羊纖維環(huán)部分缺損動物模型的構(gòu)建

袁秋明，徐寶山，楊強，劉越，姜洪豐，張楊，杜立龍，祁霽舟，趙家寧，馬信龍

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羊纖維環(huán)部分缺損動物模型的構(gòu)建

袁秋明1，2，徐寶山2，楊強2，劉越2，姜洪豐2，張楊2，杜立龍2，祁霽舟1，2，趙家寧1，2，馬信龍2

目的建立可用于椎間盤缺損修復(fù)研究的纖維環(huán)部分缺損動物模型。方法使用image J 1.46r軟件測量5根羊脊柱X線片T12/L1～L6/S1椎間隙高度，軸向剖開T12/L1～L6/S1椎間盤，測量擬作缺損處纖維環(huán)厚度，使用11號尖刀在3根離體羊脊柱T12/L1～L5/6椎間盤左前方制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm，下底朝向髓核的梯形缺損，上述羊脊柱均取自1歲齡綿羊。采用微創(chuàng)外側(cè)手術(shù)入路在2只1歲齡綿羊T12/L1～L5/6椎間盤左前方制作相同規(guī)格的梯形缺損。通過軸向剖開椎間盤測量梯形缺損的邊長、對切取的纖維環(huán)和少量髓核稱質(zhì)量，以此評估所制作的椎間盤梯形缺損。結(jié)果綿羊腰椎間隙高度為（4.45±0.28）mm，擬作缺損處纖維環(huán)厚度為（4.08±0.50）mm，分別與擬作梯形缺損的厚度（3 mm）和高度（5 mm）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；離體羊腰椎間盤梯形缺損的上底（3.03±0.09）mm、下底（5.03±0.09）mm、高度（4.97±0.10）mm和厚度（3.02±0.06）mm分別與梯形缺損預(yù)定值（上底3 mm、下底5 mm、高度5 mm和厚度3 mm）之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；從離體和在體的羊腰椎間盤梯形缺損處取出的纖維環(huán)及髓核質(zhì)量分別為（0.162±0.011）g和（0.166±0.014）g，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論通過微創(chuàng)外側(cè)手術(shù)入路，使用實驗中制作梯形缺損的方法可以簡單、安全、可靠地制作出符合要求、能用于椎間盤缺損修復(fù)研究的羊纖維環(huán)部分缺損的動物模型。

模型，動物；椎間盤切除術(shù)；組織工程；綿羊；纖維環(huán)缺損；椎間盤缺損

椎間盤退行性疾病發(fā)病率高，是導(dǎo)致運動功能障礙的主要原因［1］。尤其是腰椎間盤退變引發(fā)的椎間盤突出及其壓迫癥狀常常需要手術(shù)治療［2］。椎間盤部分切除術(shù)后留下的纖維環(huán)缺損的修復(fù)是臨床上面臨的一大難題。組織工程技術(shù)的快速發(fā)展為解決這一難題帶來了希望［3］。作為組織工程技術(shù)研究的重要載體——理想纖維環(huán)缺損動物模型的構(gòu)建顯得極為重要。目前椎間盤退變動物模型的構(gòu)建方法已有數(shù)十種［4-5］，但這些造模方法多是構(gòu)建椎間盤退變動物模型，且大多選用小型動物（如鼠、兔），大型動物纖維環(huán)部分缺損的構(gòu)建研究較少，而且所制作的纖維環(huán)部分缺損各有優(yōu)缺點，形狀和尺寸均不統(tǒng)一，不利于組織工程技術(shù)修復(fù)纖維環(huán)部分缺損效果的比較，從而制約了纖維環(huán)缺損修復(fù)研究的發(fā)展。本實驗選用羊，以離體和在體羊脊柱椎間盤制作梯形缺損，以期構(gòu)建理想纖維環(huán)部分缺損動物模型。

