3種含重金屬制劑的微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

管敏 周琴妹

摘要：目的 建立定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏3種含重金屬制劑的微生物限度檢查方法。方法 按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）的規(guī)定測定3種制劑對細(xì)菌、真菌和酵母菌的回收率，并對其控制菌檢查方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 定癇丸采用培養(yǎng)基稀釋法、皮脂搽劑采用預(yù)濾過和培養(yǎng)基稀釋法聯(lián)用、加味黃芩油膏采用萃取法處理樣品，5株菌回收率均可達(dá)70%以上，控制菌檢查也分別采用相應(yīng)的方法。結(jié)論 本研究建立了定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏3種不同劑型含重金屬制劑的微生物限度檢查方法。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基稀釋法；萃取法；重金屬；微生物限度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.026

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0101-03

Verification of Microbial Limit Test Methods for Three Kinds of Preparations with Heavy Metals GUAN Min， ZHOU Qin-mei （Pharmacy Department of Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

Abstract： Objective To establish the methods of microbial limit test for three kinds of preparations with heavy metals， such as Dingxian Pills， Pizhi Lotion and Jiawei Huangqin Ointment. Methods According to Chinese Pharmacopoeia 2010， the recovery rates of bacteria， fungus and yeast treated by three preparations were detected. And the methods of testing control bacteria were also validated. Results Culture medium dilution method was proved to be applicable for Dingxian Pills. Culture medium dilution method combined with pre-filtration method was proper for Pizhi Lotion. And the extraction method was adopted for Jiawei Huangqin Ointment. The recovery rates of these five validation strains reached 70% by appropriate methods. And the same methods were used for validation of the control bacteria. Conclusion The methods of microbial limit test for these three different preparations were established through this study.

Key words： culture medium dilution method； extraction method； heavy metals； microbial limit test

定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏均為本院制劑，臨床使用多年。定癇丸為口服丸劑，用于痰迷驚厥、牙關(guān)緊閉、抽搐痙攣等癲癇病癥。皮脂搽劑和加味黃芩油膏分別為外用酊劑和油膏劑，具有解毒、止癢等功效。該3種制劑為不同劑型，且都含有重金屬成分，已知重金屬砷、汞等對微生物的生長有抑制作用[1-2]，本研究按照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）[3]的要求，采用合適的樣品處理方法，如培養(yǎng)基稀釋法、預(yù)濾過法、萃取法或幾種方法聯(lián)用，消除3種制劑的抑菌作用后再進(jìn)行檢驗(yàn)，以期獲得更可靠、更準(zhǔn)確的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

YX-280 D-TT手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰

基金項(xiàng)目：江蘇省中醫(yī)院科研項(xiàng)目（Y13043）

通訊作者：周琴妹，E-mail：zhoumeizi0917@163.com

醫(yī)療設(shè)備有限公司），DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申賢儀器設(shè)備廠），MJ-100B霉菌培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司），100級潔凈工作臺（AIR TECH，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科技有限公司），滅菌移液管（1、5、10 mL）及無菌培養(yǎng)皿（90 mm）。

供試品定癇丸（由朱砂、青果、貝母等組成，批號1501001、1503002、1505003）、皮脂搽劑（由硫磺、白礬、輕粉組成，批號1505005、1505006、1507007）和加味黃芩油膏（由輕粉、石膏、冰片、枯礬、黃芩等組成，批號1412005、1503001、1507003）均由本院制劑部生產(chǎn)。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]，均由江蘇省藥檢所提供，傳代次數(shù)均為第4代。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號131224）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號070313）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號1110203）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號1401132）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號1401072）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號050407）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG，批號101020）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號100128）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號150513），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號1306192），均購自北京三藥科技開發(fā)公司。0.9%無菌氯化鈉溶液（本實(shí)驗(yàn)室配制）。

2 方法

2.1 供試液的制備

2.1.1 定癇丸 稱取本品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中至100 mL，振蕩箱中45 ℃振搖30 min，倒入研缽中研磨均勻，作為1∶10供試液。

2.1.2 皮脂搽劑 本品振搖均勻，量取10 mL，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液，采用脫脂棉對供試液進(jìn)行預(yù)過濾[3]，去除沉淀，濾液備用。

2.1.3 加味黃芩油膏 稱取樣品10 g于無菌研缽中，加入無菌十四烷酸異丙酯20 mL，研磨均勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入45 ℃、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖5 min，靜置，使油水分層，取水層，作為1∶10的供試液[4]。

2.2 菌液制備

大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌新鮮培養(yǎng)物接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于35 ℃培養(yǎng)24 h；白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化溶液10倍稀釋至相應(yīng)濃度，制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液。黑曲霉新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d，加入0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液。

2.3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)

2.3.1 菌落培養(yǎng)及計(jì)數(shù) ①常規(guī)方法：取供試液1 mL及試驗(yàn)用菌的各種菌液1 mL，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于相應(yīng)溫度條件下倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。②培養(yǎng)基稀釋法：取供試液1 mL平均加至多個(gè)平皿中，加入試驗(yàn)用菌的各種菌液1 mL，培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。試驗(yàn)組加供試液及各試驗(yàn)菌液，菌液組不加供試液，供試品對照組不加菌液，稀釋劑對照組用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，其余操作方法相同。

