屠宰工作環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌流行情況

王鐵峰 王照 李新殿

摘要：調(diào)查屠宰場(chǎng)工作環(huán)境中非結(jié)核分枝桿菌（NTM）流行情況，為在屠宰場(chǎng)及其他NTM散播環(huán)境中工作人員的醫(yī)療保健工作提供參考。吉林省白城市內(nèi)多家牲畜屠宰場(chǎng)內(nèi)地表污水及宰殺的豬、牛腸系膜淋巴結(jié)和頜下淋巴結(jié)中分離NTM，用細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌種鑒別培養(yǎng)、生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定等方法聯(lián)合鑒定屠宰場(chǎng)內(nèi)工作環(huán)境中的NTM流行情況。屠宰場(chǎng)工作環(huán)境中NTM總分離率為2.73%，其中地表污水中NTM分離率為3.50%，豬、牛腸系膜淋巴結(jié)NTM分離率為2.80%，頜下淋巴結(jié)NTM分離率為2.00%。所分離的NTM中包括常見(jiàn)的致病力較強(qiáng)的母牛分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等菌型。屠宰場(chǎng)中的工作人員屬NTM的易感高危人群，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該類(lèi)工作人員NTM的保健防治工作，同時(shí)也為其他NTM高危易感環(huán)境中工作人員的醫(yī)療保障提供參考。

關(guān)鍵詞：屠宰場(chǎng)；非結(jié)核分枝桿菌；流行情況調(diào)查；分離率

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.01.028

非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacterium， NTM）在臨床上常引發(fā)與結(jié)核病類(lèi)似的癥狀，這給該菌感染后的及時(shí)診治帶來(lái)了困難[1]。該菌屬革蘭氏陽(yáng)性菌，染色后不易被酸和酒精脫色，這種特性可以作為臨床上對(duì)分枝桿菌的初步診斷。該菌雖然廣泛存在于環(huán)境中，但是其易感人群主要以老人、嬰幼兒及長(zhǎng)期處于高危環(huán)境中的人群為主。屠宰廠內(nèi)工作人員可能接觸帶菌的動(dòng)物器官，其工作環(huán)境可能成為NTM的高危易感區(qū)域。所以掌握屠宰場(chǎng)工作環(huán)境中NTM的分布流行情況，對(duì)生產(chǎn)工作人員健康保障工作是十分必要的，也可以為其他高危易感環(huán)境中工作人員的疾病防疫工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和待檢樣品 實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株戈登氏分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室保存的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株。

待檢樣品：吉林省白城市生豬屠宰場(chǎng)、九一三屠宰場(chǎng)、大屯屠宰場(chǎng)、鶴翔肉類(lèi)屠宰加工廠等多個(gè)牲畜屠宰廠生產(chǎn)車(chē)間采集地表污水及豬、牛的腸系膜淋巴結(jié)與頜下淋巴結(jié)作為待檢樣品。

1.1.2 分離培養(yǎng)基 采用改良羅杰氏培養(yǎng)基（L-J）進(jìn)行NTM的分離鑒別與擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)基按《病原細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)》中的方法配制。

1.1.3 各種主要試劑 檸檬酸鐵銨、亞碲酸鉀等生化試劑均購(gòu)自北京化工廠；酚酞二硫酸三鉀購(gòu)自比利時(shí)ACROS化學(xué)公司；限制性內(nèi)切酶、Taq酶等分子生物學(xué)試劑購(gòu)自Takara公司；引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；其他無(wú)機(jī)化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 酸處理法：用十字勻漿器研磨樣品，漿液接種于L-J斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，每3天定期觀察，標(biāo)記生長(zhǎng)菌落，抗酸染色做出初步鑒定。8周后仍未生長(zhǎng)者或抗酸染色陰性者視為陰性。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

生物學(xué)與生物化學(xué)方法鑒定。

生長(zhǎng)特性實(shí)驗(yàn)：分離菌接種于L-J培養(yǎng)基上，分別在28℃、37℃、45℃條件下培養(yǎng)，定期觀察記錄生長(zhǎng)情況。