1材料與方法

1.1實驗材料新鮮羊脊柱（取自1歲齡，體質(zhì)量約50 kg的雄性綿羊）購于天津市金發(fā)羊肉店。2只1歲齡，體質(zhì)量約50 kg的雄性綿羊由天津醫(yī)院動物實驗室提供。戊巴比妥鈉、阿托品、丙泊酚、瑞芬太尼（天津醫(yī)院動物實驗室）；X線機（Kodak，美國）；“C”臂X線機（GE，美國）；刀片（上海聯(lián)輝醫(yī)療用品有限公司）；髓核鉗（天津希翼醫(yī)療器械商貿(mào)有限公司）；游標(biāo)卡尺（天津市量具廠）；電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2羊椎間隙高度和纖維環(huán)厚度的測量使用Kodak X光機對5根新鮮羊脊柱攝片（Kodak Directview System：73 kV 5.00 mAs）。通過imageJ 1.46r軟件對脊柱X線片中T12/ L1～L6/S1椎間隙前、中、后部進行測量［6］，見圖1，每部測量3次取平均數(shù)，計算前、中、后部的平均數(shù)作為相應(yīng)椎間隙的高度。軸向剖開椎間盤，使用游標(biāo)卡尺測量椎間盤矢狀徑和擬作缺損處纖維環(huán)的厚度，測量3次取平均數(shù)。

P：椎間隙后部；M：椎間隙中部；A：椎間隙前部Fig. 1 X-ray showingovine lumbar spine圖1　羊腰椎X線片

1.3離體組羊纖維環(huán)梯形缺損的制作用離體羊脊柱腰椎間盤制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm，下底朝向髓核的梯形缺損，見圖2。取3根新鮮羊脊柱，可以看到羊腰椎體較長，從椎體兩端向中央逐漸凹陷，兩端椎板膨大，膨大的椎板中間凹陷處即為椎間盤，用手指很容易觸及，見圖3。離體羊脊柱以羊右側(cè)臥位的位置擺放，術(shù)者位于其后方，用11號尖刀在椎間盤左前方貼近尾側(cè)椎板處，刀面與椎板平面平行，垂直刺入5 mm，形成的切口恰好為3 mm，然后沿該切口前端，刀面與椎板平面垂直并向前方偏斜約11°刺入5 mm，形成一3 mm切口，再沿第一個切口的后端，刀面與椎板平面垂直并向后方偏斜約11°刺入5 mm，最后刀面與頭側(cè)椎板平行，垂直刺入5 mm，作一3 mm切口將兩個切口端連起來，形成一邊長為3 mm的正方形外口。髓核鉗摘除正方形外口內(nèi)的纖維環(huán)直至髓核，形成一梯形缺損，測量梯形缺損的厚度，見圖3。軸向剖開梯形缺損的椎間盤，可以看到明顯的梯形結(jié)構(gòu)，并對梯形的上底、下底和高進行測量，見圖4。在3根羊脊柱T12/L1～L5/6椎間盤左前方共制作18個梯形缺損，并對每個梯形缺損處取出的纖維環(huán)及髓核稱質(zhì)量。

AF：纖維環(huán)；NP：髓核；defect：梯形缺損；TD：梯形缺損立體示意圖；a：上底；b：下底；c：厚；h：高Fig. 2 Schematic diagram of AFtrapezoid defect圖2　纖維環(huán)梯形缺損示意圖

：凸起的椎板； ：凹陷的椎間盤； ：中間凹陷的椎體；箭頭所示纖維環(huán)梯形缺損Fig.3 The trapezoid defect of the ovine AF圖3　離體羊纖維環(huán)梯形缺損

