手足口病中醫(yī)證型與血清炎性細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞相關(guān)性分析

黃偉 李芹

摘要：目的 研究手足口?。℉FMD）肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及CD3+、CD4+、CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞之間的相關(guān)性。方法 隨機(jī)選取90例HFMD患者，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證各30例，檢測血清炎性細(xì)胞因子（IL-6、PCT、CRP）、T細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）、NK細(xì)胞等指標(biāo)，分析上述指標(biāo)在各證型間的分布情況。結(jié)果 毒熱動(dòng)風(fēng)證IL-6、PCT、CRP水平明顯高于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞絕對(duì)值毒熱動(dòng)風(fēng)證與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD3+細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與濕熱郁蒸證組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CD4+細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與濕熱郁蒸證組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD8+、NK細(xì)胞百分比毒熱動(dòng)風(fēng)證組與肺脾濕熱證組、濕熱郁蒸證組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 HFMD肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證在相關(guān)炎性細(xì)胞因子、促炎標(biāo)志物及T細(xì)胞亞群等方面不僅與發(fā)病有關(guān)，并且與病情輕重及預(yù)后密切相關(guān)，能夠較為有效地評(píng)估病情及判斷預(yù)后。

關(guān)鍵詞：手足口??；白細(xì)胞介素-6；降鈣素原；C反應(yīng)蛋白；T細(xì)胞亞群

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.005

中圖分類號(hào)：R259.125 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）07-0017-05

Analysis on Correlation Between TCM Syndromes of Hand， Foot and Mouth Disease and Serum Proinflammatory Cytokines， T Cell Subgroup and NK Cells HUANG Wei， LI Qin （Fuzhou Infectious Disease Hospital， Fuzhou 350000， China）

Abstract： Objective To study the correlation between hand， foot and mouth disease （HFMD） in lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， and syndrome of stirring wind due to toxic-heat with IL-6， PCT， CRP， CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells. Methods Ninety patients with HFMD were randomly selected， dividing into lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， and syndrome of stirring wind due to toxic-heat， 30 cases for each syndrome. IL-6， PCT， CRP， CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells were detected， and the distribution of above indicators in the three syndromes were analyzed. Results Levels of IL-6， PCT and CRP in syndrome of stirring wind due to toxic-heat were significantly higher than those in lung-spleen damp-heat syndrome and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， with statistical significance （P<0.01）； There was statistical significance in absolute value counting of CD3+， CD4+， CD8+ and NK cells among the three syndromes （P<0.01）； There was statistical significance in the percentage of CD3+ cells in syndrome of stirring wind due to toxic-heat and lung-spleen damp-heat syndrome （P<0.01） and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat （P<0.05）； There was statistical significance in the percentage of CD4+ cells

基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治（2012ZX10004301-005）；福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013-S-wt8）

通訊作者：李芹，E-mail：liqing05912006@163.com

syndrome of stirring wind due to toxic-heat and lung-spleen damp-heat syndrome （P<0.05） and syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat （P<0.01）； There was statistical significance in the percentages of CD8+ and NK cells in the three syndromes （P<0.01）. Conclusion Proinflammatory cytokines， proinflammatory markers， and T cell sub-group related to HFMD in lung-spleen damp-heat syndrome， syndrome of stagnation and steaming due to damp-heat， syndrome of stirring wind due to toxic-heat are not only correlative with morbidity， but also with the severity of diseases and prognosis， which can relatively effectively evaluate the state of diseases and judge prognosis.

Key words： hand， foot and mouth disease； IL-6； calcitonin original； C-reactive protein； T cell sub-group

