黃瓜CsERECTA基因的原核表達及其多克隆抗體制備

王琪琦，李玉紅*，胡亮亮，秦亞光，趙子瑤，陳　鵬

(1 西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊陵 712100；2 西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100)

黃瓜CsERECTA基因的原核表達及其多克隆抗體制備

王琪琦1，李玉紅1*，胡亮亮1，秦亞光1，趙子瑤1，陳鵬2

(1 西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊陵 712100；2 西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100)

摘要:ERECTA基因編碼一個富含亮氨酸重復序列結構的絲/蘇氨酸類受體蛋白激酶，參與調控植物器官的形態(tài)建成，在株型控制及抗逆方面也有重要作用。該研究通過構建帶有maltose binding protein(MBP)標簽的pET21a-CsERECTA融合蛋白原核表達載體，實現了在大腸桿菌(E. coli )BL21(DE3)中的高效表達，并對誘導表達的溫度、時間和IPTG濃度進行了優(yōu)化。利用鎳離子螯合層析純化得到MBP-CsERECTA融合蛋白，再用rTEV蛋白酶對其進行酶切，得到CsERECTA蛋白并制備了該蛋白的多克隆抗體。結果表明，黃瓜CsERECTA蛋白以可溶和包涵體 2 種形式表達，低溫有助于蛋白以可溶性形式大量存在。最佳誘導溫度為23 ℃，誘導時間為6 h，IPTG濃度為0.5 mmol·L-1。通過Western blot可檢測到黃瓜內源的CsERECTA蛋白，說明制備的多可隆抗體具有較好的特異性。多克隆抗體的成功制備為進一步研究CsERECTA的功能奠定了基礎。

關鍵詞:黃瓜；CsERECTA基因；原核表達；多克隆抗體

ERECTA是一個編碼富含亮氨酸重復序列的類受體蛋白激酶基因[1]。植物ERECTA基因控制著植株生長發(fā)育的多個方面，比如地上部分器官的伸長、葉的生長、花序的發(fā)育和表皮的分化等[2]。由于ERECTA突變體是在Landsberg背景的擬南芥中發(fā)現的，其具有矮生的特性，便于培養(yǎng)和操作，因此目前常用作突變體分析和自然變異分析的背景材料[1]。擬南芥中的研究表明，ERETCA基因與植株分生組織的細胞分裂周期的調控有關[3,4]，從而控制擬南芥植株的矮化性狀。ERETCA基因也與花藥的正常發(fā)育有關，突變體的花藥發(fā)育受阻甚至出現雄性不育，在花藥發(fā)育過程中是細胞增殖和分化的重要調控因子[5]。ERETCA基因還與植株抗逆性密切相關，能夠提高植株對細菌性萎蔫病原菌[6]、壞死性真菌[7]的抗病性及對高溫干旱的耐受性[8,9]。此外，ERETCA基因還影響金屬元素在擬南芥植株中的積累[10]。目前對ERECTA基因的功能研究主要集中在模式植物擬南芥上，其他農作物和園藝作物的研究罕見報道。

本課題組前期的工作表明，CsERECTA控制矮化黃瓜WI7201的節(jié)間長度，使其節(jié)間極度短縮，是造成植株矮化的候選基因。為了驗證該基因在黃瓜中的功能，本研究對截短的CsERECTA基因在E. coliBL21(DE3)菌株中實現了高效表達，并獲得了目的蛋白，用于制備多克隆抗體，為進一步研究該基因在黃瓜中的功能奠定了基礎。

1材料和方法

1.1材料及試劑

黃瓜蔓生種質‘長春密刺’(CCMC)種植于光照培養(yǎng)箱，待兩葉一心期時采集莖尖，液氮速凍后于-80 ℃保存。大腸桿菌菌株BL21(DE3)和原核表達載體pET21a-HMT由本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10購于北京天根生化科技公司。

