大鼠面神經(jīng)擠壓缺血損傷對巨噬細(xì)胞募集的影響

郭煜　歐陽火?！〕讨救A　羅聰　郭智霖

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大鼠面神經(jīng)擠壓缺血損傷對巨噬細(xì)胞募集的影響

郭煜歐陽火牛程志華羅聰郭智霖

【摘要】目的研究擠壓缺血損傷對面神經(jīng)修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞募集的影響，為治療外傷性面癱提供理論依據(jù)。方法60只雄性SD大鼠，隨機分為缺血組20只，單純擠壓組20只，對照組20只。缺血組給予左側(cè)面神經(jīng)擠壓并切斷面神經(jīng)表面營養(yǎng)血管，同時在手術(shù)顯微鏡下剝離神經(jīng)外膜（造成完全缺血）；單純擠壓組僅給予左側(cè)面神經(jīng)擠壓，保留表面營養(yǎng)血管；對照組為假手術(shù)組。于術(shù)后3 d、7 d、14 d檢測大鼠行為學(xué)及電生理變化；每組5只大鼠取材，切片行組織學(xué)觀察；使用巨噬細(xì)胞特異性抗體CD68進(jìn)行免疫組化染色，進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞募集情況。結(jié)果術(shù)后3 d缺血組及單純擠壓組均出現(xiàn)面癱表現(xiàn)；術(shù)后7 d時缺血組及單純擠壓組部分大鼠面癱情況較術(shù)后3 d加重，部分大鼠已出現(xiàn)面癱恢復(fù)跡象；術(shù)后14 d缺血組及單純加壓組大鼠面癱表現(xiàn)較7 d時均有恢復(fù)，但缺血組大鼠恢復(fù)速度明顯緩慢。電生理檢測顯示，隨時間延長，缺血組及單純擠壓組大鼠口輪匝肌復(fù)合動作電位最大波幅和潛伏期逐漸恢復(fù)，但均未達(dá)正常水平。缺血組恢復(fù)幅度較單純擠壓組小。組織學(xué)觀察顯示，缺血組大鼠術(shù)后免疫組化結(jié)果表明巨噬細(xì)胞逐漸增多，7 d時達(dá)到高峰；單純擠壓組同缺血組類似，但巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯多于缺血組；對照組無明顯陽性表達(dá)。結(jié)論面神經(jīng)局部營養(yǎng)血管的擠壓缺血損傷，可阻礙神經(jīng)修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的募集，最終阻礙神經(jīng)修復(fù)過程。

【關(guān)鍵詞】面神經(jīng)擠壓缺血損傷巨噬細(xì)胞募集

作者單位：200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科。

面神經(jīng)損傷是臨床的常見病，致傷原因包括物理和化學(xué)兩種因素。近年來，針對面神經(jīng)損傷后的再生機制和相關(guān)信號通路進(jìn)行了廣泛深入的研究，但其真正的再生機制仍無定論［1-4，7，14-15］。目前可以肯定的是，在外周神經(jīng)系統(tǒng)再生過程中，施旺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有非常重要的作用［2］，前者是構(gòu)成髓鞘的主要細(xì)胞（在中樞神經(jīng)系統(tǒng)為少突膠質(zhì)細(xì)胞），并在神經(jīng)損傷后吸引巨噬細(xì)胞聚集于損傷局部；后者的主要作用就是吞噬損壞的神經(jīng)組織，為新生的神經(jīng)組織創(chuàng)造一個良好的生長環(huán)境。本實驗擬在已建立的缺血損傷模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對巨噬細(xì)胞的增殖進(jìn)行研究，觀察缺血損傷對于巨噬細(xì)胞的募集的影響，并探討其與神經(jīng)再生進(jìn)程之間的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1實驗動物、器材及試劑

60只8周齡SD雄性大鼠（本院實驗動物中心提供），體質(zhì)量200～238 g。隨機分為擠壓傷伴缺血的缺血組（20只）；僅有擠壓傷的單純擠壓組（20只）；僅暴露面神經(jīng)不行任何處理的對照組（20只）。同時，行自身雙側(cè)對照。

