刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺納米凝膠的制備及性能研究

王　楊，顧　準

(蘇州健雄職業(yè)技術學院生物與化學工程系，江蘇 太倉 215411)

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刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺納米凝膠的制備及性能研究

王楊，顧準

(蘇州健雄職業(yè)技術學院生物與化學工程系，江蘇 太倉 215411)

摘要：以N-乙烯基己內酰胺(VCL)為主單體，通過水相沉淀聚合制備刺激響應性聚N-乙烯基己內酰胺(PVCL)納米凝膠。利用動態(tài)光散射(DLS)、紅外光譜(FTIR)、拉曼光譜(Raman)和透射電鏡(TEM)等考察了交聯(lián)劑(MBA或BAC)、親水性共聚單體(MAA)對PVCL納米凝膠性能的影響。結果表明，增大交聯(lián)劑的親水性、增加交聯(lián)劑和MAA的用量均可增大PVCL納米凝膠的粒徑；PVCL納米凝膠具有溫度和pH值響應性，能夠在還原性環(huán)境中發(fā)生降解。細胞毒性實驗表明，PVCL納米凝膠細胞毒性小、生物相容性好，適合用作藥物載體。

關鍵詞：N-乙烯基己內酰胺(VCL)；水相沉淀聚合；納米凝膠；還原降解；細胞毒性

聚合物納米凝膠是一類內部具有交聯(lián)網(wǎng)絡結構、在溶劑中溶脹、不溶解、能夠穩(wěn)定分散的聚合物納米粒子。聚合物納米凝膠由親水性聚合物或環(huán)境敏感性聚合物組成，通過對環(huán)境的響應，發(fā)生相應的膨脹或收縮[1]。溫度是研究最廣泛的環(huán)境刺激因素之一，如果凝膠網(wǎng)絡內的聚合物具有溫度響應性，則會表現(xiàn)出溫度敏感的相轉變行為[2]。聚N-乙烯基己內酰胺(PVCL)是近年來被人們廣泛研究的溫度響應性聚合物之一，與聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)相比，PVCL具有相似的溫度響應性和更好的生物相容性[3-4]，被廣泛用于組織工程和藥物載體。PVCL納米凝膠的體積相轉變溫度(VPTT)為31～38 ℃，在制備過程中可通過共聚親水性或者疏水性單體調節(jié)[5]。

水相沉淀聚合具有操作簡便、綠色環(huán)保、制備的粒子均勻且尺寸小等優(yōu)點，是制備溫度響應性聚合物納米凝膠的常用方法之一[6]。通過引入環(huán)境敏感、可斷裂的交聯(lián)點，賦予聚合物納米凝膠生物降解性、提高聚合物納米凝膠的生物相容性[7-8]。細胞內還原性谷胱甘肽(GSH)的濃度為2～10mmol·L-1，遠大于細胞外GSH的濃度(2～10μmol·L-1)[9]，因此細胞內外存在還原勢的差異。二硫鍵在人體的正常體溫、pH值和氧化等環(huán)境下非常穩(wěn)定，而在一定量的谷胱甘肽還原酶或二硫蘇糖醇(DTT)等還原劑存在下易被還原生成巰基[10]。因此，含有二硫鍵交聯(lián)劑的聚合物納米凝膠在進入還原勢較低的細胞內時二硫鍵會發(fā)生斷裂，導致降解。

作者采用水相沉淀聚合方法制備了刺激響應性PVCL納米凝膠，并對其進行了動態(tài)光散射(DLS)、紅外光譜(FTIR)、拉曼光譜(Raman)、透射電鏡(TEM)表征，考察了交聯(lián)劑和親水性共聚單體對其性能的影響，研究了交聯(lián)劑為N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)或N,N′-雙(丙烯酰)胱胺(BAC)的PVCL納米凝膠粒子在還原性環(huán)境中的降解性及細胞毒性。

1實驗

1.1試劑與儀器

N-乙烯基己內酰胺(VCL，質量分數(shù)99%)、BAC(質量分數(shù)98%)、鹽酸阿霉素(98%),百靈威科技有限公司；MBA(質量分數(shù)99%)、二硫蘇糖醇(DTT，質量分數(shù)99%)、溴化噻唑藍四氮唑(MTT，質量分數(shù)98%)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲基丙烯酸(MAA，質量分數(shù)99%，減壓蒸餾)、過硫酸鉀(KPS，質量分數(shù)99%，在水中重結晶)、碳酸氫鈉(質量分數(shù)99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，質量分數(shù)99%)、N,N′-二甲基亞砜(DMSO，質量分數(shù)99%)，國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