HiProof高保真DNA聚合酶購于楊凌杰一生物技術有限公司；限制性內切酶BamHI、XhoI、TaqDNA聚合酶、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT-PCRKit)、T4酶連接試劑盒(DNALigationKitVer2.1)、核酸marker(DL2000) 和蛋白marker(#SM0431)均購自大連TaKaRa公司；高純度質粒小提中量試劑盒、DNA膠回收試劑盒、ECL顯色試劑盒購自北京天根生化科技公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購于西安沃爾森生物技術公司；rTEV蛋白酶購于上海翊圣生物科技有限公司；Ni2+親和層析柱(德國Novagen公司)；卡那霉素、β-D-異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺(Acrylamide)及甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)購自Sigma公司；尿素、咪唑等其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1CsERECTA蛋白的結構預測在NCBI數據庫中查找GenBank收錄的CsERECTA基因(GenBank登錄號NC_026658.1)氨基酸序列。對CCMC的CsERECTA蛋白分別利用蛋白質在線預測工具SignalP4.1Server中的神經網絡法(NeuralNetwork，NN)預測信號肽區(qū)域；TMHMMServerv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜區(qū)；PlantsP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11125063)預測LRR區(qū)與激酶區(qū)。

1.2.2引物設計及對應片段的克隆在CsERECTA蛋白的結構預測基礎上，根據其結構域和氨基酸的親水性原則，選擇了編碼胞外區(qū)317～517位氨基酸，設計引物CsERECTA-L(5′-TGAGGGATCCGA-GAAGTTGTACCTGCATAGTAATAAGC-3′,下劃線處為BamHI酶切位點)和CsERECTA-R(5′-GGCCGCTCGAGGTTGTTGTTCTCAAGTCTCAGGGAG-3′，下劃線處為XhoI酶切位點)，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

以CCMC為試材，提取總RNA，利用反轉錄試劑盒，合成cDNA。再以cDNA為模板， CsERECTA-L和CsERECTA-R為引物進行目的基因擴增，PCR擴增采用HiProof高保真DNA聚合酶進行擴增和延伸，PCR反應體系(25μL)為：上下游引物(10μmol·L-1)各1μL、dNTP(10mmol·L-1)0.5μL、5×Qbuffer5μL、HiProofDNAPolymerase(5U·μL-1) 0.2μL、模板DNA1μL，ddH2O補齊至25μL。PCR擴增程序如下：96 ℃預變性1min；96 ℃變性10s，54 ℃退火20s，72 ℃ 30s，循環(huán)擴增32次；最后72 ℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物。

1.2.3CsERECTA基因原核表達載體的構建純化的CsERECTA基因片段經BamHI和XhoI雙酶切后，與經同樣雙酶切的pET21a-HMT表達載體相連接，獲得重組表達載體pET21a-HMT-CsERECTA，轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10，經菌落PCR及質粒PCR檢測后，測序驗證該表達載體中的基因序列及讀碼框的正確性。序列分析軟件為DNAstar和NCBI-BLASTn。

1.2.4CsERECTA融合蛋白的誘導表達與可溶性分析取測序正確的菌液，制備pET21a-HMT-CsERECTA質粒，將重組質粒通過凍融法轉化入BL21(DE3)后進行誘導表達。挑取單菌落接種到含100μg·mL-1氨芐青霉素(Amp)的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100擴大培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600值約為0.6時加入1.0mmol·L-1IPTG誘導蛋白表達。菌液經超聲波破碎(工作時間3s，間歇時間7s，破碎40min)后，離心收集上清和沉淀，分別制樣并進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5融合蛋白表達條件的優(yōu)化(1)誘導溫度的優(yōu)化取陽性克隆的菌液等量接種于3個含有Amp抗生素的5mL液體LB培養(yǎng)基中，分別于37 ℃、28 ℃和23 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.6時，加入1.0mmol·L-1IPTG誘導6h。分別取500μL菌液，離心收集菌體后，加入100μL1×上樣緩沖液，沸水浴10min后取上清進行SDS-PAGE電泳檢測。

