shRNA-CXCR7聯(lián)合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

王剛，程雪，張祥林，董福仁

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 放射線科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

shRNA-CXCR7聯(lián)合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

王剛1，程雪2Δ，張祥林1，董福仁1

(1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 放射線科，遼寧 錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

目的 探討重組腺病毒介導(dǎo)的細(xì)胞表面趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor type 7，CXCR7)基因沉默聯(lián)合腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響。方法 建立肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，2周后，當(dāng)裸鼠腫瘤體積達(dá)到50～100 mm3后，將20只造模成功的裸鼠隨機(jī)分為4組并標(biāo)記(n=5)，分別接受瘤內(nèi)注射治療：空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組。對各組荷瘤鼠用卡尺在體測量瘤體長短徑后進(jìn)行瘤體內(nèi)注射，1次/7 d。并繪制裸鼠移植瘤生長曲線。第5次注射治療后1周處死全部裸鼠，小心剝離腫瘤并進(jìn)行瘤體重量稱量。免疫組化和Western blot檢測各組移植瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)的表達(dá)。結(jié)果 治療開始到第7天，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組均較空白組腫瘤生長緩慢(P<0.05)；從第14天到35天，TRAIL組移植瘤體積增長迅速與空白組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組裸鼠移植瘤體積增長緩慢；35 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與其他各組相比TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤體積增幅最小 (P<0.05)。第35天時(shí)，shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤平均瘤重明顯小于空白組和TRAIL組，其中TRAIL+shRNA-CXCR7組瘤體質(zhì)量最輕(P<0.05)。免疫組化結(jié)果及Western blot結(jié)果顯示：TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組3組VEGF陽性表達(dá)均低于空白組，其中以TRAIL+shRNA-CXCR7組表達(dá)最低(P<0.05)。結(jié)論 下調(diào)CXCR7的表達(dá)聯(lián)合TRAIL可通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來抑制肝癌SMMC-7721裸鼠皮下移植瘤的生長進(jìn)展。

肝癌；CXCR7；TRAIL；VEGF；裸鼠

原發(fā)性肝癌是惡性程度極高的腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率分別位居全球惡性腫瘤排名的第6位和第2位[1]。而我國是肝癌發(fā)病率最高的國家之一，每年約有50%新發(fā)肝癌病例發(fā)生在中國[2]。近年來研究表明[3-4]，從分子水平抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，靶向作用于重要的信號通路可以逆轉(zhuǎn)、延遲或阻止致癌過程形成、防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為肝癌基因治療奠定了理論基礎(chǔ)并提供了新途徑。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是近年來繼Fas、TNF后發(fā)現(xiàn)的TNF超家族的又一成員[5]，TRAIL可選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織及細(xì)胞無凋亡誘導(dǎo)及毒性作用[6]，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。但幾乎所有的肝癌細(xì)胞系均對TRAIL表現(xiàn)出不同程度的耐受性，這在很大程度上限制了TRAIL在臨床肝癌治療中的廣泛應(yīng)用[7]。細(xì)胞表面趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor type 7，CXCR7)作為一種新的趨化因子受體，其對腫瘤的影響是多方面的。已有研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，CXCR7在乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌等增殖、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本研究前期已成功構(gòu)建靶向CXCR7基因的shRNA腺病毒表達(dá)載體，并已證實(shí)該載體對CXCR7基因的沉默效果。接下來將進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)在體研究shRNA-CXCR7聯(lián)合TRAIL對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響，為肝癌的基因治療提供理論依據(jù)和新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物:細(xì)胞株：人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海研究所細(xì)胞庫。

實(shí)驗(yàn)動物：6周齡體質(zhì)量18～20g BALB/c雌性裸鼠20只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑：

① 細(xì)胞培養(yǎng)主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基和胰酶(0.25%)均購自美國Gibco公司；PBS購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清(10%)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；

② 瘤內(nèi)注射治療試劑：shRNA-CXCR7重組腺病毒表達(dá)載體由遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院生物樣本庫構(gòu)建完成；重組可溶性TRAIL購自美國PeproTech公司；

③ Western blot主要試劑：兔抗人VEGF多克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人β-actin 多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白marker購自美國Fermenta公司；PVDF膜購自美國 Millipore公司；N,N′-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)、Tris堿、丙烯酰胺(Acr)、過硫酸銨(AP)、十二烷基硫酸鈉溶液、TEMED購自美國 Promega 公司；青霉素和鏈霉素購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Amersham Biosciences 公司；