菌體產(chǎn)色實(shí)驗(yàn)：避光與不避光條件下觀察分離菌產(chǎn)色培養(yǎng)結(jié)果。

培養(yǎng)基生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：觀察分離菌于PNB培養(yǎng)基、TCH培養(yǎng)基、5%NaCl培養(yǎng)基、苦味酸培養(yǎng)基、谷氨酸鈉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況。

生化實(shí)驗(yàn)：分別進(jìn)行耐熱觸酶、硝酸鹽還原、吐溫-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、鐵離子吸收、亞碲酸鹽還原等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分離菌生化特性。

1.2.3分子生物學(xué)方法鑒定 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析方法（PCR-RLFP）對(duì)分離菌株進(jìn)行檢測(cè)。合成通用引物Tb11：ACCAACGATGGTGTGTCCAT和Tb12：CTTGTCGAACCGCATACCCT擴(kuò)增NTM的保守序列hsp65片段，反應(yīng)條件：94℃ 5分鐘預(yù)變性，94℃ 1分鐘變性，60℃ 1分鐘退火，72℃ 1分鐘延伸，共30個(gè)循環(huán)后72℃ 10分鐘延伸，擴(kuò)增得到439bp的目的片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BstEII和HaeIII進(jìn)行酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析各分枝桿菌特征性的酶切圖譜， 鑒別分枝桿菌類(lèi)型。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共計(jì)檢測(cè)樣品1500份，其中屠宰場(chǎng)生產(chǎn)車(chē)間地表污水共計(jì)500份，腸系膜淋巴結(jié)500份（牛腸系膜淋巴結(jié)250份、豬腸系膜淋巴結(jié)250份），頜下淋巴結(jié)500份（牛頜下淋巴結(jié)250份、豬頜下淋巴結(jié)250份）?？顾崛旧?yáng)性樣品共計(jì)42份，成功分離擴(kuò)增共計(jì)41株NTM，總分離率2.73%，其中地表污水17株NTM，陽(yáng)性率為3.50%，牛、豬腸系膜淋巴結(jié)14株NTM，陽(yáng)性率為2.80%，牛、豬頜下淋巴結(jié)10株NTM，陽(yáng)性率為2.00%。分離情況見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果

經(jīng)多種方法聯(lián)合鑒定成功分離的菌株中，蟾蜍分枝桿菌12株，胞內(nèi)分枝桿菌7株，母牛分枝桿菌3株，戈登分枝桿菌9株，龜分枝桿菌膿腫亞種5株，蘇加分枝桿菌3株，偶發(fā)分枝桿菌2株。其中，地表污水NTM的17份陽(yáng)性樣品中包括蟾蜍分枝桿菌7株，胞內(nèi)分枝桿菌3株，戈登分枝桿菌5株，蘇加分枝桿菌1株，偶發(fā)分枝桿菌1株；豬、牛腸系膜淋巴結(jié)的14株NTM中包括蟾蜍分枝桿菌3株，胞內(nèi)分桿菌2株，母牛分枝桿菌1株，戈登分枝桿菌2株，龜分桿菌膿腫亞種4株，蘇加分枝桿菌2株；豬、牛頜下淋巴結(jié)10株NTM中包括蟾蜍分枝桿菌2株，胞內(nèi)分枝桿菌2株，母牛分枝桿菌2株，戈登分枝桿菌2株，龜分枝桿菌膿腫亞種1株，偶發(fā)分枝桿菌1株。分離情況見(jiàn)表2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，從1500份屠宰場(chǎng)區(qū)采集的樣品中共分離出41株NTM，其中500份屠宰場(chǎng)內(nèi)地表污水中共分離出17株NTM，分離率為3.50%，這個(gè)比例低于陳超[2]等人在上海生活飲用水中16.7%的NTM分離率。屠宰場(chǎng)中長(zhǎng)期接觸生物源性NTM，而工作環(huán)境中的污水中NTM分離率卻低于上海市飲用水中分離率，分析原因可能有三點(diǎn)：一是消毒原因。屠宰場(chǎng)屬動(dòng)物疫源高危區(qū)，有日常的消毒預(yù)防程序，這可能是主要因素；二是氣候原因。本次實(shí)驗(yàn)采樣時(shí)間為北方的寒冬時(shí)期，導(dǎo)致屠宰場(chǎng)中污水中NTM分離率低；三是水源原因。水源的不同可能導(dǎo)致NTM分離率的差異。地表污水中分離到的17株NTM中包括的胞內(nèi)分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌是常見(jiàn)的致病型分枝桿菌[3-5]，說(shuō)明污水中有一定的NTM致病源存在。本次實(shí)驗(yàn)在采集樣品同時(shí)，還在屠宰車(chē)間內(nèi)敞口放置了20管L-J培養(yǎng)基，最終僅得1株NTM，分離率較低，也不能排除是否有飛濺物質(zhì)干擾了分離結(jié)果，但在牲畜屠宰過(guò)程中，工作車(chē)間內(nèi)由于動(dòng)物熱源的釋放，會(huì)導(dǎo)致大量霧化水蒸汽的出現(xiàn)，這為NTM的飛沫傳播創(chuàng)造了條件，所以即使得出屠宰區(qū)污水中NTM分離率較低這一結(jié)果，也不能對(duì)工作環(huán)境中的NTM防疫工作掉以輕心。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，豬、牛腸系膜淋巴結(jié)NTM分離率達(dá)到2.80%，低于王鐵峰[6]等人的相關(guān)報(bào)道，但是豬、牛頜下淋巴結(jié)NTM分離率為2.00%，又高于王鐵峰的相關(guān)報(bào)道。這兩次NTM調(diào)查采樣的地域氣候、樣品來(lái)源等條件相似，所以腸系膜和頜下淋巴結(jié)中NTM分離率的數(shù)據(jù)差異，可視為一種正常的隨機(jī)波動(dòng)。然而王鐵峰等人的檢測(cè)時(shí)間為2008年，時(shí)隔5年后NTM在吉林省白城市地區(qū)的流行情況沒(méi)有得到明顯改善，分析原因可能是由于NTM有較強(qiáng)的耐藥性，這也是人醫(yī)臨床在治療NTM時(shí)需要注意的一種現(xiàn)象，所以建議相關(guān)防疫工作人員，在進(jìn)行消殺過(guò)程中要定期更換殺菌劑，調(diào)整消殺程序，以取得更好的NTM防控效果。

