大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織形態(tài)及IgE水平的影響

鐘大玲 吳佳佳 李根茂 葛東宇 吳珺 彭桂英

摘要：目的 觀察大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化、肺指數(shù)、脾指數(shù)以及總IgE水平的影響，探討其相關(guān)作用機(jī)制。方法 采用卵白蛋白致敏加激發(fā)的方式建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型。將20只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、大承氣湯組和陽(yáng)性藥組，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃。測(cè)定各組小鼠肺指數(shù)、脾指數(shù)，ELISA測(cè)定血清IgE含量，HE染色進(jìn)行病理觀察。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠肺指數(shù)增加，血清IgE含量明顯升高（P<0.01），肺組織出現(xiàn)炎性病理改變；與模型組比較，大承氣湯組和陽(yáng)性藥組小鼠肺指數(shù)明顯降低（P<0.05），血清IgE含量明顯降低（P<0.01），肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善。結(jié)論 大承氣湯對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥有抑制作用。

關(guān)鍵詞：過(guò)敏性哮喘；肺腸同治；大承氣湯；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.015

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0058-03

Effects of Dachengqi Decoction on Pulmonary Histology and Total IgE Levels in Mice with Allergic Asthma ZHONG Da-ling， WU Jia-jia， LI Gen-mao， GE Dong-yu， WU Jun， PENG Gui-ying （School of Basic Medical Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract： Objective To explore the effects of Dachengqi Decoction on morphological changes， lung and spleen indexes， and total IgE levels of mice with allergic asthma； To discuss it relevant mechanism of action. Methods The method of OVA sensitization and provocation was used to establish allergic asthma mice models. 20 C57BL/6 mice were randomly divided into control group， model group， Dachengqi Decoction group and dexamethasone positive group. Each medication group was given relevant medicine for gavage. Lung and spleen indexes in each group were detected. The total IgE levels in serum of mice were detected by ELISA， and HE staining was used to conduct pathological observation. Results Compared with control group， the lung index and level of IgE in model group increased significantly and pulmonary histological results showed abundant inflammatory cells infiltrated in the bronchus； compared with the model group， the lung index as well as the levels of IgE decreased significantly in the Dachengqi Decoction and dexamethasone positive group （P<0.05）， and the lung tissue organization form was improved significantly. Conclusion Dachengqi Decoction has inhibiting effects on pulmonary inflammation of mice with asthma.

Key words： allergic asthma； treatment of lung and large intestine； Dachengqi Decoction； mice

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81473656）；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2011-CXTD-04）

通訊作者：彭桂英，E-mail：edweiss@163.com

支氣管哮喘是一種以淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞反應(yīng)為主的慢性氣道炎癥性疾病，嚴(yán)重影響日常生活，給患者個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前西醫(yī)對(duì)哮喘的治療，主要是通過(guò)吸入糖皮質(zhì)激素抑制氣道炎癥，以及使用支氣管舒張劑緩解支氣管收縮，長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)大。因此，尋找新的方法防治哮喘具有重要意義。肺腸理論是臟腑相合理論的重要內(nèi)容之一，臨床上一直用以指導(dǎo)肺部疾病的治療，尤其是在慢性阻塞性肺疾病和哮喘的治療上具有較好的療效[1-2]。本研究以大承氣湯為方藥，以過(guò)敏性哮喘小鼠為動(dòng)物模型，以肺組織形態(tài)學(xué)、肺脾指數(shù)及IgE水平為切入點(diǎn)，探究“肺腸同治”法的科學(xué)內(nèi)涵。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，雌性，鼠齡6～8周，體質(zhì)量18～20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房屏障系統(tǒng)，溫度（25±1）℃，濕度40%～60%，自由飲食、飲水。

1.2 藥物及制備

大承氣湯（大黃12 g，枳實(shí)12 g，厚樸24 g，芒硝9 g）飲片均購(gòu)自北京同仁堂總店，按人體質(zhì)量藥量換算小鼠給藥量為19 g/kg。藥物浸泡30 min后，先武火煎煮10 min，再文火煎煮20 min，煎煮2次，合并煎液，將所得藥液用雙層紗布過(guò)濾，濃縮至濃度為1.9 g原藥材/mL，4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。地塞米松片，天津力生制藥有限股份有限公司，批?0140706。

1.3 主要試劑與儀器

IgE ELISA Kit（Bio legend），批號(hào)PD201123；卵白蛋白（OVA，Sigma-Aldrich），批號(hào)SLBK1339V；PBS（Invitrogen），批號(hào)1627690；氫氧化鋁凝膠（Pierce），批號(hào)B192991。醫(yī)用霧化器（PARI Turbo BOY N），5415型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），酶標(biāo)儀DNM- 96021（瑞士Tecan公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus Co）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、大承氣湯組和陽(yáng)性藥組，每組5只。參照文獻(xiàn)[3]方法，采用OVA致敏激發(fā)方式構(gòu)建哮喘小鼠模型。第0、14日每只小鼠腹腔注射含20 ?g OVA和2 mg氫氧化鋁的凝膠混懸液0.2 mL，第21～25日將其置10 cm×20 cm×30 cm自制霧化箱中，用含1%OVA溶液8 mL霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每日1次。

大承氣湯組給予大承氣湯藥液灌胃，陽(yáng)性藥組給予地塞米松（5 mg/kg）藥液灌胃，模型組和正常組給予PBS灌胃。灌胃體積0.2 mL/只。各組于末次霧化12 h后取材。

2.2 血清總IgE含量測(cè)定

眼球取血，室溫靜置2 h后，離心收集上清，分裝后凍存于-20 ℃冰箱。ELISA檢測(cè)總IgE含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

