電針對(duì)睡眠剝奪大鼠行為學(xué)和脾臟IL- 1β、IL- 6和TNF-α的影響

胡天俊，虞 潔，王秀蓮，何揚(yáng)子（.暨南大學(xué)，廣州 50630；.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 50630）

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電針對(duì)睡眠剝奪大鼠行為學(xué)和脾臟IL- 1β、IL- 6和TNF-α的影響

胡天俊1，虞 潔1，王秀蓮1，何揚(yáng)子2
（1.暨南大學(xué)，廣州 510630；2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510630）

摘要：［目的］觀察電針對(duì)睡眠剝奪大鼠行為學(xué)和脾臟白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA表達(dá)的影響。［方法］將32只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、安定組和電針組。對(duì)照組未做任何處理，其余3組給予注射氯苯丙氨酸（PCPA）睡眠剝奪后，安定組給予腹腔注射安定，電針組給予電針百會(huì)、神庭，每組每日治療1次，連續(xù)5 d后行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)并采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)大鼠脾臟IL-1β、IL-6和TNF-α。［結(jié)果］與對(duì)照組相比，模型組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分和中央格停留時(shí)間明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，安定組和電針組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平得分、垂直得分和中央格停留時(shí)間明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，模型組IL-1β和TNF-α含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），IL-6無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組相比，安定組和電針組IL-1β和TNF-α含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-6無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。［結(jié)論］電針百會(huì)、神庭既能明顯改善睡眠剝奪癥狀，又能很好控制IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，解除失眠對(duì)機(jī)體的損害。

關(guān)鍵詞：電針；睡眠剝奪；細(xì)胞因子

失眠是指睡眠的始發(fā)和睡眠的維持發(fā)生障礙，是一類睡眠數(shù)量或質(zhì)量都達(dá)不到正常需求的主觀體驗(yàn)。歷代中醫(yī)家又稱之為“不得臥”、“少寐”等，是由于心神失養(yǎng)或不安而引起的，臨床上針灸對(duì)失眠有較好的療效，但其具體治療機(jī)制還不太清楚。失眠可導(dǎo)致人的工作能力、認(rèn)知功能及情緒下降［1］，甚至可影響自主神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫功能，誘發(fā)多種心身疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［2］。許多疾病，如感染、纖維肌瘤、惡性腫瘤、抑郁癥等均與睡眠剝奪有關(guān)［3］。失眠已成為廣泛和突出的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題。因此，研究針灸治療失眠具有重要意義。筆者擬從脾臟IL-1β，IL-6和TNF-α探討電針的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠32只，體質(zhì)量（200±20）g，6～8周齡，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK＜粵＞2011-0015，批號(hào)：44002100004077。飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、安定組和電針組，每組8只，正常隔離飼養(yǎng)1周后進(jìn)行干預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)在安靜、通風(fēng)、室溫適宜的條件下進(jìn)行。

1.2 模型制備與處理方法 對(duì)照組未做任何處理，正常飼養(yǎng)；其余3組于實(shí)驗(yàn)第1、2天按每只大鼠450 mg/kg的劑量腹腔注射氯苯丙氨酸（PCPA）造睡眠剝奪模型，造模成功后，模型組不再做任何處理；安定組于實(shí)驗(yàn)第3天按人-鼠給藥體表面積折算計(jì)量0.92 mg/kg給予腹腔注射安定，每日1次，連續(xù)5 d；電針組給予電針百會(huì)、神庭20 min，每日1次，連續(xù)5 d。（參照《常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖》，神庭位于大鼠頭部前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處；百會(huì)位于大鼠頭部頂骨正中，兩耳連線中點(diǎn)。電針操作：取0.22 mm×25 mm無菌針灸針斜刺或平刺百會(huì)、神庭，進(jìn)針3～5 mm后連接電針儀，選用連續(xù)波型，電壓6 V，頻率10 Hz，留針20 min）。各組大鼠均于實(shí)驗(yàn)第8天行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后在戊巴比妥鈉麻醉下收集脾臟作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（Open field test）檢測(cè)及方法 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱長(zhǎng)、寬、高為100 cm×100 cm×40 cm，箱底面按20 cm×20 cm大小平均分為25個(gè)方格，四壁內(nèi)側(cè)面涂黑，不和內(nèi)壁交界的9個(gè)方格作為中央格，余為外周區(qū)域。以大鼠穿越底面方格數(shù)（4只爪子均進(jìn)入方格才可計(jì)數(shù)）為水平得分；以大鼠直立的次數(shù)（攀附墻壁或前爪騰空均算）為水平得分；并記錄大鼠在中央格停留的時(shí)間。

測(cè)定條件：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所保持安靜、通風(fēng)，選擇在可調(diào)控光強(qiáng)度的暗室中進(jìn)行，光照強(qiáng)度在10 Lux最宜。實(shí)驗(yàn)開始前，各組大鼠需在測(cè)定房中適應(yīng)10 min以上。實(shí)驗(yàn)開始后，將大鼠放在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱底面最中央的方格內(nèi)，然后實(shí)驗(yàn)者迅速離開暗室，通過窗口觀察大鼠3 min內(nèi)穿越底面方格數(shù)、直立的次數(shù)以及在中央格停留的時(shí)間并錄像。每次測(cè)試結(jié)束后，清理大鼠留下的糞便和尿液，并擦拭箱底和內(nèi)壁，以免影響下一只大鼠的測(cè)試結(jié)果。每只僅測(cè)定1次，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后由3名以上實(shí)驗(yàn)人員采用盲法原則進(jìn)行錄像分析。

