Caveolin-1在結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中的表達(dá)及臨床意義

趙志韓方海

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Caveolin-1在結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中的表達(dá)及臨床意義

趙志1韓方海2

【摘要】目的 探討小凹蛋白（Caveolin-1，Cav-1）在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集在我院手術(shù)的結(jié)直腸癌患者110例，用免疫組化的方法檢測Cav-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Cav-1陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜上，低表達(dá)樣本51例，高表達(dá)樣本59例。Cav-1蛋白的表達(dá)與腫瘤N分期（P=0.011）及TNM分期密切相關(guān)（P=0.031）。Cav-1低表達(dá)患者的總體生存率及無進(jìn)展生存率明顯優(yōu)于Cav-1高表達(dá)患者（P均小于0.001）。結(jié)論 Cav-1或可以作為估計(jì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一，這也可能為結(jié)直腸癌患者的治療提高新的方向。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸腫瘤； 預(yù)后； 小凹蛋白

結(jié)直腸癌作為一種常見腫瘤是主要危害公眾健康的疾病之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在全球，每年約有120萬患者被診斷為結(jié)直腸癌，并且其主要發(fā)病率位于西方國家，在美國，每年約有142 820例新增加結(jié)直腸癌的患者，死亡高達(dá)50 830例［1］。在過去的數(shù)十年中，隨著TME手術(shù)及CME手術(shù)的推廣及化療藥物的不斷進(jìn)步，使得結(jié)直腸癌的生存率不斷提高，但仍有大約50%的病人術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，約有30%～40%的患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［2］。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用。腫瘤微環(huán)境由免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨髓來源的前細(xì)胞及脈管系統(tǒng)組成。在正常生理情況下，間質(zhì)作為一種防御組織能夠預(yù)防惡性腫瘤的形成；但在惡性腫瘤形成的環(huán)境下，間質(zhì)細(xì)胞卻可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

小凹（caveolae）是細(xì)胞表面50 nm～100 nm大小的凹陷。Caveolae大量存在于內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)caveolae參與許多細(xì)胞生命活動，例如：細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞膜形成、信號傳導(dǎo)和腫瘤生成。Caveolae蛋白家族有3個亞家族，分別是：Caveolin-1，Caveolin-2及Caveolin-3。Caveolin-1（Cav-1）基因位于染色體7（7q31.1），包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)Cav-1表達(dá)在不同的腫瘤組織中都有表達(dá)，且Cav-1的表達(dá)與腫瘤的種類相關(guān)，在不同的腫瘤中，其表達(dá)不一［3］。在胰腺癌及食管癌中，Cav-1處于高表達(dá)，并且高表達(dá)患者預(yù)后較好，這說明Cav-1起抑癌作用［3-4］，而在另外一些腫瘤中，如子宮癌，乳腺癌中，Cav-1起著促癌作用［5-6］。除此之外，Cav-1被敲除的小鼠模型更容易被誘導(dǎo)腫瘤的形成［7］。相反，Cav-1在腎臟、膽囊中的表達(dá)升高且具有腫瘤分期的依賴性［8］，這充分說明Cav-1在腫瘤中的作用具有細(xì)胞屬性。而且，Cav-1在腫瘤中的作用尚有爭議，一些文獻(xiàn)報(bào)道Cav-1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與預(yù)后有著密切的關(guān)系；相反，El-Gendi等［9］報(bào)道Cav-1在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與預(yù)后無密切的關(guān)聯(lián)。但是，近來有文獻(xiàn)報(bào)道Cav-1在乳腺癌、前列腺癌及其他腫瘤間質(zhì)中的缺失與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及差的預(yù)后有著密切的關(guān)系［9-11］。

但是，目前對于Cav-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義報(bào)道較少，本研究的目的就在于探討Cav-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、一般資料

選取2004年1月至2010年10月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胃腸外科接受手術(shù)的結(jié)直腸患者110例，其納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①病理學(xué)證實(shí)為腸癌；②術(shù)前未接受新輔助治療；③無多發(fā)性腫瘤；④術(shù)后根據(jù)NCCN接受完整的化療；⑤術(shù)后隨訪資料完整。病人術(shù)后病理分期按照AJCC推薦的第七版指南分期。

二、結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的獲取

選取2004年1月至2010年10月術(shù)前在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院活檢并且病理證實(shí)為結(jié)直腸癌的病人的癌組織標(biāo)本，其病人的納入標(biāo)準(zhǔn)如上，癌旁組織為距腫瘤10 cm的正常組織。

三、試劑

Cav-1 兔抗人單克隆抗體購自Cell signal technology （CST）公司，工作濃度為1：100，二抗試劑盒、一抗稀釋液、蘇木素及 DAB 顯色液等均購買自康為試劑公司。

