培養(yǎng)基對酵母生長及藍莓酒質(zhì)量的影響

霍雨霞　薩玉龍

（呼倫貝爾職業(yè)技術學院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

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培養(yǎng)基對酵母生長及藍莓酒質(zhì)量的影響

霍雨霞薩玉龍

（呼倫貝爾職業(yè)技術學院，內(nèi)蒙古呼倫貝爾021000）

摘要：為探討培養(yǎng)基對活性干酵母生長及釀造果酒質(zhì)量的影響，以酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養(yǎng)基為對照，選取藍莓果漿、麥芽汁等成分改良活化培養(yǎng)基。結果表明：葡萄糖和酵母粉含量對酵母活化影響顯著，添加藍莓果漿、麥芽汁以及葡萄糖等成分優(yōu)化的培養(yǎng)基活化效果優(yōu)于對照（YEPD）。該系列培養(yǎng)基上酵母能夠快速生長增值，死細胞率低；與對照相比，釀造的藍莓酒殘?zhí)呛透呒壌己拷档?，酯類物質(zhì)含量最高提升12.1%，酒香濃郁。當培養(yǎng)基麥芽汁濃度超過3%，活化效果不會隨著麥芽汁濃度升高而顯著增加。改良后的培養(yǎng)基在提供酵母菌所需營養(yǎng)的同時提高酵母對藍莓果漿中糖類和氨基酸等物質(zhì)的利用率，使酒口感和香氣物質(zhì)更加平衡。

關鍵詞：活性干酵母；活化培養(yǎng)基；篩選；藍莓酒；質(zhì)量

活性干酵母廣泛用于果酒工業(yè)，能有效控制酒精發(fā)酵進程，生產(chǎn)出質(zhì)量均一的酒。使用前需要進行活化處理，使酵母膜透性和細胞功能完全復原。正確的復水方法可以充分發(fā)揮活性干酵母的性能，獲得理想的發(fā)酵產(chǎn)品?；罨囊话悴襟E為37°C下蒸餾水中復水溶解30min左右后，接種擴大發(fā)酵，但此方法酵母生長容易受到抑制，接種到發(fā)酵液后難以快速啟動發(fā)酵，因此如何快速有效地使干酵母復水活化對果酒生產(chǎn)尤為重要。

果酒用活性干酵母應用研究已有近50年的歷史[1]，Kraus等通過比較選取了9種商用干酵母，比較其在不同溫度的葡萄汁和純水中的酵母復水活化效果，發(fā)現(xiàn)在最適溫度范圍內(nèi)兩種培養(yǎng)基成分下活化效果存在差異[2]。復水的主要問題是粘結或者營養(yǎng)不良造成酵母生長遲緩，活化培養(yǎng)基中添加一定碳氮元素、金屬離子及抗氧化物質(zhì)能夠影響酵母細胞膜透性，進而對其核苷酸、細胞內(nèi)的水溶物含量產(chǎn)生影響，有利于酵母生長繁殖[3]。常用細胞計數(shù)、CO2產(chǎn)率等作為指標以確定酵母活化和接種的最佳條件和時間[4]。目前，國內(nèi)外關于酵母復水活化溫度對酵母生長狀態(tài)和果酒質(zhì)量的影響研究較多，但是對干酵母復水過程中生長和營養(yǎng)消耗以及接種后對果酒質(zhì)量的持續(xù)影響問題關注不夠，至今尚無特定某種果酒干酵母活化培養(yǎng)基優(yōu)化配制方面的報道。本文通過研究活化培養(yǎng)基成分對酵母活化狀態(tài)、死細胞數(shù)、耗糖產(chǎn)酒精能力以及所產(chǎn)藍莓原酒揮發(fā)性物質(zhì)影響，綜合分析可能的產(chǎn)生機理，以確定出最優(yōu)化的活化培養(yǎng)基，為發(fā)酵食品生產(chǎn)提供理論和實踐基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄酒活性干酵母CY3079，BDX購于加拿大拉曼集團羅賽爾公司。ZymafloreRX60，ZymafloreX5購于法國拉佛特公司。藍莓購于海拉爾市場，挑選無腐爛、無變質(zhì)的果實。

培養(yǎng)基配料：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉，均為分析純，購自于上海藍季科技發(fā)展有限公司。麥芽，購自于華潤（天津）啤酒廠。

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；YS100光學顯微鏡，日本Nikon公司；固相微萃取，配備PDMS/CAR/DVB頭，美國色譜科公司；MS4000氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀，美國瓦里安公司。