(2)誘導時間的優(yōu)化23 ℃培養(yǎng)至OD600值達0.6左右，加入終濃度為1mmol·L-1的IPTG，23 ℃恒溫培養(yǎng)，分別在0、4、6、8、10h時取樣進行SDS-PAGE電泳檢測。

(3)IPTG誘導濃度的優(yōu)化于23 ℃培養(yǎng)至OD600值達0.6時，分別加入終濃度為0、0.25、0.5、0.75和1.0mmol·L-1IPTG，23 ℃恒溫培養(yǎng)6h后分別取樣進行電泳檢測。

1.2.6融合蛋白的純化及酶切(1)融合蛋白的純化參照李蒙等[11]的方法進行，利用鎳離子螯合層析柱純化融合蛋白。

(2)融合蛋白的酶切將200μg的融合蛋白和30μL的rTEV蛋白酶(1.5U·μL-1)、75μL的rTEVbuffer1(20×)和15μL的rTEVbuffer2(100×)混合，組成1.5mL的反應體系，于室溫(30 ℃)過夜(14h)反應。

1.2.7重組蛋白的多克隆抗體制備將酶切后的產物進行SDS-PAGE(20cm×20cm)電泳，切取目標條帶送至武漢三鷹生物技術有限公司進行兔抗CsERECTA的多克隆抗體制備。

1.2.8黃瓜莖尖CsERECTA蛋白的提取CsERECTA蛋白的提取分別采用了3種方法，取樣量和取樣部位均相同。方法1為超速離心法提取膜蛋白，參照Qian等[12]方法進行。取3g兩葉一心時期的CCMC莖尖部位組織樣品，液氮速凍后研磨成粉末狀，加入6mL預冷的膜蛋白提取緩沖液(250mmol·L-1山梨醇，50mmol·L-1Tris-HCl，0.2mmol·L-1EDTA，pH8.0)，置于冰上1h后，4 ℃5,000g離心5min，取上清于10 000g離心10min，最后取上清于100 000g離心30min，將沉淀溶解于60μL膜蛋白溶解液(5mmol·L-1H2PO4，330mmol·L-1蔗糖，3mmol·L-1KCl，pH7.8)中。方法2為醋酸鈉沉淀法提取黃瓜的總蛋白，參照毛雙雙等[13]方法進行。方法3為TritonX-100去污劑法提取黃瓜的膜蛋白，參照Shpak等[3]方法進行。

1.2.9CsERECTA蛋白的Westernblot分析Westernblot分析參照李玉萍等[14]方法進行。樣品蛋白SDS-PAGE電泳后，經半干電轉儀(20mA，2h)轉移到0.45μm孔徑的PVDF膜上。加入制備的多克隆抗體(1∶2 000)孵育2h，再加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔1gG(1∶10 000)室溫孵育1h后，用ECL顯色試劑盒進行顯色，用化學發(fā)光成像儀拍照。

2結果與分析

2.1黃瓜CsERECTA蛋白質序列分析

利用SignalP4.1Server預測CCMC中CsERECTA蛋白質的信號肽區(qū)，發(fā)現第32位氨基酸是最可能的剪切位點，表明信號肽很可能存在于前32個氨基酸中。通過TMHHMv2.0 預測黃瓜CsERECTA蛋白的跨膜區(qū)和胞內、外區(qū)，結果發(fā)現氨基酸7～29位點之間和氨基酸位點600附近有2個跨膜區(qū)。通過PlantsP中的Pfscan預測CsERECTA蛋白質中的LRR區(qū)和激酶區(qū)(圖1)，結果表明，CCMC的CsERECTA蛋白質LRR區(qū)在107～513氨基酸之間，激酶區(qū)在657～929氨基酸之間。所以根據其結構域和氨基酸的親水性原則，選擇了去掉信號肽和跨膜區(qū)之后的編碼胞外區(qū)317～517個氨基酸的片段設計了1對引物(圖1中箭頭所示)。