手足口?。℉FMD）是一種常見兒童感染性疾病，約70%是由柯薩奇病毒A 16型（COX A16）和腸道病毒71型（EV71）引起[1-2]，主要癥狀為發(fā)熱、手足臀等部位及口腔出現(xiàn)斑丘疹或皰疹[3]?！妒肿憧诓≡\療指南（2010年版）》[4]將該病分為肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證、心陽衰微肺氣欲脫證4種證型。根據(jù)本院收治患兒特點(diǎn)及病例數(shù)量，患兒大多集中在肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證這3個(gè)證型。本研究采集HFMD患者血液樣本，對(duì)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、T細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）等指標(biāo)進(jìn)行檢測，分析HFMD不同證型在上述檢測指標(biāo)之間的差異及相關(guān)性，為中醫(yī)在臨床工作中與實(shí)驗(yàn)室理化指標(biāo)相結(jié)合提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究病例均來自福州市傳染病醫(yī)院感染科門診2014年8月-2015年6月收治的HFMD患者。按隨機(jī)數(shù)字法選取90例，入院即按順序編號(hào)，然后按隨機(jī)數(shù)表第一行第一列分配隨機(jī)數(shù)，3種證型的隨機(jī)數(shù)為偶數(shù)者納入本研究。肺脾濕熱證共編號(hào)58例，納入30例（男13例，女17例）；濕熱郁蒸證共編號(hào)64例，納入30例（男14例，女16例）；毒熱動(dòng)風(fēng)證共編號(hào)55例，納入30例（男19例，女11例）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，相關(guān)檢查項(xiàng)目均獲得患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。3組患者年齡、性別、病程差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡最小6個(gè)月，最大6歲；②病程在48 h內(nèi)；③符合《手足口病診療指南（2010年版）》[4]中肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證中醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。肺脾濕熱證主癥：發(fā)熱，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，口腔黏膜出現(xiàn)散在皰疹，咽紅、流涎，神情倦怠，舌淡紅或紅，苔膩，脈數(shù)，指紋紅紫。濕熱郁蒸證主癥：高熱，疹色不澤，口腔潰瘍，精神萎頓，舌紅或絳、少津，苔黃膩，脈細(xì)數(shù)，指紋紫黯。毒熱動(dòng)風(fēng)證主癥：高熱不退，易驚，嘔吐，肌肉瞤動(dòng)，或見肢體痿軟，甚則昏矇，舌黯紅或紅絳，苔黃膩或黃燥，脈弦細(xì)數(shù)，指紋紫滯；④患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①HFMD核酸檢測未檢出相關(guān)病毒者；②合并其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病、發(fā)育不健全者；③合并其他病毒感染如巨細(xì)胞、EB病毒感染及HIV、水痘、麻疹者。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 血清細(xì)胞因子、T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞 患者均于就診當(dāng)日抽取靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min（美國Beckman GS-15R離心機(jī)），留取血清，無菌分裝后置于-80 ℃冰箱備用（T細(xì)胞亞群檢測均于抽血后常溫保存并在4 h內(nèi)檢測）。IL-6、PCT檢測均應(yīng)用羅氏電化學(xué)發(fā)光法診斷試劑，采用羅氏E601全自動(dòng)免疫分析儀檢測；CRP檢測使用BodiTech i-CHROMA試劑盒及配套艾可美分析儀。CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞采用美國Becton Dickinson流式細(xì)胞儀及配套試劑檢測。均按照相關(guān)說明書嚴(yán)格操作。

1.4.2 腸道病毒核酸分型 患者均于就診當(dāng)日采集肛拭子標(biāo)本，用中山大學(xué)達(dá)安公司生產(chǎn)的診斷試劑盒，美國生命科學(xué)公司Step one plus-Real Time PCR儀定量分析。取約2g糞便于離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液、2g玻璃珠、1 mL氯仿，振蕩混勻，3500 r/min離心20 min，取上清液140 ?L，提取RNA。反應(yīng)體系為25 ?L：熒光RT-PCR反應(yīng)液20 ?L，DNA聚合酶1 ?L，反轉(zhuǎn)錄酶0.35 ?L，模板RNA 5 ?L，充分混勻，6000 r/min離心10 s。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增程序：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 min，共5個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s，55 ℃退火40 s，采集熒光，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用 —x±s表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型與血清促炎因子的相關(guān)性

毒熱動(dòng)風(fēng)證IL-6明顯高于另兩證（P=0.003）；毒熱動(dòng)風(fēng)證PCT明顯高于另兩證（P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CRP也明顯高于另兩證（P肺脾濕熱證=0.002，P濕熱郁蒸證=0.037）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證IL-6、PCT、CRP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