四、免疫組化方法

將4微米厚的石蠟切片在65℃的烤箱烤2小時(shí)后，在梯度二甲苯中依次脫蠟，每次10分鐘；脫蠟后，在梯度酒精中水化后放入雙蒸水中10分鐘，完畢后切片放入檸檬酸修復(fù)液（PH6.0）并置于高壓鍋中煮沸5分鐘，將切片冷至室溫后，放入3%的過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物15分鐘，PBS漂洗三次，滴加1：100 d的Cav-1一抗，并置于4℃過夜，PBS 清洗，滴加羊抗兔二抗，室溫下孵育20分鐘，PBS漂洗，然后滴加 DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

五、結(jié)果判斷

由獨(dú)立的2位病理科醫(yī)生閱片，Cav-1的結(jié)果由腫瘤細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)面積聯(lián)合評判，其評分標(biāo)準(zhǔn)如下：染色面積，0分，0%～10%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～70%；4分，＞70%。染色強(qiáng)度，0分，陰性；1分，淺黃色；2分，棕黃色。染色面積加染色強(qiáng)度0～4分者定義為低表達(dá)；4分或4分以上定義為高表達(dá)。

六、Western blot檢測蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞用消化酶消化后收集，置于冰上加入100～150 μl裂解液15分鐘，然后移入到1.5 ml EP管中于4℃，12000 rmp的離心機(jī)離心10～15分鐘，提取上清移入離心管中放入沸水中煮5 min，BCA法測定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠的濃度為10%，上樣濃度為40 μg。然后以恒壓60 V電泳約半小時(shí)，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，改用100 V恒壓直至溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部，停止電泳。轉(zhuǎn)膜，染色，洗脫，封閉，常溫下孵育2 h后分別加入稀釋的抗體；4℃孵育過夜，漂洗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗；室溫下孵育1 h，TBST洗3次，加入ECL發(fā)光液后放入機(jī)器曝光。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)比較不同臨床病理特征的Cav-1的表達(dá)；Kapian-meier方法分析患者的生存情況；多變量生存分析采用Cox回歸模型，P值＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

本研究共納入110例病人，在這110例病人中，69例男性和41例女性。中位年齡53歲（25歲～77歲）。中位隨訪時(shí)間35個月（8個月～94個月）。

一、Cav-1在結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中的表達(dá)及與臨床病理之間的關(guān)系

Cav-1陽性表達(dá)的黃色或棕黃色顆粒位于腫瘤間質(zhì)中的脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)周圍細(xì)胞（圖1），其中29例樣本陰性表達(dá)，84例樣本陽性表達(dá)。在這113例樣本中，低表達(dá)樣本51例，高表達(dá)樣本59例。Cav-1蛋白的表達(dá)及與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表1。如表所示，Cav-1蛋白的表達(dá)與N分期（P=0.011）及腫瘤TNM分期密切相關(guān)（P=0.031），但與年齡，性別，腫瘤大小，T分期，Borrmann分型及組織分化類型無密切關(guān)系。

圖1 Cav-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

二、Cav-1與患者預(yù)后

如圖2所示，Cav-1低表達(dá)患者的總體生存和無進(jìn)展生存明顯差于Cav-1高表達(dá)患者（二者P＜0.001）。在Cox多因素回歸模型中，Cav-1也同樣被證明為總體生存獨(dú)立的預(yù)后不良因素（P＜0.001）見表2。

表1 Cav-1蛋白表達(dá)與患者臨床病理的關(guān)系表

三、Cav-1在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

如圖3所示，我們共選擇了4對癌組織和癌旁正常組織。經(jīng)Western blot證明，Cav-1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。

討 論

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)了Cav-1蛋白在結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中的缺失，并且Cav-1蛋白的表達(dá)與腫瘤的TNM分期和N分期有著密切的關(guān)系。同時(shí)，Kapian-meier分析顯示Cav-1蛋白表達(dá)高的患者與低表達(dá)患者相比，其預(yù)后也較好。并且在Cox多因素生存分析中，Cav-1也保留了其獨(dú)立性。這說明了Cav-1蛋白的表達(dá)缺失在腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。并且，Cav-1可以作為獨(dú)立的預(yù)后因素。這些研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果相同。