黃瓜CsERECTA基因編碼一個跨膜的類受體蛋白激酶，成熟的CsERECTA蛋白由991個氨基酸殘基構成，理論上的分子量大小約為109kD。在上述蛋白結構預測的基礎上，設計引物擴增到胞外區(qū)片段的全長為603bp，編碼201個氨基酸殘基，該截短的CsERECTA蛋白分子量約為22.8kD，屬于酸性蛋白質。

2.2目的片段的克隆和原核表達載體構建

pET21a-HMT(pET21a-His-MBP-TEV)載體是在pET21a的基礎上改造后的一個表達載體，其多克隆位點中依次包含了His-tag、MBP和TEV酶切位點的相應序列。將截短的CsERECTA基因連接該載體后，其表達的融合蛋白(下文中稱為CsERECTA融合蛋白)帶有His和MBP標簽，通過蛋白質序列計算該融合蛋白大小約為65kD。CsERECTA融合蛋白中有TEV蛋白酶酶切位點，經過rTEV蛋白酶酶切之后，能得到約為42kD的麥芽糖結合蛋白(MBP)和22.8kD的截短的CsERECTA蛋白。

灰色區(qū)域. LRR區(qū)；斜線方框區(qū)域. 激酶區(qū)；箭頭指示處為引物的位點圖1　CCMC的CsERECTA蛋白質LRR區(qū)及激酶區(qū)預測Gray area: LRR region; Diagonal block area: kinase region;The position of the primers are indicated by the arrowFig. 1　LRR region and kinase region prediction of CsERECTA protein in CCMC

以從黃瓜葉片中提取的RNA反轉錄成的cDNA為模板，PCR擴增出單1條帶，其大小為603bp，與預期相符(圖2，泳道1)。PCR產物回收后克隆到pET21a-HMT載體，轉化TOP10，挑單克隆后做菌落PCR檢測(圖2，泳道2)和質粒PCR檢測(圖2，泳道3)，挑選陽性菌株將其菌液送去測序。序列測定結果顯示表明獲得的重組克隆載體包含目標基因，所擴增到的基因片段大小為603bp，與預期的片段大小相同，核苷酸序列也一致，表明CsERECTA基因的原核表達載體pET21a-HMT-CsERECTA構建成功。

2.3CsERECTA融合蛋白在大腸桿菌中的誘導表達及表達形式的確定

將構建成功的表達載體pET21a-HMT-CsERECTA導入E. coliBL2l(DE3)中，至對數生長期(OD600值約為0.6)時加1mmol·L-1IPTG誘導6h后，收集菌體，并以未加IPTG誘導的菌為對照，進行SDS-PAGE檢測。結果與對照(圖3，泳道3)相比，含重組質粒的菌液在大約65kD左右處(圖3，泳道1和2)出現1條較高濃度的特異條帶，與預期的CsERECTA融合蛋白分子量相當，表明CsERECTA基因已經在大腸桿菌BL2l(DE3)中融合表達。

對CsERECTA融合蛋白進行表達形式的檢測，結果如圖3所示，在37 ℃時，重組表達菌體裂解的上清液中融合蛋白(泳道2)的表達量明顯少于沉淀(泳道1)中的表達量，在28 ℃時，重組表達菌體裂解的上清液中融合蛋白(泳道5)的表達量有所增加，而在23 ℃時，重組表達菌體裂解的上清液中融合蛋白(泳道7)的表達量明顯高于沉淀(泳道6)中的表達量，上清中65kD處有明亮的蛋白條帶，幾乎大部分的融合蛋白都以可溶的形式存在。這說明CsERECTA融合蛋白以可溶和包涵體兩種形式存在，且23 ℃低溫誘導有利于該蛋白以可溶的形式表達。因此，適量降低誘導溫度是促進蛋白可溶性表達的有效方法之一，誘導CsERECTA融合蛋白表達的最適溫度為23 ℃。

