HPLC法測定牛奶中甲砜霉素殘留前處理方法的研究

章厲劼 楊強(qiáng)

摘 要：甲砜霉素屬于氯霉素類的抗生素，作為氯霉素的替代藥物在畜牧業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛使用。并在2014年1月，我國頒布了《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。但該方法處理樣品時前處理在液液萃取時容易乳化，操作難度大，檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，精密度低，穩(wěn)定性差。本文用乙腈代替乙酸乙酯做提取液，并添加無水碳酸鈉后，成功解決了乳化，且方法操作簡單、提取效果好、前處理時間短、結(jié)果穩(wěn)定性好。

關(guān)鍵詞：牛奶；甲砜霉素；高效液相色譜

甲砜霉素（Thiamphenicol，分子式為C12H15Cl2NO5S）屬于氯霉素類的抗生素，可用于敏感菌如流感嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌屬等所致的呼吸道、尿路、腸道等感染。其抗菌作用、抗菌機(jī)理及抗菌活性與氯霉素基本相似[ 1，2 ]。作為氯霉素的替代藥物在畜牧業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛使用。甲砜霉素具有血液毒性，癥狀多為腹瀉、惡心、厭食和多發(fā)性神經(jīng)炎等[ 3 ]。對造血功能的毒性較大，早期可發(fā)生血清鐵增加，白細(xì)胞、血紅蛋白及網(wǎng)織細(xì)胞減少，由于甲砜霉素可抑制線粒體蛋清質(zhì)合成，且甲砜霉素治療后可見到與劑量相關(guān)的可逆性骨髓抑制現(xiàn)象。甲砜霉素可抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的生成，同時有較大的免疫抑制作用，約比氯霉素強(qiáng)6倍。本研究針對該標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，就標(biāo)準(zhǔn)方法與優(yōu)化方法的操作、添加回收率、精密度、穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：“貴陽市三聯(lián)乳業(yè)有限公司”生產(chǎn)的純牛奶，-18℃保存；

甲砜霉素對照品（純度99.7%，中國獸藥監(jiān)察所，批號K0241009）；

甲醇、乙腈為色譜純；

正己烷、乙酸乙酯、無水碳酸鈉為分析純；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，200mg，3mL，美國Agilent）；

固相萃取小柱（SPE）（C18小柱，500mg，6mL，美國Agilent）；

高效液相色譜儀（Waters 2695型，配紫外檢測器，美國Waters公司）；

電子天平（XS105型，德國梅特勒公司）；

渦旋儀（MS2型，德國IKA公司）；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（LABOROTA4000型，德國Heidolph公司）；

振蕩器（GFL-3005型，德國GLF公司）；

氮吹儀（DB-3D，TECHNE公司）。

1.2 甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱取甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品約50.1mg（含甲砜霉素約50mg）置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度、搖勻，即成1mg/mL的的甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精密量取甲砜霉素儲備液各1mL置于100mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，搖勻，即成10μg/mL的甲砜霉素工作液。

1.3 色譜條件

色譜柱（C18，250mm×4.6mm，5μm，美國Thermo）；流動相為乙腈-水（20∶80）；柱溫為40℃；流速為1.0mL/min；檢測波長為225nm；進(jìn)樣量為20μL。在此色譜條件下對照品溶液色譜圖見圖1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍的確定

精密量取10μg/mL甲砜霉素工作液用流動相梯度稀釋成0.1、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL甲砜霉素、氟苯尼考混標(biāo)上機(jī)液，注入自動進(jìn)樣瓶中，分別進(jìn)HPLC測定，結(jié)果以峰面積（A）對藥物濃度（c）作直線回歸，甲砜霉素在0.1～2.0μg/mL范圍內(nèi)，線性良好相關(guān)系數(shù)大于0.9999，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.5 陽性添加樣的測定及結(jié)果

向牛奶中添加20μg/kg、40μg/kg、100μg/kg三種濃度的甲砜霉素，每種濃度作9份，分三個工作日，每個工作日取三種濃度的樣品各三份按所擬定的檢測方法處理后測定。同時做個空白樣品。

方法精密度的測定。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算公式為：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD÷平均值）×100%。批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是同一次測定的精密度，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也可視為日內(nèi)精密度；批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是不同批次測定的精密度。