Medelec Synergy T2生理記錄儀（Oxford Instruments，UK）；大鼠抗小鼠CD68單克隆抗體（Serotec，USA）。

1.2建立擠壓缺血模型

大鼠腹腔麻醉，無菌條件下沿左耳下1 cm處橫向切開皮膚及皮下筋膜，切口長2 cm。在外耳道軟骨前緣后，沿外耳道軟骨前緣附近解剖出面神經(jīng)主干，并向尾側(cè)鈍性分離至外耳道軟骨后緣，完全暴露面神經(jīng)。缺血組于面神經(jīng)出莖乳孔1 mm處用靜脈夾持續(xù)夾持3 min，然后手術(shù)顯微鏡下剝除神經(jīng)表面血管。單純擠壓組僅在面神經(jīng)出莖乳孔l mm處用動脈瘤夾持續(xù)夾持3 min。對照組暴露面神經(jīng)后不作任何處理。3組均在徹底止血后逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)。術(shù)后給予青霉素局部外用2 d，預(yù)防感染。

1.3術(shù)后大鼠的行為學(xué)評分

正常大鼠面部對稱，鼻端向前居中，雙側(cè)胡須運動對稱，角膜反射靈敏，無閉目不全等癥狀。術(shù)后分別于3 d、7 d、14 d觀察大鼠上述表現(xiàn)的變化。

角膜反射：用2 mL注射器18號針頭距離鼠眼3 cm處瞬間吹風(fēng)2 mL，比較雙側(cè)眨眼反射的頻度、速度和幅度。0分為雙側(cè)正常且對稱；1分為減弱或延緩；2分為消失。觸須運動的觀察：通過比較雙側(cè)觸須細(xì)微顫搐、節(jié)律性運動的程度進(jìn)行評分。0分為雙側(cè)運動正常且對稱；1分為觸須運動減弱；2分為消失。鼻尖位置居中為0分；偏斜為1分。最后，總分≥3分，即可判斷大鼠存在面神經(jīng)癱瘓。

1.4神經(jīng)電生理檢測

術(shù)后3 d、7 d、14 d分別對大鼠進(jìn)行面神經(jīng)顱外段電生理檢測，測定口輪匝肌復(fù)合電位的最大波幅及最大潛伏期。

1.5組織學(xué)檢測

于術(shù)后3 d、7 d、14 d時切取各組面神經(jīng)，多聚甲醛固定，脫水透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察。

1.6免疫組織化學(xué)染色

常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，60℃烤片1 h后脫蠟，PBS沖洗3 min，3次；體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下15 min，PBS沖洗3 min，3次；滴加山羊血清30 μL阻斷非特異性抗原，室溫15 min，傾去勿洗，滴加30 μL一抗（大鼠抗小鼠CD68），抗體1∶100稀釋，4℃濕盒過夜；PBS沖洗3 min，3次，滴加30 μL生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS沖洗3 min，3次，DAB室溫下避光顯色；鏡下控制，PBS沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。以PBS代替一抗作為空白對照，鏡下觀察并拍照。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

所有計數(shù)資料以（x±s）表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行配對t檢驗分析組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1行為學(xué)評分

缺血組及單純擠壓組大鼠術(shù)后3 d開始出現(xiàn)面癱表現(xiàn)，胡須活動減弱，角膜反射消失，鼻尖明顯側(cè)偏；對照組無任何變化。術(shù)后1周時，缺血組有5只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，6只大鼠胡須運動有所恢復(fù)，其余大鼠均無明顯恢復(fù)；單純擠壓組9只大鼠出現(xiàn)角膜反射恢復(fù)，12只胡須輕微運動；對照組大鼠無任何陽性改變。術(shù)后2周，缺血組有7只角膜反射明顯恢復(fù)，9只出現(xiàn)胡須運動，而所有大鼠鼻尖偏斜未有明顯改變；單純擠壓組有9只角膜反射明顯恢復(fù)，所有大鼠均不同程度出現(xiàn)胡須運動；對照組無任何變化。缺血組的恢復(fù)較單純擠壓組緩慢（表1）。

表1　各組術(shù)后3 d、7 d和14 d面神經(jīng)功能評分Table 1 The degree of facial nerve function at 3，7，14 days after operation

2.2電生理檢測

電生理檢測顯示，隨時間延長，缺血組及單純擠壓組大鼠口輪匝肌復(fù)合動作電位最大波幅和潛伏期逐漸趨向?qū)φ战M水平，但未完全恢復(fù)到對照組水平。缺血組恢復(fù)幅度較單純擠壓組?。ū?、圖1）。

表2　口輪匝肌復(fù)合動作電位最大波幅和潛伏期Table 2 The maximum amplitude and latency of Orbicularis oris muscle compound action potential