④ 免疫組織化學(xué)主要試劑：SP-9000免疫組化、DAB顯色試劑盒、3-氨丙基三乙氧基硅烷、多聚賴氨酸及抗原修復(fù)液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立：調(diào)整肝癌SMMC-7721細(xì)胞濃度1×107/mL，選取裸鼠右前肢皮下為接種部位進(jìn)行消毒，用1 mL注射器斜行前行一段距離進(jìn)入右前肢皮下，將200 μL單細(xì)胞懸液緩慢注入接種部位。

1.2.2 動物分組及治療：2周后，當(dāng)裸鼠腫瘤體積達(dá)到50～100 mm3后，將20只造模成功的裸鼠隨機(jī)隨機(jī)分為4組并標(biāo)記(n=5)，分別接受瘤內(nèi)注射治療：空白組(50 μL PBS)、TRAIL組(50 μL，100 ng/mL TRAIL)、shRNA-CXCR7(50 μL 3.85×108pfu/mL shRNA-CXCR7)組和TRAIL+shRNA-CXCR7組。

一手固定裸鼠，使移植瘤充分暴露，消毒移植瘤部位皮膚(75%酒精)，持微量進(jìn)樣器于裸鼠移植瘤瘤內(nèi)行多點(diǎn)注射。

對各組荷瘤鼠用卡尺在體測量瘤體長短徑后進(jìn)行瘤體內(nèi)注射，1次/7 d。瘤體體積計(jì)算公式為：length×width2/2。第5次注射治療后1周處死全部裸鼠，小心剝離腫瘤并進(jìn)行瘤體質(zhì)量稱量。

1.2.3 免疫組化檢測VEGF的表達(dá)：每例腫瘤標(biāo)本切取1 cm×1 cm×0.3 cm后經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋切片。37 ℃過夜，干燥。將純甲醇 99 mL，30%H2O21 mL 充分混勻，然后放置切片于混合液中30 min。PBS洗滌切片；處理后的切片先用蒸餾水洗一次5 min，再用PBS洗3次，每次5 min。用山羊非免疫正常血清孵育切片；使用1:1000兔抗人VEGF多克隆抗體孵育切片60 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min。使用山羊抗兔的二抗(稀釋倍數(shù)1:200)室溫下保濕盒內(nèi)孵育60 min。用PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加SP試劑，PBS洗滌切片3次，每次5 min。DAB顯色：使用事先配好的DAB顯色液，在顯色前加入30% H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中10 min，閉光下反應(yīng)，并在顯微鏡下觀察顏色至棕色后，自來水洗滌切片，終止顯色；用蘇木素做核復(fù)染； 切片脫水、透明，樹膠封片。每張切片鏡下取5 個高倍鏡視野(×400)進(jìn)行觀察，胞漿內(nèi)棕褐色染色為VEGF陽性表達(dá)。

1.2.4 Western blot檢測VEGF蛋白的表達(dá)：提取各組腫瘤標(biāo)本200 mg后，提取總蛋白，測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)變性上樣，10%SDS-PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)印架上鋪“三明治”， 100 V，2 h轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，脫脂奶粉封閉液封閉1 h，將 PVDF 膜放入稀釋好的一抗中(稀釋度為1:250)，4 ℃過夜，次日取出PVDF膜泡在TBST中搖床清洗(5 min/次×3次)，放入已稀釋好的二抗(1:2000)，室溫，搖床2 h，ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 shRNA-CXCR7和/或TRAIL對肝癌裸鼠移植瘤生長的影響

2.1.1 移植瘤體積變化：當(dāng)腫瘤細(xì)胞裸鼠皮下接種1周時(shí)，出現(xiàn)可測量的實(shí)體腫瘤，2周時(shí)瘤體體積達(dá)到50～100 mm3，20只裸鼠皮下移植瘤成瘤造模過程中未出現(xiàn)死亡，造模成功率為100%。隨機(jī)將20只裸鼠分為4組，每組5只。

空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤平均體積(每組5只)分別為：(89.07±8.98)、(90.17±11.63)、(92.95±7.89)和(89.59±13.43) mm3，各組間治療前腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.130，P<0.05)。