Fig. 4　 The trapezoid defect of the axial view of ovine AF圖4　軸位羊纖維環(huán)梯形缺損

1.4在體組羊椎間盤的暴露及梯形缺損的制作實驗方案獲天津醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準。綿羊術(shù)前禁食24 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，臀部肌內(nèi)注射阿托品0.05 mg/kg，動物進入較好的麻醉狀態(tài)。建立下肢淺靜脈輸液通道，推注丙泊酚3 mg/kg，氣管插管，丙泊酚20 mL/h、瑞芬太尼15 mL/h靜脈泵入。綿羊右側(cè)臥位于手術(shù)臺，以左側(cè)髂嵴上緣、最后一節(jié)肋骨下緣、右側(cè)腰椎橫突下緣為邊界剃毛備皮，消毒，鋪無菌手術(shù)單。采用微創(chuàng)外側(cè)手術(shù)入路［7］，根據(jù)目標(biāo)節(jié)段位置，沿左側(cè)橫突邊緣前方1 cm處作一縱行切口，依次分離腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌、腹橫肌至腹膜，沿腹膜后間隙至椎體側(cè)前方，分離椎間盤附著的肌肉，可以看到椎間盤兩邊膨大，中間凹陷，手指易觸及。術(shù)中保護腹膜、腎臟、輸尿管、腹主動脈?！癈”臂X線機透視定位，用11號尖刀按前述方法在羊T12/L1～L5/6椎間盤左前外側(cè)平行于椎間隙作梯形缺損（上底3 mm×下底5 mm×高5 mm×厚3 mm），見圖5。分別留存從梯形缺損處取出的纖維環(huán)和髓核，稱質(zhì)量。制作完6個梯形缺損后，逐層縫合，結(jié)束手術(shù)。共完成2只綿羊纖維環(huán)梯形缺損的制作手術(shù)。術(shù)中羊出血約13 mL。待羊清醒后，拔出氣管插管。移到室內(nèi)觀察1 h，生命體征穩(wěn)定，四肢活動正常，無不良反應(yīng)。肌內(nèi)注射青霉素80 萬U，連續(xù)注射3 d。術(shù)后密切觀察切口滲血滲液、飲食、四肢活動及大小便情況，紅霉素軟膏涂抹切口預(yù)防感染。

Fig5 The trapezoid defect of the ovine AF圖5　在體羊纖維環(huán)梯形缺損

1.5統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 20.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，樣本均數(shù)與預(yù)定值間的比較采用單樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1羊腰椎間盤測量結(jié)果綿羊脊柱T12/L1～L6/ S1各腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環(huán)厚度的測量結(jié)果，見表1。腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環(huán)厚度分別為（4.45±0.28）mm和（4.08±0.50）mm，與擬作梯形缺損的厚度3 mm和高度5 mm相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為30.532、10.859，均P＜0.05）。

Tab. 1 Measurement results of each lumbar intervertebral space height and the thickness of AFfor defect in sheep表1　羊各腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環(huán)厚度的測量結(jié)果　（n=5，mm，x ±s）

2.2離體組羊纖維環(huán)梯形缺損的測量結(jié)果測量的綿羊纖維環(huán)梯形缺損上底、下底、高和厚分別為（3.04± 0.09）mm、（5.03±0.09）mm、（4.97±0.10）mm、（3.02±0.06）mm，分別與預(yù)定值（3、5、5、3mm）之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為1.769、1.309、1.519、1.493，均P＞0.05）。

2.3離體組與在體組椎間盤梯形缺損處纖維環(huán)及髓核質(zhì)量比較離體組和在體組綿羊椎間盤梯形缺損處纖維環(huán)及少量髓核的質(zhì)量分別為（0.162±0.011）g、（0.166± 0.014）g，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.888，P＞0.05）。

2.4在體組羊纖維環(huán)梯形缺損制作術(shù)后術(shù)后12 d，2只綿羊切口均愈合良好，拆除縫線。羊活動良好，無不良事件發(fā)生。

3　討論

3.1建立纖維環(huán)部分缺損動物模型的意義椎間盤切除術(shù)是治療椎間盤退行性疾病的常用治療方法。椎間盤為無血管組織并處在特殊的力學(xué)環(huán)境中，損傷后自身修復(fù)能力非常有限［8］。以現(xiàn)有的治療技術(shù)，尚缺乏修復(fù)椎間盤纖維環(huán)缺損和恢復(fù)其功能的較好方法。纖維環(huán)缺損會加速椎間盤的退變，可能導(dǎo)致再次復(fù)發(fā)，而且纖維環(huán)缺損還與患者術(shù)后下腰痛具有相關(guān)性［9-10］。為了從根本上治療椎間盤退行性疾病，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率和術(shù)后下腰痛，在手術(shù)治療椎間盤退變性疾病時需要干預(yù)退變的椎間盤，修復(fù)破壞的纖維環(huán)。因此，本實驗構(gòu)建了羊纖維環(huán)部分缺損的動物模型，為研究組織工程技術(shù)修復(fù)纖維環(huán)部分缺損提供了重要載體，為從根本上治療椎間盤退行性疾病提供了可能。

3.2理想纖維環(huán)部分缺損動物模型的選擇在選擇動物模型模擬人體的腰椎間盤切除術(shù)后椎間盤退變和部分缺損時，要同時考慮到動物的種類、年齡、自然壽命和行走方式等，以及人體脊柱的生理結(jié)構(gòu)和椎間盤所處的特殊力學(xué)環(huán)境。因此，類人猿應(yīng)該是最理想的動物模型，但由于該實驗動物獲取困難、成本高等因素，決定了該動物模型不能作為主要的實驗研究對象。