1.3.2 大鼠脾臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的檢測(cè)及方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法，取10 mg脾臟組織使用組織搗碎機(jī)破碎細(xì)胞勻漿提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；采用SYBR Green I熒光法，以β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見表1，反應(yīng)總體系為15 μL，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將獲得的循環(huán)閾值（cycle threshold CT），采用ΔΔCT （ΔΔCT=ΔCT-ΔCT基礎(chǔ)值；ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參）方法分析，根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用ABI7500 software（Version 2.0.5）和DataAssist3.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用公式2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量RQ值，計(jì)算出的結(jié)果用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表明：1）與對(duì)照組相比，模型組大鼠水平得分、垂直得分和中央格停留時(shí)間明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2）與模型組相比，安定組和電針組水平得分、垂直得分和中央格停留時(shí)間明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析表（±s）Tab.2 Analysis table of open field test of each group（±s）

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析表（±s）Tab.2 Analysis table of open field test of each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)水平得分（分）垂直得分（分）中央格停留時(shí)間（s）對(duì)照組 8 24.63±7.95 8.25±3.11 6.82±2.94模型組 8 33.50±8.60* 11.75±3.58* 11.34±3.86#安定組 8 22.88±5.91#6.38±3.50#6.71±2.41#電針組 8 22.00±8.57#7.50±3.07#7.68±2.88#

RT-PCR數(shù)據(jù)表明：1）與對(duì)照組相比，模型組大鼠脾臟IL-1β和TNF-α含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而IL-6無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；2）與模型組相比，安定組和電針組脾臟IL-1β和TNF-α含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-6雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但有減少趨勢(shì)；3）與對(duì)照組相比，安定組、電針組大鼠脾臟IL-1含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-6 和TNF-α含量趨勢(shì)升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠脾臟IL-1、IL-6、TNF-α基因的表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-1，IL-6 and TNF-α gene expression in the spleen of each group（±s）

表3 各組大鼠脾臟IL-1、IL-6、TNF-α基因的表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of IL-1，IL-6 and TNF-α gene expression in the spleen of each group（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組比較，#P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

組別 動(dòng)物數(shù) IL-1 RQ值 IL-6 RQ值對(duì)照組 8 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 8 1.83±0.19* 1.33±0.21安定組 8 1.31±0.17*#1.27±0.25電針組 8 1.33±0.15*#1.30±0.24 TNF-α RQ值1.00±0.00 1.45±0.17 1.28±0.13 1.37±0.10

3 討論

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中水平得分可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活躍程度，垂直得分可反映了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的好奇程度，這兩者均可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的興奮性；中央格停留時(shí)間可反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)外界環(huán)境的認(rèn)知能力，如果對(duì)新環(huán)境的認(rèn)知能力差，則停留在中央格的時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在白天進(jìn)行，正是大鼠安靜的時(shí)間，活動(dòng)性相對(duì)較低，然而模型組活動(dòng)量增高，這說明模型組大鼠經(jīng)過睡眠剝奪后睡眠-覺醒周期紊亂，興奮性增強(qiáng)，認(rèn)知能力逐漸下降；而電針組在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后活動(dòng)量趨于對(duì)照組，這說明電針百會(huì)、神庭可以調(diào)節(jié)睡眠剝奪大鼠的睡眠-覺醒周期，改善興奮狀態(tài)，解除睡眠剝奪狀態(tài)。

脾臟作為機(jī)體最大的二級(jí)免疫器官，是細(xì)胞免疫和體液免疫的主要發(fā)生場(chǎng)所，是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要器官，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中扮演著十分重要的角色。睡眠的調(diào)節(jié)相當(dāng)復(fù)雜，關(guān)于睡眠機(jī)制的研究，目前涌現(xiàn)出許多新的觀點(diǎn)。有人認(rèn)為睡眠覺醒行為和睡眠結(jié)構(gòu)是通過微生物產(chǎn)物和炎性細(xì)胞因子完成的，其中較重要的有IL-1β、IL-6和TNF-α等。在睡眠過程中，它們具有一定的晝夜節(jié)律性能不同程度地促進(jìn)睡眠［4］。早在1984年當(dāng)兔腦室內(nèi)注入提純的IL-1時(shí)，非快速動(dòng)眼型睡眠（NREM）時(shí)間延長(zhǎng)，并與劑量呈正相關(guān)［5］。有研究發(fā)現(xiàn)睡眠缺乏或日間過度嗜睡者IL-6水平升高，白天IL-6水平與前一夜睡眠的深度質(zhì)量負(fù)相關(guān)，夜間睡眠剝奪后次日白天血循環(huán)中過度分泌IL-6［6］。測(cè)定睡眠剝奪后大鼠血清細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪24h后TNF-α明顯高于正常對(duì)照組［7］。Shearer用模擬太空飛行對(duì)人進(jìn)行睡眠剝奪后，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血漿IL-6、TNF-α等受體結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部睡眠剝奪測(cè)試者體內(nèi)IL-6和TNF-α血漿濃度均增高［8］。