1.2實驗方法

1.2.1麥芽汁制備

取1kg大麥芽經(jīng)粉碎后，轉入4L水的糖化鍋中，60°C不斷攪拌下，糖化、過濾、煮沸、冷卻，再經(jīng)過過濾或離心后所得上層清液即為制備所得麥芽汁。糖化標準以碘液滴定不變藍為終點。

1.2.2活化培養(yǎng)基成分確定

以YEPD為對照培養(yǎng)基，對其中主要的組分進行消減法處理，找出對酵母活化影響最為顯著的成分進行優(yōu)化改良，培養(yǎng)基編號及成分見表1，每種培養(yǎng)基設置三個重復，分別接種到藍莓果漿中進行發(fā)酵。

表1　培養(yǎng)基成分設計Table 1 Design of the culture medium component

1.2.3酵母形態(tài)評價及血球計數(shù)

對酵母復水后生長狀態(tài)的觀察使用美藍染液水浸片法，參考沈萍等《微生物學實驗》并做微調(diào)改動：滴加一滴0.1%呂氏堿性美藍染液于載玻片中央，吸取少許酵母培養(yǎng)液置于染液中，混合均勻。然后用鑷子取蓋玻片蓋在培養(yǎng)液上。將制片放置3min后，用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母菌形態(tài)和出芽情況[5]。

酵母菌的計數(shù)，使用血球計數(shù)法，透明無色的為活酵母細胞，被染成藍色的為死亡的酵母細胞。染色30min后再次觀察，觀察死活細胞比例的變化[6]。

1.2.4藍莓果酒釀造工藝

主要參考Withy和Lodge的釀造工藝，并稍作改動，在得到原酒后進行澄清，然后對其指標進行檢測[7]，具體步驟如下：

藍莓→清洗→榨汁→過濾分離→果汁→成分調(diào)整→接種發(fā)酵→換罐陳釀→原酒→過濾→檢測。

1.2.5酒精度和還原糖含量測定

酒精含量采用蒸餾法測定：取上清液，按照Miller等的方法，使用DNS試劑，通過測定540nm波長下的光吸收值來確定還原糖的含量，并以葡萄糖為標準表示[8]。

1.2.6香氣物質(zhì)分析

藍莓原酒香氣成分的萃?。涸?5mL裝有微型磁力攪拌子的頂空瓶中加入NaCl（添加量為0.25g/mL）：取5mL待測藍莓原酒插入PDMS/CAR/DVB固相微萃取頭（Supelco公司，美國），于45°C下磁力攪拌吸附45min，GC解吸15min。

氣譜條件參照Howard等方法并稍作改動[9]。初始溫度為35°C，保持8min后，以3°C/min升溫至134°C，保留2min。再以20°C/min升至250°C，保持3.5min，整個過程持續(xù)50min。載氣為高純度He氣，流速為0.8mL/min。檢測器和進樣口溫度為250°C。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70eV。電子倍增器電壓1200V，掃描范圍25～400amu。離子源溫度220°C。

識別的揮發(fā)性物質(zhì)通過NIST譜庫進行識別，采用面積歸一法測出各物質(zhì)比例含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次平行的平均值。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析采用SPSS13.0中的ANOVA進行顯著性方差分析。應用LSD法進行多重比較分析，并通過相關性矩陣進行不同組分間的相關性分析。

2　結果與討論

2.1培養(yǎng)基成分對酵母生長的影響

2.1.1培養(yǎng)基對酵母生長狀態(tài)的影響

復水活化前30min，YEPD培養(yǎng)基活化的活性干酵母生長緩慢，細胞間形態(tài)差異較大，美藍染色后發(fā)現(xiàn)死細胞數(shù)較多，并且出現(xiàn)了四分體和芽孢態(tài)。在藍莓果漿的K1培養(yǎng)基上，酵母的生長情況未能顯著改善，仍處于受抑制狀態(tài)。對采用消減法配制的一系列培養(yǎng)基（P1，J1及D1）中酵母生長狀態(tài)觀察：在P1和J1上酵母菌生長顯著受到抑制，而使用D1培養(yǎng)基的酵母菌活化效果比P1和J1更好。培養(yǎng)基M1至M4的酵母形態(tài)比較均勻，美藍染色后發(fā)現(xiàn)酵母細胞生長狀態(tài)良好。

圖1中，活化1h后對各組活化培養(yǎng)基上酵母進行染色計數(shù)，發(fā)現(xiàn)YEPD培養(yǎng)基上生長的酵母菌落數(shù)和死細胞率與K1培養(yǎng)基接近，約為45%左右。優(yōu)化改進培養(yǎng)基成分，發(fā)現(xiàn)強化葡萄糖和麥芽汁的培養(yǎng)基（P1，M1-M4）相比另外幾種培養(yǎng)基酵母生長狀態(tài)較好，死細胞率顯著降低，D1中缺少葡萄糖，死細胞率最高，約為75.6%，M1培養(yǎng)基上酵母生長迅速，活化后菌落數(shù)達到4.72×1010。