小型動物，如大鼠、兔容易獲取，經(jīng)濟實用，是目前常用的動物模型。但是，與大型動物相比小型動物椎間盤具有物質(zhì)轉(zhuǎn)運距離短、新陳代謝活躍、基質(zhì)含水量高、終生含有脊索細胞等特點［11］。此類動物椎間盤較小，并不適合制作纖維環(huán)缺損修復(fù)模型，只能用作前期基礎(chǔ)實驗研究。大型動物的椎間盤結(jié)構(gòu)和人的較為相似，這類動物有牛、羊、犬、豬等。O’Connell等［12］進一步研究發(fā)現(xiàn)大型動物羊的椎間盤與人體椎間盤較為接近。因此，羊有望成為構(gòu)建理想纖維環(huán)部分缺損動物模型的選擇。

獲得理想的纖維環(huán)部分缺損動物模型要綜合考慮以下因素：（1）實驗動物獲取方便、經(jīng)濟實用、利于廣泛開展研究。（2）纖維環(huán)缺損動物模型安全可靠、可重復(fù)性好。（3）造模動物的腰椎間盤與人體椎間盤結(jié)構(gòu)相似，利于進一步開展修復(fù)與再生研究。（4）造模動物的椎間盤退變與人體椎間盤退變過程相似。（5）造模動物的損傷小，減少不必要的干擾因素。（6）制作纖維環(huán)缺損具有統(tǒng)一的量化標(biāo)準，且易于操作，減少不必要的人為因素對修復(fù)結(jié)果的影響。

3.3羊纖維環(huán)梯形缺損動物模型的優(yōu)勢選用綿羊作為制作纖維環(huán)部分缺損的大型動物模型，經(jīng)濟實用、易獲取。采用左前外側(cè)入路經(jīng)腹膜后到達羊左前椎間盤，操作簡單安全，不破壞椎體后方結(jié)構(gòu)，對椎間盤周圍軟組織影響小，減少了不必要的干擾因素。使用同一個標(biāo)準（3 mm×5 mm×5 mm×3 mm）制作梯形缺損，便于以后對組織工程技術(shù)修復(fù)椎間盤的效果進行比較。擬作梯形缺損的厚度3 mm和高度5 mm與實際測量的羊腰椎間隙高度（4.45±0.28）mm和纖維環(huán)厚度（4.08±0.50）mm相比有差異，說明制作的纖維環(huán)缺損充分，切去的髓核量很少，對髓核破壞小，降低了不必要的干擾因素。同時，本實驗對11號尖刀測量發(fā)現(xiàn)從刀尖向刀尾5 mm處的刀寬剛好是3 mm，可以在此作一標(biāo)記，術(shù)中通過該標(biāo)記很容易把握椎間盤切口的寬度和深度，操作簡單可靠。軸位剖開椎間盤，測量梯形缺損結(jié)果表明使用本纖維環(huán)梯形缺損制作方法能夠方便地制作出較為標(biāo)準的梯形缺損。離體組與在體組羊腰椎間盤缺損處纖維環(huán)髓核質(zhì)量無差異，間接反映了所制作的在體羊纖維環(huán)梯形缺損符合預(yù)期，并且所稱取的質(zhì)量與Oehme等［13］制作的羊椎間盤長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損取出的纖維環(huán)髓核相符（0.2 g），說明制作的梯形缺損較為充分、統(tǒng)一。

將纖維環(huán)缺損制成梯形更符合臨床髓核摘除后外口小、內(nèi)口大的缺損類型，并且梯形結(jié)構(gòu)能夠輔助支架更牢固地植入椎間盤缺損中，彌補了長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損［13］和扇形（10 mm×5 mm×2 mm）缺損［14］易于脫出的不足。同時梯形缺損所形成的斜面與長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損相比增加了支架與纖維環(huán)的接觸面積，減少了剪切應(yīng)力，有利于兩者牢固地結(jié)合，符合Bron等［15］認為的椎間盤修復(fù)材料和方法須滿足可牢固固定于周圍組織上、填充或修補纖維環(huán)缺損抑制髓核突出的要求。雖然Pirvu等［16］使用牛離體椎間盤制作了梯形（2 mm×3 mm×4 mm）缺損并進行了體外修復(fù)培養(yǎng)，但制作的梯形缺損尺寸較小，存在纖維環(huán)切取不充分的可能，論證纖維環(huán)缺損修復(fù)效果說服力有限，而且沒有構(gòu)建研究牛在體纖維環(huán)缺損。另外，構(gòu)建牛纖維環(huán)部分缺損動物模型，成本較高，不利于廣泛應(yīng)用。