MalvenNano-ZS90型動態(tài)光散射儀，英國馬爾文儀器有限公司；HitachiH-600型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；UV-VisLambda35型紫外可見吸收光譜儀，美國Lambda公司；AVANCEⅢ型Bruker500MHz核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；NicoletNexus-440型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；LabRam-1B型拉曼光譜儀，法國Dior公司；EL311型酶標免疫檢測儀，美國BioTek公司；3164型水套式CO2培養(yǎng)箱，美國FormaScientific公司。

1.2方法

1.2.1PVCL納米凝膠的制備

準確稱取一定質量的VCL、MAA、溶解于2 mL DMSO 的MBA/BAC及40 mg SDS、25 mg NaHCO3，溶解于100 mL雙蒸水后加入配有球形冷凝管的150 mL三口燒瓶中，于200 r·min-1下攪拌，向體系中持續(xù)通入氮氣，使反應一直處于惰性環(huán)境。通氮氣0.5 h后，升溫至70 ℃并穩(wěn)定10 min，快速加入2 mL濃度為12.5 mg·mL-1的KPS水溶液，開始聚合反應。6 h后停止加熱，保持氮氣環(huán)境冷卻至室溫。最后將產(chǎn)物轉移到截留分子量為14 000 Da的透析袋中，透析7 d以除去未反應的單體和其它雜質。改變VCL、MAA、MBA/BAC的用量以制備不同粒徑的PVCL納米凝膠。合成路線如圖1所示。

1.2.2PVCL納米凝膠的表征

采用動態(tài)光散射儀測定PVCL納米凝膠的粒徑；采用透射電鏡觀察其形貌；通過FTIR、Raman表征其結構。

1.2.3PVCL納米凝膠的溫度與pH值響應性實驗

采用動態(tài)光散射儀測定PVCL納米凝膠的粒徑隨溫度、pH值和MAA用量的變化，研究PVCL納米凝膠的溫度與pH值響應性行為；通過測定PVCL納米凝膠在25 ℃時電勢隨MAA用量和環(huán)境pH值的變化，研究PVCL納米凝膠的pH值響應性。所測PVCL納米凝膠的濃度為1.0 mg·mL-1。

1.2.4PVCL納米凝膠的還原降解實驗

采用動態(tài)光散射儀測定PVCL納米凝膠在還原介質DTT中的散射光強隨時間的變化，分析其還原降解行為。分別配制pH值為6.5、7.4、8.3的DTT濃度為10 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液，加入少量P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)納米凝膠置于37 ℃空氣浴中，在設定時間取出少許樣品直接用動態(tài)光散射儀測定散射光強。通過計算不同時間點的散射光強與初始散射光強的比值，分析降解過程中PVCL納米凝膠相對濁度的變化。以初始散射光強為參照標準，設相對濁度初始值為100%。

1.2.5MTT法細胞毒性實驗

細胞毒性通過常規(guī)的MTT法測定，采用人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)評價PVCL納米凝膠的生物相容性。HK-2細胞用DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)液。細胞株以每孔1×104個細胞的密度接種到96孔培養(yǎng)板上，在含有5% CO2的濕潤空氣氛圍下培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，并用新鮮磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，再分別加入新鮮的一定濃度的P(VCL-MBA-MAA)或P(VCL-BAC-MAA)。平行操作3份。48 h后，吸出孔內的上清液，用新鮮磷酸鹽緩沖溶液洗滌后在每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，使結晶物充分溶解。使用自動酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD490)。按下式計算細胞抑制率：

2結果與討論

2.1PVCL納米凝膠的粒徑(表1)

從表1可以看出，(1)交聯(lián)劑不同，得到的PVCL納米凝膠的粒徑也不同。如P(VCL-MBA4-MAA0)的粒徑(430 nm)遠大于P(VCL-BAC4-MAA0)的粒徑(212 nm)。這是因為，相比于BAC，MBA的親水性較好，因此與親水性的VCL更容易發(fā)生共聚，從而使開始形成的初始粒子更容易繼續(xù)共聚剩余的單體和寡聚物，形成較大的粒子。(2)隨著交聯(lián)劑MBA用量的增加，粒徑隨之增大。這是因為，MBA用量增加，致使VCL轉化率提高，聚合反應的單體總轉化率也提高，PVCL納米凝膠的粒徑相應增大[5]。(3)在BAC用量一定時，PVCL納米凝膠的粒徑隨MAA用量的增加逐漸增大，且具有較窄的粒徑分布(PI<0.1)。這是因為，隨著MAA用量的增加，PVCL納米凝膠中親水的PMAA鏈增多，親水性增強，更易膨脹，粒徑相應增大[11]。

表1PVCL納米凝膠的粒徑

注：MBA、MAA、BAC后的數(shù)字分別表示MBA、MAA、BAC相對于單體(VCL+MAA)的質量分數(shù)，%；D為在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中測得的粒徑；PI為粒徑的分散系數(shù)。