圖1　培養(yǎng)基對酵母生長的影響Fig.1 The effect of medium on the growth of yeast

酵母菌理想的活化生長狀態(tài)是分散均一，呈現(xiàn)橢球形、卵形，若遇到不適宜生長環(huán)境或者營養(yǎng)不足則會出現(xiàn)畸形，如假菌絲、四倍體，甚至出現(xiàn)芽孢和絮凝態(tài)，這是酵母自我保護機制作用的結果，但當逆境狀態(tài)持續(xù)一段時間后就會形成傷害。逆境態(tài)活化培養(yǎng)的酵母菌擴培到發(fā)酵液以后，造成啟發(fā)緩慢，逆境下產(chǎn)生的物質(zhì)對酒的質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。通過消減法對幾種培養(yǎng)基上酵母生長狀態(tài)和死細胞率發(fā)現(xiàn)，與蛋白胨相比，葡萄糖和酵母粉對酵母活化影響顯著，這主要由于加入的葡萄糖，能夠減少細胞內(nèi)含物的泄漏，對細胞膜起穩(wěn)定作用[10]。而在YEPD中添加藍莓果漿后對酵母活化效果不夠顯著，說明藍莓果肉較難被酵母菌直接利用。麥芽汁中含有麥芽糖、葡萄糖、果糖等多種糖類，擴大酵母菌對麥芽汁利用范圍，并且麥芽汁含有礦質(zhì)元素等，有利于酵母菌維持細胞形態(tài)，補充營養(yǎng)物質(zhì)，促進其生長代謝。

2.1.2培養(yǎng)基對酵母發(fā)酵效率影響

由圖2可看出，幾種培養(yǎng)基上生長的酵母菌在前期對糖類消耗較慢，后期大量消耗糖類。從接種第24h開始添加麥芽汁的培養(yǎng)基M1至M4還原糖降低速率均顯著高于YEPD培養(yǎng)基。經(jīng)麥芽汁培養(yǎng)基活化，酵母菌能夠快速利用還原糖，發(fā)酵結束后對還原糖的測定發(fā)現(xiàn)，于M1-M4培養(yǎng)基復水活化的活性干酵母對葡萄糖的利用率顯著高于YEPD（＜0.05）。

圖2　培養(yǎng)基對藍莓酒中還原糖含量影響Fig.2 The effect of culture medium on the content of reducing sugar in buleberryfruit wine

不同生長狀態(tài)和階段的酵母菌對糖的利用率和產(chǎn)物存在差異[11]。由于醇類主要由酵母的無氧呼吸產(chǎn)生，受酵母菌數(shù)目和生長狀態(tài)影響顯著。酵母適宜活化后能夠快速進入生長繁殖狀態(tài)，對還原糖消耗主要通過其呼吸作用進行消耗，產(chǎn)率和酵母活細胞數(shù)直接相關。復水活化培養(yǎng)基（M1-M4）中添加的藍莓果汁和發(fā)酵液營養(yǎng)成分部分相似，復水對酵母菌有一定的馴化作用，酵母菌快速生長，縮短了發(fā)酵周期，并且提升了對不良環(huán)境的適應能力，且能夠有效利用發(fā)酵液中的糖分等營養(yǎng)物質(zhì)，達到需要的產(chǎn)物[12]。

2.2培養(yǎng)基對酵母菌產(chǎn)香影響

2.2.1醇類化合物

果酒的香氣物質(zhì)主要由酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酯類和高級醇綜合作用產(chǎn)生，是一個重要的質(zhì)量指標，使用添加麥芽汁的培養(yǎng)基有增加不良香氣的風險，需要進行檢測評價[11]。對使用不同活化培養(yǎng)基酵母發(fā)酵原酒的香氣物質(zhì)使用氣質(zhì)色譜分析發(fā)現(xiàn)，含有麥芽汁的M1至M4培養(yǎng)基相對于參照的YEPD培養(yǎng)基，產(chǎn)生的高級醇含量均顯著降低約10%，而處理組M1-M4之間高級醇含量差異不顯著。