采用微創(chuàng)外側(cè)手術(shù)入路經(jīng)腹膜后到達羊目標(biāo)椎間盤，使用前述的纖維環(huán)缺損制作方法成功構(gòu)建羊纖維環(huán)梯形缺損動物模型，操作簡單、安全、可靠，有望成為研究組織工程技術(shù)修復(fù)纖維環(huán)部分缺損的理想動物模型。下一步可開發(fā)相應(yīng)的器械，使纖維環(huán)缺損的制作更加簡化、統(tǒng)一。目前，制作纖維環(huán)缺損的形狀和尺寸尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準，需進一步研究制定統(tǒng)一的量化標(biāo)準，便于進行不同纖維環(huán)部分缺損修復(fù)效果的比較，從而推動整個纖維環(huán)缺損修復(fù)研究的發(fā)展。

（圖3～5見插頁）

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（2016-01-22收稿2016-01-25修回）

（本文編輯李鵬）

Establishment of annulus fibrosus partial defect model in sheep

YUAN Qiuming1，2，XU Baoshan2，YANG Qiang2，LIU Yue2，JIANG Hongfeng2，ZHANG Yang2，DU Lilong2，QI Jizhou1，2，ZHAO Jianing1，2，MA Xinlong2
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Hospital Corresponding Author E-mail：xubaoshan99@126.com

Objective To establish an animal model of annulus fibrosus（AF）partial defect for the repairing of intervertebral disc（IVD）defect. Methods Image J 1.46r software was used to measure the T12/L1-L6/S1 intervertebral height in ovine lumbar spine X-ray films. AF thickness was measured by axial split disc. A 11 blade was used to make a trapezoid defect of upper bottom 3 mm，lower bottom 5 mm，height 5 mm and thickness 3 mm，whose lower bottom toward the nucleus pulposus（NP）in the left front of ovine lumbar IVD in vitro. The minimally invasive lateral approach was used to make the same type of trapezoid defect in the left front of the ovine lumbar IVD in vivo. The trapezoidal defect length of the axial dividing disc was measured，AF and a small amount of NP from trapezoidal defect in IVD were weighed，and the production of trapezoidal defect in IVD was evaluated. Results The lumbar intervertebral space height of ovine was（4.45±0.28）mm. There were significant differences in the thickness of AF（4.08±0.50）mm，thickness（3 mm）and height（5 mm）of trapezoidal defect（P＜0.05），respectively. There were no significant differences in trapezoidal defects in ovine lumbar IVD in vitro on the upper bottom（3.03±0.09）mm，the lower bottom（5.03±0.09）mm，the height（4.97±0.10）mm，the thickness（3.02±0.06）mm and the trapezoidal defect predetermined value on the upper bottom 3 mm，the lower bottom 5 mm，the height 5 mm and the thickness 3 mm（P＞0. 05）. The weights of the AF and NP taken out from ovine lumbar IVD in vitro and in vivo were （0.162±0.011）g and（0.166±0.014）g，and there was no significant difference between them（P＞0.05）. Conclusion Through the operation of minimally invasive lateral approach，the method of making a trapezoidal defect in the experiments can establish animal model of AF partial defect，which meets the requirements for the repairing of IVD defect，and is simple，safe and reliable.

models，animal；diskectomy；tissue engineering；sheep；annulus fibrosus defect；intervertebral disc defect

R681.57，R681.533.1

A

10.11958/20160030

國家自然科學(xué)基金資助項目（81272046，31300798，31470937，31500781）；天津市衛(wèi)生局攻關(guān)課題（14KG121，15KG125）；天津市科學(xué)技術(shù)委員會課題（15JCYBJC25300，11JCYBJC10200）；中國博士后科學(xué)基金項目（2012T50235）

1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院

袁秋明（1989），男，碩士在讀，主要從事脊柱外科、組織工程椎間盤研究

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