M.DL2000；1.CsERECTA基因的PCR擴增；2. 重組質粒pET21a-HMT-CsERECTA的菌落PCR鑒定；3.重組質粒pET21a-HMT-CsERECTA的質粒PCR鑒定圖2　黃瓜CsERECTA基因重組質粒pET21a-HMT-CsERECTA的鑒定M.DL2000； 1：Amplified by PCR of CsERECTA gene; 2: Colony PCR of recombinant vector of pET21a-HMT-CsERECTA；3：Recombinant plasmid of pET21a-HMT-CsERECTA identified by PCR amplificationFig. 2　Identification of CsERECTA gene with recombinant vector of pET21a-HMT-CsERECTA

2.4CsERECTA融合蛋白表達條件的優(yōu)化

在對合適誘導溫度進行探索后，本研究又對CsERECTA融合蛋白進行了適宜誘導時間和誘導劑濃度的優(yōu)化。經SDS-PAGE分析表明(圖4)，重組菌在最適溫度23 ℃條件下，融合蛋白表達量隨著誘導時間的延長而增加，誘導6h表達量最大，隨后表達量一直維持在一定水平無明顯變化。重組菌在23 ℃條件下，加入IPTG分別至終濃度為0.25、0.5、0.75和1.0mmol·L-1，誘導培養(yǎng)6h后，經SDS-PAGE電泳分析，表明融合蛋白的表達量在IPTG0.5mmol·L-1融合蛋白表達量最大，隨后表達量無明顯變化。由此可見，CsERECTA融合蛋白的最適表達條件為：23 ℃條件下0.5mmol·L-1的IPTG誘導6h。

M. 分子量蛋白Marker; 1和2分別為 1 mmol·L-1 IPTG 37 ℃誘導6 h的重組菌沉淀和上清；3. 未加IPTG誘導的BL21(DE3)菌總蛋白；4和5分別為1 mmol·L-1 IPTG于28 ℃誘導6 h的重組菌沉淀和上清；6和7分別為 1 mmol·L-1 IPTG于23 ℃誘導6 h的重組菌沉淀和上清；箭頭所示為65 kD圖3　CsERECTA基因重組表達的SDS-PAGE圖譜M. Protein marker；1 and 2. The sediment and the supernatant of the recombinant sample for 6 h with 1 mmol·L-1 IPTG induced in 37 ℃,respectively；3. The total protein of the control without IPTG induced；4 and 5. The sediment and the supernatant of the recombinant sample for 6 h with 1 mmol·L-1 IPTG induced in 28 ℃,respectively；6 and 7. The sediment and the supernatant of the recombinant sample for 6 h with 1 mmol·L-1 IPTG induced in 23 ℃,respectively；The arrow indicated 65 kDFig. 3　SDS-PAGE of fusion protein expression of CsERECTA gene

M. 蛋白marker；1～5分別為0、0.25、0.5、0.75和1.0 mmol·L-1 IPTG誘導的菌體；6～10分別為0、4、6、8和10 h誘導的菌體圖4　不同IPTG濃度及誘導時間對CsERECTA融合蛋白表達的影響M. Protein marker；1-5. Cells containing pET21a-HMT-CsERECTA induced with 0,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol·L-1 IPTG ,respectively; 6-10:Cells containing pET21a-HMT-CsERECTA induced for 0,4,6,8 and 10 hours, respectivelyFig. 4　Effect of time and IPTG concentration on thc expression of recombinant CsERECTA

2.5CsERECTA融合蛋白的純化及酶切

經Ni2+親和層析柱分離純化后，得到單一峰的收集液，經透析和濃縮后，SDS-PAGE檢測純化效果，結果65kD處(圖5，泳道2和3)檢測到了很亮的目的條帶，表明已純化得到融合His標簽的CsERECTA融合蛋白，且純化效果良好。CsEREC-TA融合蛋白再經過rTEV蛋白酶酶切之后，分別得到了大小約為42kD的麥芽糖結合蛋白(MBP)和大小為22.8kD的截短的CsERECTA蛋白(泳道4)，和預期的結果相符。最后將目的條帶切膠后送至武漢三鷹公司制備兔抗CsERECTA蛋白的多克隆抗體。