2.2紅外光譜分析(圖2)

由圖2可知，3種PVCL納米凝膠紅外光譜中，2 927～2 856 cm-1處均出現(xiàn)了-CH2的伸縮振動峰[12]，1 630 cm-1和1 481～1 439 cm-1處均出現(xiàn)了PVCL的酰胺C=O和C-N的特征峰[13]；在P(VCL-BAC4-MAA4)的紅外光譜中，1 726 cm-1處出現(xiàn)了明顯的肩峰，對應于PMAA中羰基的伸縮振動[13]。表明通過共聚MAA成功地將PMAA引入聚合物網(wǎng)絡中。

2.3拉曼光譜分析(圖3)

由圖3可知，在P(VCL-BAC4-MAA0)的拉曼光譜中，可清楚地看到510 cm-1處出現(xiàn)了二硫鍵(-S-S-)的特征吸收峰[14]，而P(VCL-MBA4-MAA0)的拉曼光譜中卻沒有出現(xiàn)。表明二硫鍵通過共聚交聯(lián)劑BAC已成功地引入聚合物網(wǎng)絡。

2.4透射電鏡分析(圖4)

由圖4可看出，納米凝膠P(VCL-BAC4-MAA0)和P(VCL-MBA4-MAA0)均呈均勻、規(guī)則的球狀形貌，并且前者的粒徑小于后者。表明交聯(lián)劑對PVCL納米凝膠的粒徑影響顯著，與表1結果相符。

BAC用量一定、MAA用量不同的PVCL納米凝膠的TEM照片如圖5所示。

由圖5可看出，所有納米凝膠粒子均呈均勻、規(guī)則的球狀形貌，粒徑隨著MAA質量分數(shù)的增加而增大，與PVCL納米凝膠的粒徑變化規(guī)律相符。

2.5PVCL納米凝膠的環(huán)境響應性

2.5.1溫度響應性

(1)溫度對PVCL納米凝膠粒徑的影響(圖6)

由圖6可知，2種PVCL納米凝膠均表現(xiàn)出明顯的溫度響應性，即隨著溫度的升高，PVCL納米凝膠變得疏水且開始收縮，表現(xiàn)為粒徑減??；MBA交聯(lián)的納米凝膠的VPTT(32.2 ℃)高于BAC交聯(lián)的納米凝膠

(30.3 ℃)。這是因為，MBA親水性較好，增強了粒子與水分子之間的相互作用，從而一定程度上限制了疏水性聚合物網(wǎng)絡的收縮。

(2)MAA用量對PVCL納米凝膠VPTT的影響(表2)

表2MAA用量對PVCL納米凝膠VPTT的影響

Tab.2 Effect of MAA dosage on VPTT of PVCL nanogels

由表2可知，隨著MAA用量的增加，BAC交聯(lián)的PVCL納米凝膠的VPTT逐漸升高。這是因為，隨著MAA用量的增加，聚合物鏈的親水性和靜電排斥作用均增強，破壞聚合物鏈之間親疏水作用的平衡需要較高的溫度，從而導致VPTT升高[15]。

2.5.2pH值響應性

(1)MAA用量對PVCL納米凝膠Zeta電勢的影響(表3)

表3MAA用量對PVCL納米凝膠Zeta電勢的影響

Tab.3Effect of MAA dosage on Zeta potential of PVCL nanogels

注：Zeta電勢在25 ℃、不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中測得。

PVCL納米凝膠由于共聚了親水性單體MAA，使其表面帶有羧基，因此表現(xiàn)出明顯的pH值響應性。由表3可知，PVCL納米凝膠的Zeta電勢與pH值和MAA用量有關。pH值越大、MAA用量越多，PVCL納米凝膠表面的負電荷就越多，Zeta電勢相應越低。

(2)pH值對PVCL納米凝膠粒徑和Zeta電勢的影響(圖7)

由圖7可知，P(VCL-BAC4-MAA3)的粒徑隨pH值的增大而增大，Zeta電勢隨pH值的增大而降低。這是因為，pH值的增大使粒子表面的負電荷增多，羧基之間的靜電排斥作用增強，粒子發(fā)生膨脹，因此粒徑增大。

2.5.3溫度/pH值耦合響應性

由表2可知，PVCL納米凝膠還具有溫度/pH值耦合響應性，VPTT隨著pH值的增大和MAA含量的增加而升高。對于P(VCL-BAC4-MAA3)納米凝膠，當pH值從5.5增大至7.4時，VPTT從28.5 ℃升高到47.5 ℃。pH值較大時，聚合物中的PMAA離子化程度高，使聚合物鏈之間靜電排斥作用增強，導致較高的VPTT，這與凝膠粒子在相應條件下電勢的變化相符(表3)。pH值較小時，羧基電離程度減弱，凝膠粒子表面負電荷減少，靜電排斥作用減弱，導致VPTT向低溫方向移動。如，在pH=5.5的酸性環(huán)境中，PMAA電離程度減弱，使聚合物鏈之間的靜電排斥作用減弱，降低了粒子的穩(wěn)定性[16]，造成MAA相對于單體質量分數(shù)小于3%的凝膠粒子在溫度達到VPTT之前就發(fā)生聚集，因此無法得到準確的VPTT值。

