牡丹花黃酮的抗氧化活性研究

竇勇博

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

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牡丹花黃酮的抗氧化活性研究

竇勇博

（中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

摘要：牡丹是中國特有的木本名貴花卉，素有“花中之王”的美稱。黃酮類化合物廣泛存在自然界各類植物中，多以苷類形式存在。本實驗分別從DPPH·清除能力、·OH清除能力和還原力等三個方面，研究了牡丹花黃酮的抗氧化活性，結(jié)果表明：牡丹花黃酮能夠清除DPPH·自由基和·OH自由基，同時也具有一定的還原力，牡丹花黃酮對DPPH·和·OH的半清除濃度（IC50）分別為259.29μg/mL和1573.53μg/mL，每克牡丹花黃酮的還原力相當于213.07mg抗壞血酸和993.67mg蘆丁的還原力。

關鍵詞：牡丹花；黃酮；抗氧化性

牡丹是中國特有的木本名貴花卉，素有“花中之王”的美稱。黃酮類化合物廣泛存在自然界各類植物中，多以苷類形式存在。黃酮類化合物又稱黃體酮、生物類黃酮、黃堿素、維生素P，泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。黃酮常用的提取方法有傳統(tǒng)提取法、超聲波提取法、微波萃取法和酶解法等[1]。

近年來隨著對黃酮類化合物的不斷研究，許多不同的天然黃酮類化合物化合物被開發(fā)出來，加之對其藥理作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其對機體具有許多的生理活性，包括清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫、抗過敏、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抑制酶的活性、防止血管舒張等作用。另外，黃酮類化合物在食品醫(yī)藥領域的應用前景也是非常的廣闊。由于黃酮類化合物分子中含有酚羥基，可有效清除生物體內(nèi)的氧自由基，是一種天然的抗氧化劑。如花青素可以抑制油脂性過氧化物的全階段溢出，這種阻止氧化的能力是維生素E的十倍以上，這種抗氧化作用可以阻止細胞的退化、衰老，也可阻止癌癥的發(fā)生[2]。黃酮類化合物通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)，增強腫瘤細胞中的抗氧化酶活性，降低細胞內(nèi)活性氧的濃度，選擇性殺傷腫瘤細胞，從而有效抑制腫瘤細胞的快速增殖，因此達到抗癌的作用[3,4]。

1　材料與設備

1.1材料與試劑

蘆丁、乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵，天津大茂化學試劑廠。氫氧化鈉、DPPH，天津富宇精細化工有限公司?？箟难?、醋酸鎂、草酸、水楊酸、磷酸，天津博迪化工股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

小型植物粉碎機，XFB-400，吉首市中誠制藥機械廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE100-Pro，上海人和科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計，UV-1800，島津國際貿(mào)易有限公司；水循環(huán)真空泵，SHB-III，北京博遠祥德科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9140A，上海精宏實驗設備有限公司；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-300DB，北京卓信偉業(yè)科技有限公司；電子天平，YP3001 N，上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，HWoSY21-K，北京市長風儀器儀表有限公司；pH計，PHSJ-5，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3黃酮類化合物的提取

根據(jù)前期試驗測出提取黃酮的最佳條件是：乙醇濃度60%、提取溫度60℃、提取時間40min、料液比1:30，在此基礎上，用超聲波浸提法來提取牡丹花中總黃酮。提取流程為：牡丹鮮花→分揀→低溫烘干→粉碎→超聲波輔助提取→抽濾→真空濃縮→冷凍干燥→粗黃酮提取液。

將低溫冷凍的牡丹花50℃低溫烘干，粉碎機破碎，精確稱取牡丹花粉末1.0g，以70%的乙醇溶液為溶劑，料液比為1:30，超聲輔助浸提40min，浸提液經(jīng)抽濾后，加入相應濃度的乙醇定容于100mL容量瓶中作為提取液[5]。