2.2 中醫(yī)證型與T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的相關(guān)性

毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+計(jì)數(shù)與肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.006）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD4+計(jì)數(shù)與另兩證比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD8+計(jì)數(shù)與另兩證比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005，P=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證NK細(xì)胞計(jì)數(shù)與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表3。

2.3 中醫(yī)證型與T細(xì)胞亞群百分比的相關(guān)性

毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.012，P濕熱郁蒸證=0.041）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD4+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.033，P濕熱郁蒸證=0.001）；毒熱動(dòng)風(fēng)證CD8+百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.008，P濕熱郁蒸證=0.000）；毒熱動(dòng)風(fēng)證NK細(xì)胞百分比與另兩證比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P肺脾濕熱證=0.000，P濕熱郁蒸證=0.000）。肺脾濕熱證與濕熱郁蒸證CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞百分比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表4。

2.4 中醫(yī)證型與核酸病毒分型的相關(guān)性分析

經(jīng)核酸病毒分型檢測，肺脾濕熱證中Cox A16型19例、EV71型8例、其他通用型3例；濕熱郁蒸證中Cox A16型21例、EV71型4例、其他通用型5例；毒熱動(dòng)風(fēng)證中Cox A16型21例、EV71型4例、其他通用型5例?？梢姡緹釀?dòng)風(fēng)證中EV71型病毒感染明顯高于另兩證，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證均以感染Cox A16為主，而毒熱動(dòng)風(fēng)證以感染EV71型病毒為主，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=52.74，P=0.002），結(jié)果見表5。