2.3組織學(xué)觀察

2.3.1HE染色

術(shù)后3 d，缺血組及單純擠壓組軸突均出現(xiàn)腫脹變形，缺血組腫脹更為明顯，呈條索狀，基底膜腔腫脹，呈串珠狀［7-11］。對照組面神經(jīng)結(jié)構(gòu)規(guī)整，神經(jīng)纖維規(guī)則，軸突無明顯腫脹及崩解，髓鞘無退變及崩壞。術(shù)后7 d，缺血組軸突腫脹加劇，部分崩解消失，髓鞘不連續(xù)或已消失成空泡狀［8-9］；單純擠壓組神經(jīng)纖維情況與缺血組相似，但變性程度明顯較輕。術(shù)后14 d，缺血組大量神經(jīng)纖維崩解壞死，神經(jīng)結(jié)構(gòu)紊亂，部分神經(jīng)內(nèi)膜連續(xù)性好，遺留神經(jīng)纖維壞死輪廓；單純擠壓組腫脹逐漸消退，慢慢恢復(fù)正常（圖2）。

2.3.2免疫組化染色

對照組在術(shù)后3d、7d、14d時，CD68陽性表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異；缺血組及單純擠壓組從術(shù)后3 d開始CD68陽性表達(dá)逐漸增高，在術(shù)后1周時達(dá)到峰值［10-18］，而后逐漸減少。缺血組及單純擠壓組對比，缺血組巨噬細(xì)胞的募集數(shù)量少于單純擠壓組，這可能與離斷了神經(jīng)營養(yǎng)血管后，外源性巨噬細(xì)胞無法到達(dá)損傷部位有關(guān)。

術(shù)后3d時，CD68陽性細(xì)胞缺血組（0.20±0.006 個/視野），單純擠壓組（0.40±0.005個/視野），對照組（0.01±0.005個/視野）。

術(shù)后7d時，缺血組（0.29±0.007個/視野），單純擠壓組（0.66±0.008個/視野），對照組（0.01±0.005 個/視野）。缺血組及單純擠壓組的陽性細(xì)胞數(shù)量均高于對照組，缺血組的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于單純擠壓組（P＜0.05）。對照組較術(shù)后3 d無明顯變化。

術(shù)后14d時，缺血組（0.20±0.001個/視野），單純擠壓組（0.46±0.003個/視野），對照組（0.01±0.005 個/視野）。缺血組和單純擠壓組陽性細(xì)胞數(shù)量與術(shù)后7 d時比較均呈明顯減少趨勢，缺血組減少數(shù)量明顯多于單純擠壓組（P＜0.05），對照組則無明顯變化。

綜上所述，對照組術(shù)后3d、7d、14d陽性細(xì)胞表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義；缺血組和單純擠壓組陽性細(xì)胞于術(shù)后3d起均開始增多，術(shù)后7d達(dá)到高峰，術(shù)后14d數(shù)量減少，但缺血組陽性表達(dá)數(shù)的高峰較單純擠壓組低，數(shù)量減少幅度較單純擠壓組大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3-4）。

圖1　口輪匝肌復(fù)合電位最大波幅及潛伏期變化趨勢Fig. 1 Change trends of the maximum amplitude and latency of orbicularis oris muscle

圖2　術(shù)后7d各組HE染色結(jié)果（400×）Fig. 2 Histological observation by HE staining in each group 7 days after operation（400×）

圖3　術(shù)后7 d各組CD68表達(dá)情況（400×）Fig. 3 CD68 expression in each group 7 days after operation（400×）

圖4　各組CD68表達(dá)的變化趨勢Fig. 4 Change trend of CD68 expression in each group

3　討論

面神經(jīng)由于解剖位置的特殊性，容易受到損傷而造成面癱，影響患者的生活和社交。面神經(jīng)損傷后的修復(fù)和再生涉及一系列復(fù)雜的細(xì)胞和分子生物學(xué)改變［8-11］。