1.4黃酮抗氧化性質(zhì)的研究

1.4.1清除DPPH·能力的測定

精確稱取DPPH標準品20.5mg，以95%乙醇為溶劑并定容至250mL容量瓶中，即配制成濃度為2×10-4mol/L 的DPPH·乙醇溶液。

精確移取2.0mL（待定）黃酮溶液于10mL試管中，分別加入2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液，搖勻，室溫下放置30min，以95%乙醇調(diào)零，在517nm處測得吸光度值1。同時，精確移取2.0mL黃酮溶液與2.0mL 95%乙醇混合后在517nm處測得吸光度值2，然后精確移取2.0mL配制好的DPPH·乙醇溶液與2.0mL95%乙醇混合后在517nm處測得吸光度值0，牡丹花黃酮對DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.4.2清除·OH能力的測定

依次精確移取1mL 0.15mol/L FeSO4、1mL 2mmol/L水楊酸溶液、1mL（參照臘梅花）的牡丹花黃酮溶液、1mL 6mmol/L H2O2于試管中，最后加入H2O2啟動反應。于37℃水浴反應0.5h，以蒸餾水為參比，測定不同濃度黃酮溶液在510nm處的吸光值。以1mL 0.15mol/L FeSO4，1mL 2mmol/L水楊酸溶液，1mL不同濃度的牡丹花黃酮溶液，1mL蒸餾水作為牡丹花黃酮的樣品對照組，牡丹花黃酮對·OH清除率計算公式如下：

1.4.3還原力的測定

取待測樣品液2.5mL，加入 2.5mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH 6.6）及2.5mL1%的鐵氰化鉀溶液。50℃水浴反應20min后快速冷卻至室溫，加入2.5mL 10%的三氯乙酸，混勻后3000r/min離心10min；取2.5mL上清液，依次加入2.5mL蒸餾水及0.5mL 0.1%的三氯化鐵?；旌暇鶆?，靜置10min后于700nm處測得吸光度值。吸光度值越大，表示還原力越強。

以抗壞血酸濃度與其吸光度作圖，求出標準曲線方程；將樣品的吸光度代入標準曲線方程，求出相對應的抗壞血酸濃度，最終將樣品的還原力表示為1g牡丹黃酮中含Xmg抗壞血酸的還原力。

2　結(jié)果與分析

超氧陰離子自由基對人體的危害特別大，牡丹花中的黃酮酚羥基能夠提供氫質(zhì)子，使氧化性的超氧陰離子自由基發(fā)生還原反應，從而終止自由基鏈式反應。DPPH·自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基[20]，加入牡丹黃酮后，具有清除DPPH·自由基的作用。根據(jù)線性回歸方程，可分別求出牡丹花黃酮、抗壞血酸和蘆丁的半抑制濃度IC50。IC50值即清除率達到50%時所需藥物的濃度，IC50值的大小表明了抗氧化劑清除自由基的能力高低，一般情況下IC50值越小，抗氧化劑的清除能力越強[6]。

目前有關牡丹花黃酮的抗氧化活性的研究相對較少。本實驗以抗壞血酸和蘆丁為參照，研究了黃酮樣品的還原力以及DPPH·和·OH清除活性。

2.1黃酮的DPPH·清除能力

如圖1所示，牡丹花黃酮、抗壞血酸和蘆丁對DPPH·的清除活性均隨濃度的增大而逐漸增大，量效關系顯著。相同濃度條件下，牡丹花黃酮的清除DPPH·能力低于抗壞血酸和蘆丁。根據(jù)線性擬合方程求出牡丹花黃酮的半清除濃度（IC50）為259.29μg/mL（見表1）。

圖1　牡丹花黃酮對DPPH·的清除作用

表1　牡丹花黃酮對DPPH·的半清除濃度（IC50）

2.2黃酮的·OH清除能力

圖2　牡丹花黃酮的·OH清除能力

由圖2可知，牡丹花黃酮、抗壞血酸和蘆丁對·OH清除活性均隨濃度的增大而逐漸增大，量效關系顯著。相同濃度條件下，牡丹花黃酮的·OH清除能力比抗壞血酸和蘆丁要低些。根據(jù)線性擬合方程求出牡丹花黃酮對· OH半清除濃度（IC50）為1573.53μg/mL（見表2）。

