酸鹽用量為100%，尿素用量為10%。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，得到DS的平均值為0.013 8。從方差分析得到4個(gè)因素對產(chǎn)品的取代度的影響大小依次為：反應(yīng)溫度>尿素用量>反應(yīng)時(shí)間>磷酸鹽用量。其中反應(yīng)溫度對白芨多糖磷酸酯的取代度DS的影響最顯著，而反應(yīng)時(shí)間和磷酸鹽用量對DS的影響比較小。反應(yīng)溫度升高有利于磷酸酯化反應(yīng)的進(jìn)行；但是溫度過高，白芨多糖的分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，反而會使白芨多糖磷酸酯產(chǎn)品中的含磷量降低，達(dá)不到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。所以，最佳反應(yīng)溫度為70 ℃。由于反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)物的DS的影響比較小，而且反應(yīng)時(shí)間過長會造成原料的浪費(fèi)和成本的增加，所以選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為7 h。而磷酸鹽用量對產(chǎn)物的DS影響最小，可以適當(dāng)減少原料中磷酸鹽的總量，選擇最佳的磷酸鹽用量為100%。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中以磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉混合磷酸鹽作為磷?；噭?，對白芨多糖進(jìn)行了酯化反應(yīng)，得到白芨多糖磷酸酯。

對混合磷酸鹽法進(jìn)行了正交試驗(yàn)，得到了最佳反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度70 ℃，時(shí)間為7 h，磷酸鹽用量為100%，尿素用量為10%，所得產(chǎn)物中磷酸根取代度為0.013 8。從方差分析得到，反應(yīng)的四個(gè)因素對產(chǎn)品取代度的影響大?。悍磻?yīng)溫度>尿素用量>反應(yīng)時(shí)間>磷酸鹽用量；由方差分析可知，反應(yīng)溫度對白芨多糖磷酸酯化取代度的影響是最顯著的。

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Study on Phosphorylated Modification ofBlettilastriataPolysaccharide

Zhang Jie*, Shen Sheng, Shen Shuyi

(School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418, China)

AbstractPhosphorylated modification of the polysaccharide fromBlettilastriatawas studied. The phosphorylated polysaccharides with different degree of substituted (DS) were obtained with sodium dihydrogen phosphate and dibasic sodium phosphate. The effects of temperature, reaction time, the amount of phosphates and urea on the DS of the phosphorylated polysaccharide were also investigated. The optimum reaction conditions of preparation ofBletillastriatapolysaccharide phosphate ester is 70 ℃ for 7 hours, the amount of urea is 10% and dosage of phosphates was 100%. And the DS of product obtained was 0.0138.

Key wordsBlettilastriatapolysaccharide; phosphorylation; optimization

doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.03.005

收稿日期：2015-10-20

基金項(xiàng)目：上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動項(xiàng)目(10120K146027)。

*通訊作者：張潔(1978—)，女，副研究員，研究方向：生物活性物質(zhì)和表面活性劑在日用化學(xué)品中的應(yīng)用。E-mail: zhangjie@sit.edu.cn

中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-9690(2016)03-0013-04