Gli抑制劑GANT61對食管腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移抑制作用的研究

王雷，杜媛鯤，王林，米源，廖海江

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Gli抑制劑GANT61對食管腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移抑制作用的研究

王雷1，杜媛鯤2，王林1，米源1，廖海江1

目的研究Gli抑制劑GANT61對人食管腺癌細胞OE19和OE33的生長抑制作用及其可能作用機制。方法常規(guī)培養(yǎng)OE19和OE33細胞。MTS法檢測不同濃度GANT61（30、20、13.333 3、8.888 8、5.925 9、3.950 6、2.633 7、1.755 8、1.170 5 μmol /L）對OE19和OE33細胞活力的影響，以半數(shù)抑制濃度（IC50）表示。OE19和OE33細胞分別設(shè)治療組（10 μmol /L GANT61處理）和DMSO組（常規(guī)DMSO處理）。實時熒光定量PCR檢測2組OE19和OE33細胞中Gli1和Gli2 mRNA的表達。Western blot法檢測2組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達量的變化。Transwell侵襲實驗觀察2組OE19和OE33細胞24 h侵襲能力的變化。結(jié)果GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h的IC50值分別是8.08和9.65 μmol/L。治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達水平均低于DMSO組，CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組亦顯著降低（P＜0.05）。治療組在OE19和OE33細胞中的穿膜細胞數(shù)較DMSO組明顯減少（P＜0.01）。結(jié)論GANT61可以通過下調(diào)Gli1和Gli2 mRNA及蛋白水平的表達，抑制食管腺癌細胞的生長和侵襲；Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常活化和食管腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

食管腫瘤；腺癌；Hedgehog信號通路；Gli；GANT61

食管癌是世界第八大惡性腫瘤，主要包括食管鱗癌和食管腺癌。研究顯示，近年來食管腺癌的發(fā)生率和死亡率呈上升趨勢，且傳統(tǒng)的放、化療效果欠佳［1-2］。近年來針對信號傳導(dǎo)通路的靶向治療已經(jīng)使部分肺腺癌、腸腺癌等腫瘤患者受益［3-4］，但在食管腺癌中仍未找到更佳的治療靶點。大量研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog（Hh）信號通路在胃癌［5］、肺癌［6］、成神經(jīng)管細胞瘤［7］、紅白血?。?］、淋巴瘤［9］等多種腫瘤中異常激活，Hh與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。GANT61是近年研制的可特異性針對Hh通路中關(guān)鍵靶點Gli的抑制劑，在多種腫瘤中顯示了較好的抗腫瘤活性［10-11］。本研究通過探討GANT61對人食管腺癌細胞系OE19和OE33的Hh通路中Gli1和Gli2表達的影響，觀察GANT61對食管腺癌細胞的增殖及侵襲作用，并初步探討其抗腫瘤作用機制，為食管腺癌的靶向治療提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料人食管腺癌細胞系OE19和OE33購自Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Corning公司），胎牛血清、胰酶（美國Gemini公司），DMSO（美國MPBIO公司），GANT61（美國Selleckchem公司），Gli1、Gli2引物和探針（Hs00171790、Hs01119974_m1，美國Life Technologies公司），Gli1兔抗人多克隆抗體（ab-49314，美國Abcam公司），Gli2鼠抗人單克隆抗體（c-10）、GAPDH鼠抗人單克隆抗體（sc-32233）［美國Santa Cruz公司］，Cyclin D1鼠抗人單克隆抗體（2926S，美國Cell signaling公司），CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒、GloMax-96 Microplate Luminometer（美國Promega公司），Pierce-BCA蛋白分析試劑盒、M-PER培養(yǎng)細胞總蛋白提取試劑、NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計（美國Thermo Scientific公司），蛋白酶抑制劑（德國Roche公司），Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠、Tris/甘氨酸/電泳緩沖液、Tris/甘氨酸緩沖液（美國BIO-RAD公司），Transwell膜嵌套、Matrigel膠（美國Corning公司），ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)OE19和OE33細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱和RPMI 1640、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 MTS法觀察GANT61對細胞活力的影響將呈對數(shù)生長期的OE19和OE33細胞用0.25%胰酶消化、離心、細胞計數(shù)后用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，按照5 000個/孔細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔50 μL培養(yǎng)液，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)常規(guī)DMSO處理為對照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，次日每孔加入50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的不同終濃度GANT61（30、20、13.333 3、8.888 8、5.925 9、3.950 6、2.633 7、1.755 8、1.170 5 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)72 h后室溫放置96孔板10 min，每孔加入CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑100 μL，10 min后將96孔板置于GloMax-96 Microplate Luminometer儀器，采用儀器中CellTiter-Glo?軟件讀取數(shù)據(jù)，將所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad Prism 6軟件進行數(shù)據(jù)分析。計算GANT61對OE19和OE33細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），實驗重復(fù)3遍。