實(shí)驗(yàn)中在屠宰場(chǎng)內(nèi)NTM總分離率達(dá)2.73%，分離到的NTM中包含致病力較強(qiáng)的母牛分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌等，這些都可能和屠宰過(guò)程動(dòng)物源性NTM的釋放有關(guān)。屠宰生產(chǎn)工作人員，長(zhǎng)期暴露在這種環(huán)境中，屬于高危易感人群，尤其是動(dòng)物臟器處理程序的工作人員，接觸患畜所攜帶的NTM的幾率更高，所以這些工作人員的醫(yī)療保健工作中需要加強(qiáng)對(duì)NTM的防治工作。

在對(duì)屠宰場(chǎng)工作人員的隨機(jī)調(diào)查中，有高齡工作人員患有呼吸系統(tǒng)類(lèi)結(jié)核樣疾病，雖然還沒(méi)有最終確診，但如果是NTM感染，這也和NTM易感于老人、兒童有一定關(guān)系。從各方面看，建議屠宰場(chǎng)不僅需要加強(qiáng)NTM的防治工作，同時(shí)有必要做好屠宰工作人員NTM防治知識(shí)的普及，提高工作人員的自我防范意識(shí)。

目前，對(duì)于NTM能夠引起人類(lèi)疾病的報(bào)道越來(lái)越多，國(guó)內(nèi)外均有NTM對(duì)人致病的相關(guān)報(bào)道[7-10]。而可能經(jīng)常接觸動(dòng)物源性NTM的屠宰工作人員，正是NTM感染的高危人群之一，所以有必要加強(qiáng)該類(lèi)人員的NTM醫(yī)療防疫工作，同時(shí)也有必要通過(guò)知識(shí)普及等形式，提高該類(lèi)工作人員的NTM自我防范意識(shí)，為其他可能處于NTM高危易感環(huán)境中工作人員的NTM防治工作提供參考。

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通訊作者：王鐵峰，博士，白城師范學(xué)院生物系，講師，研究方向：分子生物學(xué)。

作者簡(jiǎn)介：王照，博士，吉林省地方病第一防治研究所，研究員，研究方向：分子生物學(xué)；李新殿，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，講師，研究方向：野生動(dòng)物保護(hù)與利用。