2.3 肺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定

稱(chēng)重后，脫頸處死小鼠，打開(kāi)胸腔取出肺臟，摘除氣管、肺門(mén)淋巴結(jié)等組織，吸干肺臟表面血液，稱(chēng)取肺臟質(zhì)量。同時(shí)打開(kāi)腹腔，取出脾臟，吸干表面液體，稱(chēng)取脾臟質(zhì)量。計(jì)算出肺指數(shù)（小鼠肺質(zhì)量÷小鼠體質(zhì)量×100%）和脾指數(shù)（小鼠脾質(zhì)量÷小鼠體質(zhì)量×100%）。

2.4 肺組織病理觀察

選取左肺上葉組織快速置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

正常組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定，毛色順滑有光澤，活動(dòng)自如；模型組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)抓耳撓鼻、狂躁不安、喘息、呼吸急促、弓背等表現(xiàn)；經(jīng)藥物治療后，上述癥狀均減輕、且持續(xù)時(shí)間較短。

4.2 大承氣湯對(duì)模型小鼠肺指數(shù)、脾指數(shù)及血清IgE含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肺指數(shù)、脾指數(shù)和血清IgE含量增高（P<0.01）；與模型組比較，大承氣湯組肺指數(shù)降低、脾指數(shù)升高（P<0.05），陽(yáng)性藥組肺指數(shù)和脾指數(shù)均降低（P<0.01），大承氣湯組和陽(yáng)性藥組IgE含量降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

4.3 病理觀察結(jié)果

正常組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，呈現(xiàn)正常肺組織形態(tài)；模型組可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)且出現(xiàn)黏液栓，周?chē)M織水腫，上皮損傷且纖維化，氣道平滑肌肥大、增生；大承氣湯組和陽(yáng)性藥組可見(jiàn)支氣管及血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)減少，周?chē)M織水腫減輕，氣道上皮損傷、纖維化及基底膜增厚等減輕。結(jié)果見(jiàn)圖1。

5 討論

在“肺與大腸相表里”理論的指導(dǎo)下，近年來(lái)學(xué)者對(duì)肺腸軸進(jìn)行了較深入的研究，進(jìn)一步闡明了肺與大腸相表里的分子水平機(jī)制，并逐漸發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療過(guò)敏性哮喘相關(guān)炎性疾病有其獨(dú)特的方藥和理法。徐氏等[4]研究表明，大承氣湯對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠有明顯的治療作用。因此，本課題以過(guò)敏性哮喘小鼠為動(dòng)物模型，大承氣湯為方藥，挖掘“肺腸同治”的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。大承氣湯首載于《傷寒論》，由大黃、芒硝、枳實(shí)、厚樸4味藥組成，具有攻下實(shí)熱、消除痞滿(mǎn)之功，主治陽(yáng)明腑實(shí)證，是“肺腸同治”法的代表方。方中大黃與芒硝瀉腑通便，大便通暢，大腸傳導(dǎo)功能正常，則有助于肺氣宣降；枳實(shí)、厚樸相須為用，既能行氣破滯散結(jié)，又能降肺氣以平喘消痰。諸藥合用，暢通氣機(jī)，瀉下實(shí)熱，蕩滌燥結(jié)，相得益彰。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)敏性哮喘小鼠發(fā)作期出現(xiàn)明顯的呼吸喘促、狂躁、打噴嚏及頻繁撓鼻，而給予大承氣湯治療后上述癥狀均有所改善。模型組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管上皮損傷甚至纖維化、增生，而大承氣湯治療后肺組織形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)。劉氏等[5]發(fā)現(xiàn)僅以芒硝刺激大腸，有助于改善氣道通氣并抑制哮喘小鼠肺部炎癥，這更進(jìn)一步證實(shí)了本結(jié)果的可靠性。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)大承氣湯能有效降低哮喘小鼠肺指數(shù)，這從另一個(gè)角度印證了其減輕肺部炎癥的效果，與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[6]。而大承氣湯治療后哮喘小鼠脾指數(shù)不降反而上升，推測(cè)其前述抑制炎癥作用可能與促進(jìn)淋巴細(xì)胞向不同方向分化有關(guān)，而非抑制淋巴細(xì)胞的增殖。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)大承氣湯能顯著降低哮喘小鼠總IgE含量，這與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者使用從腸治肺或肺腸合治法能顯著降低哮喘小鼠血清中總IgE含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[5，7]?？紤]到IgE是過(guò)敏性哮喘發(fā)生過(guò)程中重要的介導(dǎo)因素，其含量的增加與過(guò)敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]，而現(xiàn)代免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，IgE的產(chǎn)生與2型輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-4（IL-4）密切相關(guān)[9]，實(shí)際上我們發(fā)現(xiàn)大承氣湯同樣可以降低哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4的水平。這進(jìn)一步證實(shí)大承氣湯可能通過(guò)降低哮喘小鼠IgE含量，從而減輕肥大細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)，導(dǎo)致哮喘小鼠肺部炎癥程度的緩解。這同時(shí)表明“肺腸同治”法的可行性。

綜上所述，大承氣湯能夠通過(guò)降低過(guò)敏性哮喘小鼠血清IgE的含量，改善哮喘小鼠肺指數(shù)的升高。本研究為“肺腸同治”法提供了詳實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，大承氣湯引起哮喘小鼠脾指數(shù)升高從另一個(gè)側(cè)面提示我們需要進(jìn)一步研究其具體的機(jī)制。

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（收稿日期：2015-12-24；編輯：華強(qiáng)）