由此可見，IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子是睡眠的重要調(diào)節(jié)因子之一，不僅對(duì)生理性睡眠具有調(diào)節(jié)作用，而且在許多與睡眠相關(guān)疾病中都存在細(xì)胞因子的異常表達(dá)，并發(fā)生相應(yīng)的節(jié)律性變化，改善失眠癥狀。但是，細(xì)胞因子分泌格局及其平衡一旦被打破，則有可能導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的紊亂。因?yàn)檫@些細(xì)胞因子的生物學(xué)功能具有雙重性，一方面具有治療和抗御疾病的有益生物學(xué)活性，例如抗感染、糾正免疫缺陷等作用，但另一方面細(xì)胞因子具有介導(dǎo)或促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展的病理學(xué)作用。有研究報(bào)道，體內(nèi)持續(xù)升高的細(xì)胞因子可引起或加重慢性感染，如慢性自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病等［9］。IL-1β能誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中某些重要的神經(jīng)毒性分子的釋放，促進(jìn)腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9的合成，進(jìn)而致使神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)遭到破壞［10］，部分細(xì)胞因子特別是IL-6、TNF-α參與了癌癥惡病質(zhì)的發(fā)生和發(fā)展過程［11］。此外，還有研究表明，炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生和發(fā)展的全過程［12］。大量炎癥因子的產(chǎn)生和釋放與AS斑塊的進(jìn)展密切相關(guān)［13］。

因此，我們推測(cè)，通過腹腔注射PCPA可以使大鼠體內(nèi)免疫應(yīng)激水平升高，體內(nèi)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也隨之升高，隨著睡眠剝奪的持續(xù)，機(jī)體免疫通路則可能會(huì)處于一個(gè)相對(duì)過表達(dá)的狀態(tài)，體內(nèi)免疫反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，細(xì)胞因子也隨之繼續(xù)增加，并給機(jī)體帶來不同程度的炎癥損害。經(jīng)過電針干預(yù)后，大鼠睡眠-覺醒周期趨于恢復(fù)，體內(nèi)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α過表達(dá)水平得到控制，既起到調(diào)節(jié)改善睡眠的作用，也調(diào)節(jié)失衡的免疫功能，解除睡眠剝奪對(duì)機(jī)體的損害。這說明電針治療失眠的機(jī)理之一是通過抑制免疫通路的某些因子或者促使其他因子表達(dá)來調(diào)控免疫通路，這將是我們今后研究的重點(diǎn)。

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（本文編輯：馬 英，張震之）

·中藥研究·

Effects of electro-acupuncture on behavior change and cytokines IL-1β，IL-6，TNF-α in the spleen of sleep deprivation rats

HU Tian-jun1，YU Jie1，WANG Xiu-lian1，HE Yang-zi2
（1.Jinan University，Guangzhou 510630，China；2.The First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou 510630，China）

Abstract:［Objective］To observe the effect of electro-acupuncture on behavior change and the cytokines of IL-1β，IL-6，TNF-α in the spleen of sleep deprivation rats to investigate the mechanism of electro-acupuncture treatment in insomnia.［Methods］Thirty-two Wistar rats with SPF level were randomized into the control group，model group，diazepam group and electro-acupuncture group. The sleep deprivation rats were established by DL-P-Chlorophenylalanine（PCPA）abdominal injection. The diazepam group were treated by diazepam，and the electro-acupuncture group were treated by electro-acupuncture with Baihui（GV20）and Shenting（GV24）acupoints. Behavior change and the cytokines of sleep deprivation rats were observed and analyzed by real time-PCR after 5 days continuously treatment.［Results］Comparison with the control group in the open field test，the crossing scores，the rearing scores and the pace time in center of the rats were significantly up-regulated in the model group（P＜0.05）. On the other hand，all of those scores mentioned above were significantly increased in the group of diazepam and electro-acupuncture（P＜0.05）. In the results of real time-PCR，the IL-1β and the TNF-α expression levels were remarkably higher in the model group than in the control group（P＜0.01）. Furthermore，the IL-1β and the TNF-α expression levels in the diazepam group and the electro-acupuncture group were Significantly down-regulated（P＜0.05）. But there was no obviously results in each group with the level of IL-6（P＞0.05）.［Conclusion］The electro-acupuncture can effectively treat the symptoms of Insomnia，and it also can proper control the level of cytokines.

Key words:electro-acupuncture；sleep deprivation；cytokine

中圖分類號(hào)：R256.23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1519（2016）01-0035-04

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.01.09

作者簡(jiǎn)介：胡天?。?986-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)獒樉闹委熒窠?jīng)系統(tǒng)疾病。

通訊作者：何揚(yáng)子，E-mail：thzy@jnu.edu.cn。

收稿日期：（2015-09-21）