各組分別在治療開始的第7、14、21、28和35 d進(jìn)行裸鼠瘤體體積在體測量，剔除空白組死亡的1只裸鼠數(shù)據(jù)(接受治療后的第3天死亡)繪制移植瘤生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：治療開始到第7天，TRAIL組(173.90±30.55)、shRNA-CXCR7組(180.14±31.17)和TRAIL+shRNA-CXCR7組(143.21±14.39)均較空白組(216.41±21.79)腫瘤生長緩慢(F=6.08，P<0.05)；從第14天一直到最后，TRAIL組移植瘤體積增長迅速與空白組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14 d：(414.09±72.46)mm3vs (458.60±83.79)mm3，21 d：(715.95±142.58)mm3vs (723.72±136.63)mm3，28 d：(1053.77±188.32)mm3vs (1129.74±217.72)mm3，35 d：(1480.86±229.27)mm3vs (1560.69±201.97)mm3；均P<0.05]，而shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組裸鼠移植瘤體積增長緩慢；35 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白組、TRAIL組、shRNA-CXCR7組[(1560.69±201.97)mm3、(1480.86±229.27)mm3、(1156.84±193.97)mm3]相比，TRAIL+shRNA-CXCR7組[(716.30±181.63)mm3]腫瘤體積增幅最小(F=17.00，P<0.05)。見圖1。該結(jié)果表明，TRAIL和/或shRNA-CXCR7都可以在不同程度上抑制腫瘤的生長，但隨著時(shí)間的延長，TRAIL抑制腫瘤增長的作用明顯減弱。

圖1 肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤生長曲線 (空白組n=4；其余3組n=5)治療后7天和35天，*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05， 與TRAIL組比較；△P<0.05，與shRNA-CXCR7組比較Fig.1 Growth curves of transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice7 days and 35 days post-treatment，*P<0.05，compared with blank group：#P<0.05，compared with TRAIL group；△P<0.05， compared with shRNA-CXCR7 group

2.1.2 移植瘤體質(zhì)量變化：所有裸鼠于成瘤后第35天全部處死，完整剝離移植瘤并進(jìn)行稱重?？瞻捉M(n=4)、TRAIL組(n=5)、shRNA-CXCR7組(n=5)和TRAIL+shRNA-CXCR7組(n=5)4組腫瘤瘤重分別為：(1.113±0.175)、(1.057±0.166)、(0.773±0.078)和(0.535±0.077)g。shRNA-CXCR7組、TRAIL+shRNA-CXCR7組腫瘤瘤重明顯小于空白組和TRAIL組(F=20.30，P<0.05)，其中TRAIL+shRNA-CXCR7組瘤體質(zhì)量最輕(P<0.05)。

2.2 shRNA-CXCR7和/或TRAIL對肝癌裸鼠移植瘤瘤體內(nèi)血管生成的影響

2.2.1 肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤免疫組化結(jié)果：VEGF陽性染色主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色染色，在移植瘤組織中呈片狀、彌漫性分布。空白組VEGF陽性表達(dá)較多，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組VEGF陽性表達(dá)均較少，以TRAIL+shRNA-CXCR7組表達(dá)最少。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF的表達(dá)(×400)Fig.2 Expression of VEGF in transplantation tumor of SMMC-7721 cell line of nude mice by immunohistochemistry(×400)

2.2.2 肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤Western blot結(jié)果：TRAIL+shRNA-CXCR7組(5485.01±1354.08)較空白組(31335.01±2465.30)、TRAIL組(20900.86±2010.07)及shRNA-CXCR7組(17311.46±2676.14)更顯著降低VEGF蛋白的表達(dá)(F=109.30，P<0.05)。其中空白組4只，其余組均5只。見圖3。

圖3 Western blot檢測肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF的表達(dá)Fig.3 Expression of VEGF in transplantation tumor of SMMC-7721 cell line of nude mice by Western blot

3 討論

為了在體研究shRNA-CXCR7聯(lián)合TRAIL對肝癌生物學(xué)行為的影響，本課題組首先建立了人肝癌SMMC-7721 細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。所選用的無胸腺的先天性T細(xì)胞免疫缺陷、缺乏免疫排斥反應(yīng)的BALB/c 裸鼠20只，將細(xì)胞濃度為1×107/mL的肝癌SMMC-7721細(xì)胞懸液以200 μL/只接種于裸鼠右前肢皮下，2周后，裸鼠移植瘤模型造模成功率達(dá)到 100%(20/20)，移植瘤形狀多為圓形或橢圓形，包膜完整，與周邊組織分界清楚，瘤體活動性良好。建立人肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤模型技術(shù)的掌握和模型的成功構(gòu)建，為后續(xù)研究肝癌生物治療奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