1.2.3實時熒光定量（RT）-PCR法檢測GANT61對OE19、OE33細胞Gli1、Gli2 mRNA表達量的影響分別將OE19 和OE33細胞于每孔1×105個接種到12孔板，次日細胞呈70%～80%融合生長時更換無血清培養(yǎng)基，并加入10 μmol /L的GANT61（治療組），設(shè)DMSO組為對照，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌細胞3次，按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，應(yīng)用NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測樣本RNA濃度，參照美國BIO-RAD公司的反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒說明書應(yīng)用Thermal Cycler儀器進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件：25℃5 min，42℃30 min和85℃5 min。用無R-Nase水稀釋cDNA 10倍，取4.5 μL作為模板，隨后分別加入Gli1、Gli2和GAPDH（內(nèi)參）基因的引物及探針（0.5 μL）以及Taqman基因表達預(yù)混液5 μL，以10 μL/孔加樣在384孔板上于ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀中進行PCR檢測，PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5 min；95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40個循環(huán)。讀取Ct值后采用2- Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot法檢測不同處理對OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達量的影響分別將OE19 和OE33細胞以每孔3×105個接種到6孔板，次日待細胞呈70%～80%融合生長時更換無血清培養(yǎng)基，并每孔加入10 μmol /L的GANT61（治療組），設(shè)DMSO組為對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌細胞3次，加入M-PER培養(yǎng)細胞總蛋白提取試劑和蛋白酶抑制劑，收集蛋白提取液并測定蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠的每個泳道行總蛋白上樣10 μg，經(jīng)Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進行電泳，電泳條件200 V 40 min。在Tris-甘氨酸緩沖液中將蛋白電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜，反應(yīng)條件100 V 40 min。5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜1 h后，孵育一抗4℃過夜。Gli1一抗?jié)舛葹?：1 000，Gli2一抗?jié)舛葹?：250，CyclinD1一抗?jié)舛葹?：1 000，內(nèi)參GAPDH一抗?jié)舛葹?：10 000。次日TBST洗膜3次，每次10 min后室溫孵育二抗1 h，二抗?jié)舛染鶠?：20 000，再用TBST洗膜3次，每次10 min，ECL試劑發(fā)光后于暗室曝光，顯影。應(yīng)用Image軟件對顯影的蛋白質(zhì)條帶進行灰度值分析，以目的蛋白條帶與GAPDH（內(nèi)參蛋白）條帶的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測不同處理對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響用培養(yǎng)基與Matrigel膠按照4：1稀釋后包被Transwell小室基底膜，放置培養(yǎng)箱內(nèi)2 h待Matrigel膠凝固。分別以10 μmol/L GANT61（治療組）、常規(guī)DMSO處理（DMSO組）OE19和OE33細胞，每孔以7.5×104個接種于上室，上室內(nèi)加無血清培養(yǎng)基，下室加含10%胎牛血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸去上室培養(yǎng)基，用棉簽擦除Matrigel膠，70%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫染色，在高倍鏡下（×400）每張膜取4個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，計算平均值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以x ±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度GANT61藥物對OE19和OE33細胞活力的影響GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h 的IC50值分別是8.08 μmol/L和9.65 μmol/L，見圖1。

