培養(yǎng)基種類及成分對核桃葉片組織培養(yǎng)褐變的影響

王法章 張春梅

摘要：以核桃葉片為試材，探討了不同培養(yǎng)基種類和某些培養(yǎng)基成分對其離體培養(yǎng)褐變的影響。結(jié)果表明：核桃葉片外植體在MS紙橋培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天發(fā)生褐變率較低，1/2MS次之，MS、B5和N6培養(yǎng)基外植體褐變率最高。添加200～500毫克/升檸檬酸可有效減輕外植體褐變；添加2000～2500毫克/升活性炭對褐變有作用但沒有檸檬酸效果好；而抗壞血酸對減輕外植體褐變無顯著作用。

關(guān)鍵詞：核桃；外植體；褐變；培養(yǎng)基

基金項目：甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室項目（項目號XZ1003）

中圖分類號： S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.031

核桃（Juglans regia）是世界四大干果之一。目前世界核桃年產(chǎn)量92萬噸，我國年產(chǎn)30萬噸，占世界三分之一 [1]。核桃味甘、性溫，可補(bǔ)腎、固精強(qiáng)腰、溫肺定喘、破血祛瘀、潤燥滑腸、補(bǔ)虛強(qiáng)體，提供營養(yǎng)、消炎殺菌，養(yǎng)護(hù)皮膚、防癌抗癌、補(bǔ)腦。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在眾多植物良種繁育上的成功應(yīng)用為核桃良種的快速繁殖提供了一條有效途徑[2，3]。王娟[4]等認(rèn)為適當(dāng)縮短轉(zhuǎn)瓶周期可抑制金薄香核桃莖段外植體褐變的發(fā)生。章鐵[5]等采用褐變抑制劑能明顯抑制大別山山核桃不同樹齡及不同部位的莖尖褐變。張小紅[6]等在培養(yǎng)基中加入核桃硫代硫酸鈉能防止褐變，并提高該種基因型核桃外植體萌芽率和新梢率。許傳俊[7]等認(rèn)為不同類型培養(yǎng)基對外植體的分化會產(chǎn)生不同的影響。尚旭嵐[8]等認(rèn)為采用液體培養(yǎng)基可有效克服鶴望蘭外植體褐變。梅興國[9]認(rèn)為培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量越低，外植體發(fā)生褐變程度越低，培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高，可導(dǎo)致細(xì)胞褐變。

利用組織快繁技術(shù)，加速良種及其砧木無性苗的繁育，具有很高的商業(yè)價值。然而在核桃組織培養(yǎng)中，外植體一般在接種后就出現(xiàn)褐變，最后導(dǎo)致外植體褐變死亡，因此難以建立無性繁殖體系[10，11]。因而，在核桃離體培養(yǎng)中，防止外植體褐變死亡是其能否培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。本試驗以核桃葉片為研究對象，研究培養(yǎng)基的種類及成分對核桃葉片褐變的影響，為核桃快速繁殖和組培提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

參試核桃葉片采摘于甘肅河西學(xué)院。試驗于2013年9月至2014年12月在河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。

1.2外植體的滅菌

先用流水沖洗30分鐘，再用75%的酒精浸泡10分鐘，然后用0.1%的升汞浸泡3分鐘，最后再用無菌水沖洗3～5次后，放在無菌水中備用。

1.3培養(yǎng)基種類對外植體褐變的影響

分別配制MS、1/2MS、MS紙橋培養(yǎng)基、B5和N6培養(yǎng)基。以MS為對照。每種培養(yǎng)基接種數(shù)為50個，每天觀察外植體情況，記錄開始發(fā)生褐變的外植體數(shù)以及褐變程度。外植體的褐變率（%）= 褐變的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。

1.4抗氧化劑和吸附劑的作用

配制以下培養(yǎng)基：MS；MS + 200毫克/升檸檬酸；MS + 500毫克/升檸檬酸；MS + 1000毫克/升檸檬酸；MS + 5毫克/升抗壞血酸；MS + 10毫克/升抗壞血酸；MS + 20毫克/升抗壞血酸；MS + 1500毫克/升活性炭；MS + 2000毫克/升活性炭；MS + 2500毫克/升活性炭。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基種類對核桃葉片外植體褐變的影響