接下來隨機(jī)將造模成功的20只裸鼠分為4組，分別在接受第一次注射治療后的第7、14、21、28和35 d對裸鼠移植瘤體積進(jìn)行在體測量，并繪制裸鼠移植瘤生長曲線，通過連續(xù)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，治療開始到第7天，TRAIL組、shRNA-CXCR7組和TRAIL+shRNA-CXCR7組均較空白組腫瘤生長緩慢(P<0.05)；而從第14天一直到最后，TRAIL組移植瘤體積增長迅速，說明TRAIL的重復(fù)作用及隨著時(shí)間的延長，可使裸鼠移植瘤對TRAIL產(chǎn)生耐受。這與文獻(xiàn)報(bào)道[11]的肝癌細(xì)胞系對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡具有耐受性，且TRAIL重復(fù)作用會導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對TRAIL產(chǎn)生獲得性抗性的研究結(jié)果相一致。但將TRAIL與shRNA-CXCR7聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其對肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤生長的抑制作用明顯增強(qiáng)。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)CXCR7的表達(dá)聯(lián)合TRAIL可協(xié)同增強(qiáng)抑制裸鼠移植瘤的生長，增強(qiáng)了肝癌SMMC-7721裸鼠移植瘤對TRAIL的敏感性。

腫瘤的生長發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移離不開腫瘤血管生成，抑制血管生成能有效地控制腫瘤的進(jìn)展，已逐漸成為一種腫瘤靶向治療的主要手段[12]。促進(jìn)血管生成因子與抑制血管生成因子失衡，是促進(jìn)腫瘤新生血管發(fā)生與腫瘤生長的關(guān)鍵因素[13]。有研究表明[14]，腫瘤生長需要血管提供營養(yǎng)，沒有血管供血腫瘤不會長大，它只能生長至最大體積2～3 mm3。VEGF作為一種關(guān)鍵的、功能強(qiáng)大的腫瘤血管生成刺激因子發(fā)揮著中樞性的調(diào)控作用，參與多種生物學(xué)效應(yīng)，與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。因此，本研究運(yùn)用免疫組化和Western blot等方法檢測移植瘤組織中VEGF的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TRAIL與shRNA-CXCR7聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，該組移植瘤中VEGF表達(dá)明顯減少(P<0.05)。說明下調(diào)CXCR7聯(lián)合TRAIL可以明顯降低VEGF的表達(dá)，減少肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤的血管生成，抑制移植瘤的生長進(jìn)展。

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(編校：王儼儼)

Effect of shRNA-CXCR7 combined with TRAIL on subcutaneous transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice

WANG Gang1, CHENG Xue2Δ, ZHANG Xiang-lin1, DONG Fu-ren1

(1. Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China; 2. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the effect of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) gene silencing combined with TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL) on the growth of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells in nude mice.MethodsThe subcutaneous transplanted tumor model of hepatoma cell line SMMC-7721 in nude mice was established. After two weeks, the 20 successful nude mice models were randomly divided into four groups (n=5) and marked when the tumor volume of nude mice reached 50-100 mm3:blank group, TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group that

intratumoral injection therapy respectively. The tumor sizeinvivoby calipers was measured every 7 days and the growth curve of transplanted tumor in nude mice was drawed. All nude mice were killed after the fifth injection treatment and weighted the tumor of each group. The expression of vascular endothelial cell growth factor (VEGF) in transplanted tumor tissues was detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the blank group, the tumor of the TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group growed slowly on 7thday (P< 0.05). From the 14thday until the 35thday, the tumor volume of the TRAIL group growed rapidly, there was no statistical significance between TRAIL group and blank group, while the tumor volume of shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group still growed slowly. At the end(on the 35thday), the tumor volume of TRAIL+shRNA-CXCR7 group increase minimum, and there were statistical significance compared with other groups(P< 0.05). The average tumor weight of shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group were significantly smaller than those of blank group and TRAIL group, and the weight of TRAIL+shRNA-CXCR7 group was the lightest(P<0.05). Immunohistochemistry and Western blot results: the positive expression of VEGF in TRAIL group, shRNA-CXCR7 group and TRAIL+shRNA-CXCR7 group were lower than that in blank group, and the TRAIL+shRNA-CXCR7 expression minimum(P<0.05).ConclusionDown-regulation of CXCR7 combined with TRAIL could significantly inhibit the growth of subcutaneous transplantation tumor of SMMC-7721 cell line in nude mice through regulating the expression of VEGF.

hepatocellular carcinoma; CXCR7; TRAIL; VEGF; nude mice

遼寧省自然科學(xué)基金(2015020335)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金(XZJJ20130231)

王剛，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的影像診斷與介入治療，E-mail：wgcx1437@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2016)01-0028-04