2.2 2組OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2 mRNA表達水平比較治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA的表達水平均低于DMSO組（P＜0.05），見表1。

Tab. 1 The expression levels of Gli1，Gli2 mRNAs in OE19 and OE33 cells treated with GANT61表1　GANT61對OE19、OE33細胞Gli1、Gli2 mRNA表達的影響?。╪=3，2- Ct，x ±s）

2.3 2組OE19和OE33細胞Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平比較OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組均顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig. 2 The expression levels of Gli1，Gli2 and CyclinD1 proteins in OE19 and OE33 cells treated with GANT61圖2　GANT61對OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2、和CyclinD1蛋白表達的影響

Tab. 2 Comparison of Gli1，Gli2 and CyclinD1 expression levels treated with GANT61 or DMSO in OE19 and OE33 cells表2　2組OE19和OE33細胞中Gli1、Gli2、CyclinD1表達水平比較?。╪=3，x ±s）

2.4不同處理對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響OE19治療組穿膜細胞數(shù)（55.33±5.03）較DMSO組（114.67±53.00）、OE33治療組（72.67±5.50）較DMSO組（137.33±7.50）均明顯減少（t分別為14.988 和12.031，P＜0.01），見圖3。

Fig.3 The effects of GANT61 on invasion ability of OE19和OE33 cells（crystal violet staining，×400）圖3　GANT61對OE19和OE33細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×400）

3　討論

經(jīng)典的Hh信號傳導(dǎo)通路主要包括Hh配體、Ptch受體、Smo蛋白和Gli轉(zhuǎn)錄因子等。當Hh配體異常表達或者Smo蛋白被過度活化時，可導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子Gli異?；罨罨腉li進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活子，啟動Hh通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而對腫瘤的增殖分化、血管新生、侵襲轉(zhuǎn)移及細胞凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用。Hh通路抑制劑GDC-0449主要是針對Hh上游靶點Smo，具有一定抗腫瘤效果，其中GDC-0449已被美國FDA批準用于臨床試驗治療基底細胞癌［12-13］，但由于Smo存在天然或獲得性突變以及多條信號通路之間的交叉調(diào)控，導(dǎo)致針對Hh上游通路的靶向治療效果并不理想。

Gli家族包括Gli1、Gli2和Gli3，其中Gli1和Gli2發(fā)揮激活劑的功能，因為Gli作為轉(zhuǎn)錄作用因子在Hh信號通路中起著承上啟下的作用，所以將Gli作為靶點對Hh信號通路進行調(diào)控可以起到更好的作用。Li等［14］應(yīng)用針對Gli和Smo靶點的siRNA和小分子抑制劑對惡性間皮瘤進行體內(nèi)外抑瘤實驗顯示，Gli抑制劑比針對Smo靶點的siRNA和小分子抑制劑具有更強的抗腫瘤作用，能顯著抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，Gli有望成為更有效的抗腫瘤靶點。因此，本研究采用GANT61選擇性抑制Hh通路的靶點，探討Gli和食管腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