表1 不同培養(yǎng)基對核桃葉片外植體褐變的影響

由表1可見，核桃葉片外植體用MS紙橋培養(yǎng)基培養(yǎng)的褐變率最低，培養(yǎng)10天尚未發(fā)生褐變，褐變率為0；在1/2MS培養(yǎng)基的褐變率次之，培養(yǎng)10天后34個發(fā)生褐變，褐變率為68%；而在MS、B5和N6培養(yǎng)基的外植體褐變率最高，培養(yǎng)10天全部發(fā)生褐變，褐變率為100%。

2.2抗氧化劑和吸附劑對核桃葉片外植體褐變的影響

表2 抗氧化劑和吸附劑對核桃葉片外植體褐變的影響

由表2可見，核桃葉片外植體在添加了抗壞血酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，褐變發(fā)生與對照沒有明顯差別，培養(yǎng)10天外植體基本全部褐變。培養(yǎng)基中添加活性炭，外植體出現(xiàn)黃化，培養(yǎng)10天也大部分褐變，但濃度為2000毫克/升或高于2000毫克/升時，可以較明顯地減輕褐變的發(fā)生。與對照相比，培養(yǎng)基加入檸檬酸，外植體褐變減輕。

3 討論與結(jié)論

3.1培養(yǎng)基類型對核桃葉片外植體褐變的影響

不同類型培養(yǎng)基對外植體的褐變程度會產(chǎn)生不同的影響。本研究結(jié)果表明，核桃葉片外植體在 MS、B5和N6培養(yǎng)基上的褐變發(fā)生均較為嚴(yán)重，而在1/2MS培養(yǎng)基上外植體褐變較輕，可能與1/2MS無機(jī)鹽濃度較低有關(guān)。這與前人的研究結(jié)果一致，有人認(rèn)為過高無機(jī)鹽濃度會引起某些植物外植體中酚類物質(zhì)氧化[12，13]。在桑樹組培中，1/2 MS培養(yǎng)基，降低無機(jī)鹽濃度能減輕褐化現(xiàn)象，降低褐化率[14]。油棕用MS培養(yǎng)基容易引起外植體的褐變，而用降低了無機(jī)鹽濃度的改良MS培養(yǎng)基時則可減輕褐變，并可誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體[15]。紙橋培養(yǎng)基可以很好地抑制外植體的褐變，證實了尚旭嵐[16]的觀點，可能是由于濾紙吸附了有害的酚類物質(zhì)。

3.2培養(yǎng)基成分變化對核桃葉片外植體褐變的影響

試驗發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基缺乏微量元素或只加倍Fe鹽用量時，外植體褐變嚴(yán)重；若只加倍MS培養(yǎng)基中大量元素含量，褐變也較嚴(yán)重。本結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的瓊脂含量降低，外植體褐變嚴(yán)重。這與前人的研究結(jié)果一致，李樹麗[17]認(rèn)為在一定范圍內(nèi)（瓊脂 5.0～6.5克/升），瓊脂用量越大，培養(yǎng)基硬度越大，褐變越輕。這可能是培養(yǎng)基的硬度影響了酚類物質(zhì)的擴(kuò)散速度的緣故。

3.3抗氧化劑和吸附劑對核桃葉片外植體褐變的影響

為了防止外植體褐變，通常在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑或吸附劑，諸如抗壞血酸、檸檬酸和活性炭等。張衛(wèi)芳[18]認(rèn)為在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑可減輕褐變。本實驗中，檸檬酸能較好地抑制核桃葉片外植體褐變，而活性炭和抗壞血酸都不能有效地阻止核桃外植體褐變；這與前人的研究結(jié)果不一致，抑制銀杏愈傷組織褐變效果最好的抗氧化劑是抗壞血酸，其次是PVP [19]。但是活性炭在濃度為2000毫克/升或高于2000毫克/升對核桃外植體褐變也起一定的作用，但效果沒有檸檬酸好。結(jié)果表明，這些抗褐變劑對不同品種效果不同，說明它們在防止外植體褐變中的作用有一定局限性。因此，在對不同的材料進(jìn)行培養(yǎng)時要選擇適宜的抗氧化劑或吸附劑。

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作者簡介：王法章，河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，本科生在讀，研究方向：種子科學(xué)與工程。

通訊作者：張春梅，博士，河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，教授，研究方向：組織培養(yǎng)。