3 討論

中醫(yī)無HFMD相關(guān)病名，現(xiàn)代中醫(yī)家多將其歸為“溫病”范疇。該病多由學(xué)齡期小兒感染，該時(shí)期小兒臟氣未充，正氣不足，病邪易于乘虛而入，損傷正氣，主要證素為濕和熱，感染疫毒癘氣之邪后導(dǎo)致氣機(jī)逆亂和氣虛，表現(xiàn)為發(fā)熱、精神差等，熱毒夾濕從皮膚口鼻而入，濕熱郁于肌表，則見手足丘皰疹；內(nèi)傳心脾，心脾積熱，濕熱郁蒸，阻滯氣機(jī)，表現(xiàn)為咳嗽、嘔吐、納差、腹痛?；馃嶂耙讉騽?dòng)風(fēng)耗氣，擾動(dòng)肝風(fēng)，出現(xiàn)肢體抖動(dòng)、煩躁、驚跳等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[5]?！端貑枴ぴu(píng)熱病論篇》有“邪之所湊，其氣必虛”，加之為小兒稚陰稚陽之體，素體內(nèi)熱偏勝，脾胃積熱，脾常不足，且多嗜食肥膩甘甜之品，易脾胃積熱，脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，外加感受邪毒，內(nèi)應(yīng)于脾而發(fā)病，濕熱相搏[6]，正氣抗邪外出，毒隨氣泄，外透肌膚，則見皰疹，甚者濕熱內(nèi)浸，波及氣營，則出現(xiàn)氣營兩燔證，表現(xiàn)為高熱不退、皰疹密集等癥。臨床根據(jù)HFMD辨證分型為肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證2個(gè)普通證型及毒熱動(dòng)風(fēng)證1個(gè)重癥證型，3種證型在IL-6、PCT、CRP、CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞等方面均存在差異。IL-6是機(jī)體內(nèi)的促炎因子，在HFMD發(fā)病過程中與機(jī)體免疫防疫、炎性損傷等病理生理過程有關(guān)[7]，HFMD由腸道病毒感染引起，導(dǎo)致一系列免疫調(diào)節(jié)損傷及炎癥反應(yīng)，而促炎細(xì)胞因子在該過程中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的IL-6水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明毒熱動(dòng)風(fēng)證較另2個(gè)較輕證型IL-6水平表達(dá)異常，提示IL-6可能與HFMD病情密切相關(guān)。PCT是降鈣素的前體，正常情況時(shí)主要在甲狀腺濾泡旁細(xì)胞內(nèi)合成，一般在嚴(yán)重感染及創(chuàng)傷等情況下明顯升高，同樣也參與炎癥反應(yīng)，在臨床中多用于監(jiān)測感染輕重程度[9]。PCT具有早期、特異、敏感的特性，優(yōu)于傳統(tǒng)的炎性標(biāo)志物，且對(duì)病情的早期評(píng)估、預(yù)后評(píng)價(jià)、療效觀察等具有一定意義[10]。3組患兒中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的PCT水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明毒熱動(dòng)風(fēng)證較其他2個(gè)較輕證型的PCT水平表達(dá)異常，提示PCT的表達(dá)可能與HFMD病情密切相關(guān)，在一定程度上能反映疾病的嚴(yán)重程度。CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要由IL-6刺激肝臟和上皮細(xì)胞合成和分泌，也是炎癥反應(yīng)的非特異性指標(biāo)，在HFMD早期診斷中有一定價(jià)值[11]。本研究中，肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證的CRP水平明顯低于毒熱動(dòng)風(fēng)證，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CRP的高低對(duì)疾病的嚴(yán)重程度評(píng)估有一定意義。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)細(xì)胞，也是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能起到調(diào)節(jié)機(jī)體正常免疫功能的作用，正常情況下CD3+、CD4+、CD8+計(jì)數(shù)及百分比均維持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定[12]。在本研究中，毒熱動(dòng)風(fēng)證CD3+、CD4+、CD8+計(jì)數(shù)及百分比均低于肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證，HFMD時(shí)感染腸道病毒，導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)制失調(diào)，T淋巴細(xì)胞亞群分布異常[13]，B淋巴細(xì)胞表達(dá)和分泌的血清免疫球蛋白受T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)，當(dāng)CD4+細(xì)胞減少或功能低下時(shí)，其產(chǎn)生淋巴因子協(xié)助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力也相對(duì)減弱[14]。機(jī)體免疫力下降既是HFMD感染的前提，也是病情加重、影響預(yù)后的重要因素。毒熱動(dòng)風(fēng)證屬重證HFMD，相較于其他2個(gè)普通證型，細(xì)胞免疫功能明顯低下，在疾病發(fā)展過程中檢測T細(xì)胞亞群水平，既能綜合評(píng)估病情，又能評(píng)估預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。NK細(xì)胞是人體內(nèi)固有免疫中的一種重要的效應(yīng)細(xì)胞，它可以繞過T細(xì)胞受體（TCR）/CD3識(shí)別途徑，以主要組織相容性復(fù)合物（MHC）非限制方式迅速識(shí)別和殺滅入侵的病原菌，同時(shí)分泌大量干擾素-γ等細(xì)胞因子，上調(diào)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，在抗感染、抗腫瘤等方面發(fā)揮突出的作用，NK細(xì)胞的升高能在HFMD轉(zhuǎn)歸及預(yù)后方面有積極作用[15]。在本研究中，毒熱動(dòng)風(fēng)證的NK細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比均高于另兩證，提示在抗感染的過程中，重癥患者的NK細(xì)胞表達(dá)水平更高，可能針對(duì)病毒感染的機(jī)體免疫反應(yīng)更強(qiáng)烈，也在一定程度上反映了疾病的輕重程度，本研究中毒熱動(dòng)風(fēng)證患者預(yù)后均良好，也提示在判別預(yù)后方面NK細(xì)胞可能有一定作用。目前流行的腸道病毒以Cox A16和EV71型居多，普通型以前者居多，重癥仍以感染EV71型病毒為主。

本研究在HFMD肺脾濕熱證、濕熱郁蒸證、毒熱動(dòng)風(fēng)證3個(gè)證型中發(fā)現(xiàn)相關(guān)的促炎細(xì)胞因子、促炎標(biāo)志物及T細(xì)胞亞群等方面不僅與發(fā)病有關(guān)，并且與病情輕重及預(yù)后密切相關(guān)。在臨床診治HFMD工作中，綜合檢測上述指標(biāo)能夠較為有效的評(píng)估病情及判斷預(yù)后。在HFMD診療中，以上述檢測指標(biāo)結(jié)合中醫(yī)臨床辨證分型，能夠更好地指導(dǎo)中醫(yī)臨床，為中醫(yī)臨床診斷客觀化及量化提供重要依據(jù)。

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