圖2 Kapian-meier方法分析患者的生存情況

Cav-1是小凹蛋白家族中的一員，并在眾多細(xì)胞廣泛表達(dá)。近來的研究表明，Cav-1 在腫瘤發(fā)生過程中既有抑癌效應(yīng)，又有致癌作用［12-13］。Joo HJ等［12］的研究顯示Cav-1表達(dá)的密度與腎癌的大小，TNM分期，分級，微血管密度轉(zhuǎn)移及差的預(yù)后有極大的關(guān)聯(lián)。Barresi V等［14］實(shí)驗(yàn)表明在腦膜瘤中Cav-1的表達(dá)與微血管的密度存在正相關(guān)。Moon KC等［15］實(shí)驗(yàn)表明在肺癌中Cav-1低表達(dá)與差的總體生存相關(guān)。Choi HN等［16］實(shí)驗(yàn)表明與癌旁組織相比，癌組織中的Cav-1 mRNA的水平明顯增高。除此之外，Zhou H等［17］通過對不同小鼠肝癌模型中的Cav-1表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)Cav-1可促進(jìn)肝癌的形成，其促進(jìn)作用主要是通過調(diào)節(jié)腫瘤的生長及VEGF的形成。Zhao X等［18］發(fā)現(xiàn)Cav-1可通過調(diào)節(jié)TRAIL負(fù)性調(diào)節(jié)HepG2細(xì)胞的凋亡。這些證據(jù)表明Cav-1不僅起到抑癌作用還可以起到促癌作用。

表2 單因素和多因素分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的因素表

圖3 Western blot檢測Cav-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，Cav-1的狀態(tài)可能可以作為淋巴結(jié)受浸潤的預(yù)測因子。Cav-1在活檢組織中的表達(dá)情況對于早期結(jié)直腸癌來說可能可以拿來作為患者是否能接受經(jīng)內(nèi)鏡切除的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一。而且，考慮到Cav-1的表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此，Cav-1的表達(dá)情況對于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者術(shù)后選擇化療具有重要意義。

我們還發(fā)現(xiàn)，Cav-1的表達(dá)與腫瘤的分期具有密切相關(guān)。患者Cav-1的表達(dá)缺失可能預(yù)示著患者的分期越晚。這個結(jié)果強(qiáng)調(diào)了Cav-1的在評估患者預(yù)后及化療藥物選擇上的作用。因?yàn)?，分期越晚，其預(yù)后越差，而且選擇化療更具有必要性。

除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)情況與患者的預(yù)后具有密切的關(guān)聯(lián)。Ho cc等［19］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，Cav-1的表達(dá)情況與患者的藥物抵抗及預(yù)后具有密切關(guān)聯(lián)。Satoh t等［20］發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)與膽囊癌的分級具有密切關(guān)聯(lián)。Tang y等［21］發(fā)現(xiàn)在肝癌中Cav-1的表達(dá)與預(yù)后具有重要的關(guān)聯(lián)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果都我們的結(jié)果一樣。因此，Cav-1的表達(dá)可能能夠作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后預(yù)測因子之一。

總之，本研究結(jié)果表明Cav-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)分級、TNM分期及預(yù)后密切相關(guān)，因此Cav-1可能會成為判定腫瘤預(yù)后的因素之一。

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（本文編輯：楊明）

趙志， 韓方海. Caveolin-1在結(jié)直腸癌組織間質(zhì)中的表達(dá)及臨床意義［J/CD］. 中華結(jié)直腸疾病電子雜志， 2016， 5（1）：47-51.

The expression and clinical significance of caveolin-1 in colorectal cancer stroma

Zhao Zhi， Han Fangha i.1Department of Gastrointestinal Surgery， Guilin Medical College Affiliated Hospital， Guilin 541000，China；2Department of Gastrointestinal Surgery，Sun Yat-Sen Memorial Hospital， Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510120， China
Corresponding author:Han Fanghai， Email: FH_Han@163.com

【Abstract】Objective To investigate the clinicopathological significance and prognostic value of Caveolin-1 （Cav-1） in colorectal cancer （CRC）. Methods A total of 110 patients with CRC were included in this study. The correlation between Cav-1 expression and clinicopathologic features and survival was studied. Results Cav-1 expression was detected in tumor cytoplasm and cytomembrane. The expression of Cav-1 was closely associated with pathologic （p） TNM stage （P=0.037） and pN stage （P=0.011）. Moreover， Kaplan-Meier analysis showed that high Cav-1 expression was associated with shorter overall survival and disease free survival （P＜0.001 for both）. Multivariate analysis revealed that the Cav-1 expression was an independent prognostic factor for overall survival （P＜ 0.014）. Conclusion The expression of Cav-1 in CRC was associated with poor prognosis and could be a prognostic factor for CRC patients.

【Key words】Colorectal neoplasms； Prognosis； Caveolin-1

DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.01.09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81572925）

作者單位：541000 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科1；510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院胃腸外科2

通信作者：韓方海，Email：FH_Han@163.com

收稿日期：（2016-1-18）