高級醇含量過高容易造成酒體香氣過濃，產(chǎn)生不良味感，是果酒的主要異雜味來源之一[13]。藍莓酒中的醇類主要來源于酒精發(fā)酵、氨基酸轉化及有機酸降解物的氧化。當缺乏氮或者氨基氮會促使酵母細胞轉向利用來自氨基酸的氮源，從而留下了轉氨的高級醇，處理組的酵母菌對氮源利用率升高，相當于增加了氮源，能夠降低高級醇的生成量。可能是由于酵母利用麥芽糖需要通過質(zhì)子輸送系統(tǒng)輸送，限制了麥芽汁的大量利用，因而彼此差異不顯著（＜0.05）[14]。

2.2.2酯類化合物

酯類物質(zhì)可豐富藍莓酒香氣，增加風味品質(zhì)的感知強度[11]。從圖3可以看出，M2活化的酵母產(chǎn)酯類含量最高，質(zhì)量分數(shù)達到48.2%，顯著高于YEPD組的36.1%，說明麥芽汁起到促進作用。隨著培養(yǎng)基中麥芽汁濃度升高，M3，M4中酯類含量并未顯著高于M1和YEPD的活化組。

圖3　藍莓酒中主要香氣物質(zhì)Fig.3 The main flavour materials in Buleberryfruit

酯類化合物是藍莓酒中重要的香氣成分物質(zhì)之一，在發(fā)酵過程中由酵母形成，其途徑有兩條：一條是在酯酶的催化下由氨基酸的碳源骨架產(chǎn)生，另一條是乙酰輔酶A在醇?；D移酶的作用下酵解生成[15]。

圖4　酯類合成途徑Fig.4 The route of synthesis of acetate esters

由圖4看出，單糖能夠通過EMP途徑在NAD和酶的作用下生成乙酰輔酶(CH3COSCOA)，進一步在酶和醇類的參與下反應生成乙酸酯類等酯類。酯類合成需要泛酸，當藍莓果漿中氮源含量很低時，作為酯類前體物質(zhì)的氨基酸碳源骨架含量也會減少，從而使得酯類生成量減少。實驗中差異主要產(chǎn)生于發(fā)酵過程，這主要是由于酵母菌生命活動差別所致。

3　結論

1）實驗進一步論證了酵母活化是果酒釀造過程中一個關鍵步驟，其中培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分會影響酵母菌的成活率和生長狀態(tài)，而酵母菌的生長代謝狀況會對果酒的酒度、殘?zhí)且约皹嫵上銡馕镔|(zhì)的主要成分高級醇和酯類物質(zhì)含量等產(chǎn)生影響。使用麥芽汁和藍莓果肉優(yōu)化后的活化培養(yǎng)基能夠促進藍莓酒質(zhì)量的提升。

2）活化培養(yǎng)基中麥芽汁濃度的升高能夠在一定程度上促進酵母的生長和活化，提高對糖類等物質(zhì)的利用率和酯類物質(zhì)含量，保持高級醇處于較低水平，使香氣物質(zhì)更加濃郁。但麥芽汁含量超過3%時，促進效果不顯著。因此從生產(chǎn)成本和使用效果綜合考慮，在藍莓果酒生產(chǎn)中，建議使用質(zhì)量分數(shù)為3%的麥芽汁培養(yǎng)基進行酵母活化。此外，對于其他品質(zhì)如顏色、口感以及香氣物質(zhì)的評價還需要進一步研究。

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Effect of Medium on Yeast Growth and Quality of Buleberry Wine

HUO Yu-xiaSA Yu-long
(Hulunbeier Vocational Technical College,Neimenggu 021000,China)

Abstract:The blueberry fruit pulp and malt extract were selected to study the effect of medium on the growth of active dry yeast(ADY)and the quality of blueberry fruit wine,comparing to ADY extract peptone dextrose(YEPD)medium.The results indicated that the activation of ADY could significantly influenced by the content of glucose and yeast extract,and the activation improved by adding blueberry fruit pulp,malt extract and glucose reach better result than the control (YEPD).The ADY could quickly grow and propagate,with low dead cell ratio;the blueberry fruit wine reduced residual sugar and high alcohol,whereas raised the content of esters by 12.1%,with full aroma.The activating effect of medium had not heightened with a rise malt extract after the concentration of malt extract higher than 3%.The improved medium could not only supplied ADY with necessary nutrition but also raise the utilization rate of the sugar,amino acid and so on, helping the tasting and aroma of buleberryfruit wine more balance.

Key words:Active dry yeast；activating medium；selection,blueberry fruit wine；quality

中圖分類號：TS261.4

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1038(2016)04-0018-05

收稿日期：2015-12-16

基金項目：呼倫貝爾職業(yè)技術學院院級課題(課題編號：15-HZY12)

作者簡介：霍雨霞(1984—)，女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術