周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）不同［14-15］，損傷后具有較強的再生能力［7-14］，再生過程涉及神經(jīng)元的再生以及非神經(jīng)細(xì)胞（包括雪旺細(xì)胞和一些免疫細(xì)胞）的募集。巨噬細(xì)胞是神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有關(guān)鍵作用的一類免疫細(xì)胞。神經(jīng)損傷后，大量的巨噬細(xì)胞聚集在損傷部位，這不僅是華勒氏變性（Wallerian degeneration）所必須的，更是清除崩壞的髓鞘和吞噬神經(jīng)殘端，為神經(jīng)再生提供良好的環(huán)境所必要的。大量的坐骨神經(jīng)單純擠壓損傷模型闡明了巨噬細(xì)胞的吞噬功能可為神經(jīng)再生提供一個適宜的微環(huán)境。面神經(jīng)損傷后，受損部位遠(yuǎn)心端發(fā)生華勒氏變性，軸索和髓鞘變性壞死，形成碎片，局部雪旺細(xì)胞活化增生，在吞噬碎片的同時，釋放巨噬細(xì)胞趨化因子和神經(jīng)生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)和表面黏著分子等。巨噬細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)大量巨噬細(xì)胞聚集，并吞噬清除軸突和髓鞘破損碎片，創(chuàng)造一個適宜面神經(jīng)再生的局部環(huán)境［1-2］。而巨噬細(xì)胞到達(dá)損傷部位的主要途徑就是血流［12-13］，因此在各種原因引起的神經(jīng)營養(yǎng)血管的損傷（切割，局部水腫壓迫等）均會延緩甚至阻斷面神經(jīng)的再生過程。

本實驗基于大鼠面神經(jīng)缺血模型［2］，進(jìn)一步探討單純損傷和神經(jīng)血供缺失后巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況。通過大體行為學(xué)評估以及電生理檢測等手段，我們觀測到面神經(jīng)缺血損傷的恢復(fù)過程要較單純損傷更漫長，恢復(fù)的效果也較差。我們發(fā)現(xiàn)，缺血損傷后的巨噬細(xì)胞雖然在變化趨勢上與單純損傷組一致，但表達(dá)數(shù)量較單純損傷組要少。因此我們認(rèn)為，面神經(jīng)局部營養(yǎng)血管的缺失直接導(dǎo)致了神經(jīng)修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞募集的障礙，損傷神經(jīng)周圍崩壞的髓鞘碎片以及神經(jīng)殘端無法及時有效清除，使神經(jīng)再生過程無法在一個適宜的環(huán)境中進(jìn)行，最終阻礙了神經(jīng)修復(fù)過程。

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·論著·

The Effect of Facial Nerve Crush Injury and Ischemia on the Recruitment of Macrophages in Rats

GUO Yu，OUYANG Huoniu，CHENG Zhihua，LUO Cong，GUO Zhilin. Department of Neurosurgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China. Corresponding author: GUO Zhilin（E-mail: gzlysr@126.com）.

【Abstract】ObjectiveTo study the influence of the facial nerve crimping ischemia injury on the recruitment of macrophage in rats，and to provide theoretical basis for clinical application of traumatic facial paralysis. Methods Sixty SD rats were randomly divided into 3 groups：20 in ischemia（extrusion+ischemia）group；20 in extrusion（extrusion only）group；20 in control group. Rats in ischemia group received an operation that extruding the left facial nerve，cutting off the surface nutrition blood vessels of the facial nerve and stripping epineurium under operating microscope（ischemia completely）；The rats in extrusion group just received the extrusion on the left facial nerve but the nutrition blood vessels were preserved；The control group rats served as sham group. At 3 days，7 days，14 days after operation，behavioral observation and electrophysiological detection were given to each group. After assessment，5 rats were sacrificed in every group for immunohistochemistry（using macrophage specific antibody CD68），in order to study macrophages further. Results 1. Behavioral observation：At 3 days after operation，all rats in ischemia group and extrusion group showed facial paralysis. Then，at 7 days after operation，part of the rats' facial paralysis were aggravated，the other rats had recovery performance；At 14 days after operation，facial paralysis recovery was observed in experimental groups. However，the recovery rate of the ischemia group is significantly slower. 2. Electrophysiological detection：With the extension of time，orbicularisoris muscles compound action potential maximum amplitude and latency period in ischemia group and extrusion group were gradually approached to the control group. But didn’t achieve the normal level. The recovery rate in ischemia group was relatively lower than in extrusion group. 3. Histological observation：Immunohistochemical results showed that the macrophages gradually increased in ischemia group，until reached a peak at 7 days after operation；The result in extrusion group wassimilar but the number of macrophages was more than in ischemic group；No significant positive expression was observed in control group. ConclusionFacial nerve crush injury and ischemia can hinder the recruitment of macrophages，eventually hinder the process of nerve repair.

【Key words】Facial nerve；Crush Injury and Ischemia；Macrophages；Recruitment

【中圖分類號】R651.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）02－0102－05

通訊作者：郭智霖（E-mail：gzlysr@126.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.004

收稿日期：（2016年1月20日；修回日期：2016年3月2日）