表2　牡丹花黃酮對·OH的半清除濃度（IC50）

2.3黃酮的還原力

圖3顯示了黃酮的還原力，由圖3知，牡丹花黃酮、抗壞血酸和蘆丁的還原力均隨濃度的增大而增大，量效關系顯著。同濃度條件下，牡丹花黃酮的還原力比抗壞血酸和蘆丁要低。經(jīng)計算，1g牡丹花黃酮的還原力相當于213.07mg抗壞血酸和993.67mg蘆丁的還原力（見表3）。

圖3　牡丹花黃酮的還原力

表3　牡丹花黃酮的還原力

3　結(jié)論與展望

本文采用生物、物理及化學的原理，研究了菏澤地區(qū)栽種的牡丹花黃酮的抗氧化活性。根據(jù)最佳提取條件提取牡丹黃酮，然后研究了抗氧化性能的差異。分別采用DPPH·自由基體系、·OH自由基體系和還原力測定體系，對牡丹花黃酮的抗氧化性能進行了測定比較，并用抗壞血酸和蘆丁作為對照。實驗結(jié)果表明：牡丹花黃酮能夠清除DPPH·自由基和·OH自由基，同時也具有較強的還原力。牡丹花黃酮的還原力均隨濃度的增大而逐漸增大，量效關系顯著；相同濃度條件下，牡丹花黃酮的還原力比抗壞血酸和蘆丁要低些。

本文中所提取的黃酮為牡丹花中的總黃酮，若能采用柱層析、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等方法對粗提物進行分離，采用高效液相色譜、質(zhì)譜等方法對牡丹黃酮化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，實驗結(jié)果將更有說服力。關于分子印跡技術(shù)[7]在牡丹黃酮領域的應用，研究相對來說比較少，尚處于探索階段，將其直接應用于黃酮提取的關鍵問題尚未解決，今后應該加強這方面的基礎研究，積累相關的數(shù)據(jù)，解決大規(guī)模提取分離工藝條件和設備方面的問題，促進分子印跡技術(shù)的不斷發(fā)展。隨著對分子印跡技術(shù)研究的不斷深入，其實際應用的問題將得到解決，分子印跡技術(shù)將在天然活性產(chǎn)物的開發(fā)利用方面發(fā)揮其巨大的價值。

參考文獻：

[1]程源斌.中原牡丹花黃酮的檢測、純化及抗氧化活性研究[D].鄭州:河南科技大學,2011.

[2]謝田偉.枇杷花黃酮與精油的提取及其性質(zhì)分析研究[D].廈門:集美大學,2012.

[3]Zhou T R.Inhibition of murine bladder tumorigenesis by soy Isoflavonoids via alterations in the cell cycle,apoptosis and angiogenenesis[J].Cancer Res.1998:5231-5238.

[4]朱俊東,楊家駒.大豆異黃酮抗癌作用研究進展 [J].國外醫(yī)學·衛(wèi)生學分冊,1998:257-260.

[5]裴詠萍,李維林,張涵慶.三氯化鋁比色法測定中藥中總黃酮含量的方法改進[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2009,23(4):53-55.

[6]田云.幾種植物抗氧化劑制備、評價與應用初步研究[D].長沙:湖南大學,2004.

[7]宋可珂.玫瑰花黃酮提取分離及抗氧化性能研究 [D].北京:北京林業(yè)大學,2012.

Study on Antioxidant Activity of Flavonoids Peony

DOU Yong-bo
(Jinan Fruit Research Institute All China Federation of Supply&Marketing Co-operatives,Jinan 250014,China)

Abstract:The peony is China's characteristic of woody rare flowers.Flavonoids widely exist in many kinds of plants,and in the form of glycosides.The antioxidant activity of flavonoids of peony were studied from 3 aspects of DPPH·scavenging activity,·OH scavenging activity and reducing power in this experiment.The results showed that flavonoids of peony have reducing power and scavenging activity of·OH and DPPH·.The IC50 of scavenging activity of DPPH·and·OH were 259.29μg/mL and 1573.53μg/mL,the reducing power of per gram flavonoids of peony flower was equivalent to 213.07mg of ascorbic acid and 993.67mg of rutin.

Key words:Peony;flavonoids;antioxidation

中圖分類號：O65

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1038(2016)04-0023-04

收稿日期：2015-08-16

作者簡介：竇勇博，男，研究方向為食品生物科學