2 前處理方法研究

2.1 方法一（《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》）

稱取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯離心管中，加入20mL乙酸乙酯，振蕩10min。以4000r/min離心5min，取上清液置于雞心瓶中；殘?jiān)尤胍宜嵋阴?0mL，重復(fù)提取1次，合并2次提取液，于45℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至近干；加入5mL水于雞心瓶中，超聲5min使其溶解，轉(zhuǎn)至50mL離心管中。再加入5mL水于雞心瓶中重復(fù)溶解后轉(zhuǎn)至同一離心管中，加20mL正已烷，振蕩5min，4000r/min，室溫離心2min，取下層清液備用。C18柱依次用乙腈5mL和水5mL活化。取將備用液過柱，控制流速1min/mL，擠干，用5mL乙腈洗脫。收集洗脫液，于45℃用氮?dú)獯蹈?，用流動?.0mL溶解殘余物，濾膜過濾，供HPLC測定[ 7 ]。陽性添加樣的測定及結(jié)果見表1。100μg/kg濃度的添加樣色譜圖見圖3。

該方法為我國2014年公布實(shí)施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 29689-2013牛奶中甲砜霉素殘留量的測定 高效液相色譜法》中的前處理方法。該方法中，由于乙酸乙酯與牛奶不互溶，在萃取過程中，會出現(xiàn)不同程度上乳化層，對檢測結(jié)果造成影響。

2.2 方法二

稱取牛奶5.0±0.05g牛奶于50mL聚丙烯離心管中，加入5g無水碳酸鈉，再加入5mL乙腈，再渦旋提取2min，以4000r/min離心5min，吸取上清液置于雞心瓶中（此時，乳脂會分離成液態(tài)油狀，與乙腈分層）；再加入5mL乙腈重復(fù)提取1次，合并2次提取液于同一雞心瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至近干；加入5mL水，渦旋5min使充分溶解，轉(zhuǎn)移至10mL離心管中；再加入5mL水重復(fù)溶解1次，合并溶解液于離心管中，備用。C18柱（500mg/6mL）先后次用乙腈5mL和水5mL活化。取將備用液過柱，控制流速1min/mL，擠干，用5mL乙腈洗脫。收集洗脫液，于45℃用氮?dú)獯蹈桑昧鲃酉?.0mL溶解殘余物，濾膜過濾，供HPLC測定。陽性添加樣的測定及結(jié)果見表2。100μg/kg三種濃度的添加樣色譜圖見圖4。

該方法將提取液乙酸乙酯換為能與牛奶互溶，且極性更大的乙腈，解決了提取時乳化現(xiàn)象。提取時，但因乙腈沸點(diǎn)高于乙酸乙酯，且牛奶中的水與乙腈互溶后，濃縮耗時長，所以將提取液改為5mL，并在加入提取液前，先向樣品中加入無水碳酸鈉，去除牛奶中的水分。

3 討論與小結(jié)

1）方法一中由于乙酸乙酯與牛奶不互溶，在液液萃取時，如果振速過小，藥物提取不徹底；振搖過大，又會出現(xiàn)不同程度上乳化層，高速離心后乳化層仍不能分層。該方法提取過程操作復(fù)雜難度大，實(shí)驗(yàn)室的溫度、振蕩強(qiáng)度的不同，都會對乳化程度造成影響。

方法二用乙腈取代乙酸乙酯，很好的解決了提取時的乳化現(xiàn)象后，只需高速渦旋2min，無需再振蕩，縮短了提取時間。方法還加入了無水碳酸鈉去除牛奶中的水，提取離心后，會出現(xiàn)液液分層，上層為提取液乙腈，下層為乳脂脫水后形成的油脂，取上層提取液旋蒸濃縮至近干，加水溶解即可，無需再用正己烷去脂。方法二在操作難度、提取效果、前處理時間上更優(yōu)于方法一。

2）從表1、表2可看出方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三個濃度添加回收率在57.40%～83.00%間；而方法二三個濃度添加回收率在76.15%～95.13%間?？梢姺椒ǘ砑踊厥章蕛?yōu)于方法一。

3）方法一甲砜霉素在牛奶中20ng/kg、40ng/kg、100ng/kg三個濃度添加，批內(nèi)和批間的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在2.13～7.64%和6.72～12.44%間；而方法二三個濃度添加批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別低于1.59～5.12%和1.01～2.46%?？梢姺椒ǘ姆€(wěn)定性及精密度優(yōu)于方法一。

4）本研究在前處理過程中，用乙腈取代乙酸乙酯做提取液，并在提取前加入無水碳酸鈉，獲得了較好的效果。方法簡便、快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確可行。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林慶華.抗生索在獸醫(yī)臨床應(yīng)用上的進(jìn)展.福建畜牧獸醫(yī)，2000，22（3）39-44

[2] 徐仲鈞等.甲砜霉素散對雞巴氏桿菌病治療及毒性試驗(yàn).中國獸藥雜志，1996，30（2）34-35.