CyclinD1是一種原癌基因，在膀胱癌［15］，卵巢癌［16］等多種腫瘤中擴增或者過度表達，可導(dǎo)致細胞增殖失控并產(chǎn)生惡變，并且與預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，GANT61作用于OE19和OE33細胞72 h的IC50值分別是8.08 μmol/L和9.65 μmol/L，GANT61治療組OE19和OE33細胞的Gli1、Gli2 mRNA的表達水平均低于DMSO組，Gli1、Gli2和CyclinD1蛋白表達水平較DMSO組均顯著降低，表明GANT61可以顯著抑制食管腺癌細胞活力，并且顯著抑制食管腺癌細胞OE19和OE33中的Gli1和Gli2 mRNA和蛋白表達，下調(diào)CyclinD1蛋白表達，提示活化的Hh/Gli通路可以通過上調(diào)其下游靶基因CyclinD1的表達來促進細胞異常增殖，而GANT61可以特異性抑制Gli1和Gli2的表達，從而下調(diào)CyclinD1的表達，進而影響細胞周期，實現(xiàn)抑制腫瘤細胞生長增殖的作用。Srivastava等［17］研究顯示，GANT61可以通過顯著下調(diào)橫紋肌肉瘤細胞中CyclinD1/2/3 和CyclinE的表達，從而抑制細胞增殖。本研究結(jié)果與此基本一致。此外，有研究表明，Gli可以增強腫瘤細胞的運動能力和侵襲性，促進腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高腫瘤的侵襲能力［18］。本研究Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，GANT61治療組的OE19和OE33穿膜細胞數(shù)較DMSO組均明顯減少，表明GANT61可使食管腺癌細胞的侵襲能力顯著下降，考慮機制可能與GANT61通過抑制Gli的表達，從而下調(diào)腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力有關(guān)。

綜上所述，鑒于Gli在食管腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用以及GANT61良好的抗腫瘤活性，GANT61有望成為有效的抗食管癌靶向藥物。

（圖3見插頁）

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（2015-11-25收稿2016-01-18修回）（本文編輯陸榮展）

GANT61 as an inhibitor of Gli inhibits growth and invasion of esophageal adenocarcinoma

WANG Lei1，DU Yuankun2，WANG Lin1，MI Yuan1，LIAO Haijiang1
1 Department of Thoracic Surgery，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang 050011，China；2 Department of Journal，Hebei Medical University

Objective To study the inhibitory effects of GANT61，as an inhibitor of Gli，on the growth of human esophageal adenocarcinoma cell lines OE19 and OE33，and their mechanisms thereof. Methods After treating with different concentrations of GANT61（30，20，13.333 3，8.888 8，5.925 9，3.950 6，2.633 7，1.755 8，1.170 5 μmol/L），the cell viabilities of OE19 and OE33 were detected by MTS method，which expressed by IC50. The Gli1and Gli2 mRNA expressions treated with GANT61（10 μmol/L GANT61）or DMSO for 24 h were detected in OE19 and OE33 cell lines by real time fluorescence quantitative PCR. The protein expressions of Gli1，Gli2 and CyclinD1 treated with GANT61 or DMSO for 24 h were detected in OE19 and OE33 cell lines by Western blot assay. Transwell invasion assay was performed to evaluate the inhibiting effect on OE19 and OE33 cell invasion by the treatment of GANT61 or DMSO. Results The IC50of GANT61 was 8.08 μmol/L in OE19 and 9.65 μmol/L in OE33 cells. Compared with DMSO group，Gli1 and Gli2 mRNA expressions and Gli1，Gli2 and CyclinD1 protein expressions were significantly decreased in OE19 and OE33 cells of GANT61 group（P＜0.05）. The number of penetrating cells was significantly reduced in OE19 and OE33 cells of GANT61 group compared with that of DMSO group（P＜0.01）. Conclusion GANT61 can inhibit the growth and invasion of esophageal neoplasms cells by down-regulating Gli1 and Gli2 mRNA expression，which indicates that Hedgehog signaling pathway may play an important role in carcinogenesis and progression of esophageal adenocarcinoma．

esophageal neoplasms；adenocarcinoma；hedgehogsignal transduction pathway；Gli；GANT61

R655.3

A

10.11958/20150351

河北省科技廳科技攻關(guān)課題資助（132077127D）

1河北石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸二科（郵編050011）；2河北醫(yī)科大學(xué)期刊社

王雷（1976），男，副教授，醫(yī)學(xué)博士后，主要從事胸部腫瘤的靶向治療