2.3.2 回收率計(jì)算 以上試驗(yàn)重復(fù)3次，分別計(jì)算5種試驗(yàn)菌株的回收率。稀釋劑對照組回收率（%）=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)÷菌液組平均菌落數(shù)×100%。試驗(yàn)組回收率（%）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）÷菌液組平均菌落數(shù)×100%。

2.4 控制菌檢查

2.4.1 大腸埃希菌 ①試驗(yàn)組：取定癇丸1∶10供試液10 mL及1 mL大腸埃希菌（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入200 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再進(jìn)行MUG試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)。②空白對照組：取1∶10供試液10 mL，加入200 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再進(jìn)行MUG試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)。③陰性組：1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入200 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)48 h后，再進(jìn)行MUG試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)。

2.4.2 金黃色葡萄球菌 ①試驗(yàn)組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL及1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。②空白對照組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL，加入適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。③陰性組：1 mL大腸埃希菌（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養(yǎng)24 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

2.4.3 銅綠假單胞菌 ①試驗(yàn)組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL及1 mL銅綠假單胞菌液（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入適量膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，振搖均勻，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。②空白對照組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL，加入適量膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，振搖均勻，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。③陰性組：1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數(shù)為10～100 cfu），加入適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35～37 ℃培養(yǎng)24 h，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落及菌落形態(tài)，判斷結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證

定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏采用常規(guī)方法驗(yàn)證的回收率不滿足要求。①定癇丸采用培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證（0.5 mL/皿），其抑菌作用基本被消除，5種菌回收率均>70%，可采用培養(yǎng)基稀釋法檢查細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)。②皮脂搽劑的溶劑為60%乙醇，其中有白礬、輕粉為不溶性沉淀，配成1∶10供試液之后，硫磺不溶于水也析出，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這些沉淀具有較強(qiáng)抑菌作用，故先采用脫脂棉對供試液進(jìn)行預(yù)過濾[3]，去除沉淀，濾液再采用培養(yǎng)基稀釋法驗(yàn)證，稀釋劑對照組和5種試驗(yàn)菌的回收率均>70%。③加味黃芩油膏中含黃芩、黃柏、枯礬、輕粉等，具有較強(qiáng)的抑菌活性，因其基質(zhì)為凡士林，采用乳化劑研磨均勻后也不能通過濾膜，無法采用薄膜過濾法消除其抑菌活性，故將加味黃芩油膏用十四烷酸異丙酯溶解，采用萃取法處理樣品，并聯(lián)合使用培養(yǎng)基稀釋法，稀釋劑對照組回收率>70%，5株試驗(yàn)菌的回收率>70%。結(jié)果見表1。

3.2 控制菌驗(yàn)證

定癇丸采用培養(yǎng)基稀釋法檢查大腸埃希菌，結(jié)果見表2。皮脂搽劑和加味黃芩油膏按“2.1”項(xiàng)下方法處理，采用培養(yǎng)基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗(yàn)組均可檢出，陰性組和空白對照組未檢出，滿足要求，結(jié)果見表3。

4 討論

定癇丸加稀釋劑后振搖30 min（45 ℃、150 r/min），充分崩解，研磨后能分散均勻。制丸之后采用朱砂包衣，其中硫化汞含量較低，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿）即可消除其抑菌作用，5種菌回收率均>70%。

皮脂搽劑為含有硫磺、白礬、輕粉的混懸液，溶劑為60%（V/V）的乙醇，制成1∶10供試液后，溶劑性質(zhì)改變，硫磺不溶于水而析出，這些沉淀一方面有較強(qiáng)抑菌作用，另一方面也影響平皿中菌落的計(jì)數(shù)。采用500 r/min低速離心5 min，仍有一部分沉淀浮于液面，故考慮用預(yù)過濾法進(jìn)行粗濾去除沉淀。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，用濾紙過濾，過濾后菌液濃度降低70%～80%，影響樣品中微生物的檢出；用無菌脫脂紗布和脫脂棉過濾，過濾前后菌液的濃度基本保持一致，但紗布對微小懸浮物的濾除作用差[4]。故本試驗(yàn)采用脫脂棉進(jìn)行預(yù)過濾，而后濾液用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行檢查，回收率能夠達(dá)到70%以上。

加味黃芩油膏以凡士林為基質(zhì)，含輕粉、石膏、冰片、枯礬及黃芩提取液等，具有較強(qiáng)的抑菌活性。曾采用中和法和培養(yǎng)基稀釋法，均不能完全消除抑菌活性。這類以凡士林、羊毛脂等為基質(zhì)的軟膏劑應(yīng)盡量避免使用薄膜過濾法，因?yàn)橛椭曰|(zhì)過膜困難，很容易堵塞濾膜。故采用十四烷酸異丙酯溶解樣品，pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液萃取出樣品中的微生物，作為供試液，再聯(lián)合培養(yǎng)基稀釋法，可消除加味黃芩油膏的抑菌活性，5株菌的回收率滿足要求。

含重金屬制劑的微生物限度檢查，可優(yōu)先選擇中和法或培養(yǎng)基稀釋法，重金屬含量高或還有其他抑菌成分的制劑可聯(lián)合使用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過濾法、萃取法等。定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏分別為丸劑、搽劑和軟膏劑，本研究選取這3種具有代表性的制劑進(jìn)行研究，為含有重金屬、具有抑菌活性制劑的微生物限度檢查方法的選擇提供了參考依據(jù)。

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（收稿日期：2015-08-13）

（修回日期：2015-09-01；編輯：陳靜）