2.6PVCL納米凝膠的還原降解性

P(VCL-MBA4-MAA0)和P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值、10 mmol·L-1DTT中的相對濁度隨時間的變化如圖8所示。

由圖8可知，P(VCL-MBA4-MAA0)在不同pH值環(huán)境中均很穩(wěn)定，在24 h內相對濁度幾乎未發(fā)生變化；P(VCL-BAC4-MAA0)在不同pH值條件下的相對濁度均發(fā)生了不同程度的降低，表明粒子發(fā)生了降解。如，在pH=8.3和pH=7.4條件下，P(VCL-BAC4-MAA0)納米凝膠在30 min內幾乎完全降解；在pH=6.5條件下，150 min內相對濁度降低近50%。表明，還原劑DTT使粒子內部的二硫鍵發(fā)生斷裂而還原成巰基，粒子發(fā)生降解。由于DTT在高pH值條件下的還原能力較強，因此粒子降解的速度較快。

2.7PVCL納米凝膠的細胞毒性(圖9)

由圖9可知，在1～500 μg·mL-1濃度范圍內，兩種PVCL納米凝膠對HK-2細胞的生長均未產(chǎn)生明顯的抑制作用，即使在濃度高達100 μg·mL-1時，細胞的存活率仍然接近100%，這與PVCL納米凝膠具有良好的生物相容性有關。表明，PVCL納米凝膠的細胞毒性小、生物相容性好，非常適合用作藥物載體。

3結論

以N-乙烯基己內酰胺(VCL)為主單體、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)或N,N′-雙(丙烯酰)胱胺(BAC)為交聯(lián)劑、甲基丙烯酸(MAA)為親水性共聚單體，采用水相沉淀聚合法制備了刺激響應性PVCL納米凝膠，研究了交聯(lián)劑及MAA對PVCL納米凝膠性能的影響。紅外光譜和拉曼光譜表明，所制備的PVCL納米凝膠符合分子設計，電鏡下呈規(guī)則、均勻的球形；隨著交聯(lián)劑親水性和用量的增加、MAA用量的增加，制得的PVCL納米凝膠的粒徑增大；制備的PVCL納米凝膠粒子具有溫度/pH值響應性，MBA為交聯(lián)劑的PVCL納米凝膠在還原性介質中很穩(wěn)定，而BAC為交聯(lián)劑的PVCL納米凝膠在還原性介質中由于二硫鍵發(fā)生還原性斷裂而降解；制備的PVCL納米凝膠細胞毒性小、生物相容性好，適合用作藥物載體。

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Preparation and Performance of Stimuli-ResponsivePoly(N-vinylcaprolactam) Nanogel

WANG Yang,GU Zhun

(DepartmentofBiologicalandChemicalEngineering,SuzhouChien-ShiungInstituteofTechnology,Taicang215411,China)

Keywords：N-vinylcaprolactam(VCL);waterprecipitationpolymerization;nanogel;reductivedegradation;cytotoxicity

Abstract：UsingN-vinylcaprolactam(VCL)asamainmonomer,stimuli-responsivepoly(N-vinylcaprolactam)(PVCL)nanogelswerepreparedbyawaterprecipitationpolymerizationmethod.Theeffectsofcross-linker(MBAorBAC)andhydrophiliccomonomer(MAA)ontheperformanceofPVCLnanogelswereinvestigatedbyDLS,FTIR,RamanandTEM.ResultsindicatedthattheparticlesizeofPVCLnanogelsincreasedwithincreasingofthehydrophilicityofcross-linkerandthedosageofcross-linkerandcomonomerMAA.ThePVCLnanogelshadtemperatureandpHvalueresponsiveness,andtheycouldbedegradedinareductiveenvironment.ResultsofcytotoxicityexperimentindicatedthatPVCLnanogelspossessedlowcytotoxicityandexcellentbiocompatibility,thustheyweresuitableforusingasdrugcarriers.

基金項目：太倉市科技計劃應用基礎項目(TC2014YY02)，蘇州市生物醫(yī)藥綠色合成重點實驗室項目(SZSD201402)

收稿日期：2016-01-22

作者簡介：王楊(1979-)，女，江蘇連云港人，博士，講師，研究方向：醫(yī)用高分子材料，E-mail：wangyang_423@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.008

中圖分類號：O 632.7

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)06-0039-06