M. 蛋白marker；1. 未加IPTG誘導的BL21(DE3)菌總蛋白；2和3：過鎳柱純化后的CsERECTA融合蛋白；4. 酶切后的產物圖5　鎳柱純化的CsERECTA 融合蛋白及融合蛋白酶切的SDS-PAGE檢測M. Protein marker; 1. Without IPTG induced the total protein of the control; 2 and 3. Recombinant CsERECTA purified by nickel resin; 4. The product after enzyme digestionFig. 5　SDS-PAGE analysis of recombinant CsERECTA purified by nickel resin and enzyme digestion of fusion protein

M. 預染的蛋白Marker；1. 含pET21a- HMT-CsERECTA的BL21(DE3)菌株總蛋白；2. 超速離心法提取的膜蛋白；3. 醋酸鈉沉淀法提取的總蛋白；4. Triton X-100去污劑法提取的膜蛋白圖6　CsERECTA蛋白多克隆抗體的Western-blot 檢測M. Prestained protein marker；1. The total protein of BL21(DE3) bacterial cells contained pET21a-HMT-CsERECTA；2. Extraction of membrane protein by ultracentrifugation method；3. Extraction of total protein by sodium acetate precipitation method；4. Extraction of membrane protein by methods of Triton X-100 decontaminantFig. 6　Western blot analysis of polyclonal antiserum of the CsERECTA protein

2.6抗體的特異性檢測

為了檢測制備的多克隆抗體的特異性，以其為一抗，以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，對原核表達產物及黃瓜組織蛋白樣品進行Westernblot分析。結果表明，Anti-CsERECTA能與pET21a-HMT-CsERECTA誘導菌總蛋白發(fā)生特異性反應，在65kD處有明顯的特異性條帶(圖6，泳道1)，與預期相符，說明MBP-CsERECTA融合蛋白能被制備的多抗檢測到；同時也能與黃瓜莖尖的膜蛋白發(fā)生特異性反應，在大約125kD處有特異性條帶(泳道2)，說明成熟的CsERECTA蛋白也能被制備的多抗特異性識別，但是信號較弱，一定程度上說明了CsERECTA蛋白在黃瓜中的表達豐度偏低。然而，用醋酸鈉沉淀法這類提取植物總蛋白的方法(泳道3)，卻很難檢測到Westernblot的特異信號，后來我們又嘗試用TritonX-100去污劑提取植物跨膜蛋白的方法(泳道4)，但結果均不能有效提取到CsERECTA蛋白。最后用超速離心的方法(泳道2)才能達到試驗目的，一定程度上反映了大分子量的膜蛋白研究的難度。由此可見，提取疏水的跨膜蛋白，特別是像CsERECTA這類表達豐度很低的內源膜蛋白，用植物總蛋白的提取方法效果不好，因為總蛋白的提取方法更適合于提取親水的蛋白質，而且，用TritonX-100等去污劑提取膜蛋白的方法也存在著局限性，提取某些大分子量的膜蛋白效果也不太理想。本研究表明，超速離心法是提取大分子量跨膜蛋白的有效方法之一。總之，制備的Anti-CsERECTA多克隆抗體具有較好的特異性且背景低，可用于后續(xù)的蛋白功能方面的試驗研究。

3討論

迄今為止，對于ERECTA基因的研究工作主要集中在擬南芥上。擬南芥ERECTA基因家族有3個成員，分別為ERECTA、ER-LIKE1(ERL1)和ER-LIKE2(ERL2)。Shpak等發(fā)現，只有在3個家族成員功能都缺失的情況下，植株才出現極度矮化，說明ERECTA基因家族在促進地上部位生長的功能上有冗余作用[3,4]。擬南芥ERECTA基因在莖尖、莖、嫩葉和花等生長發(fā)育旺盛的組織內表達，而在根等成熟器官中不表達，且在植株早期發(fā)育中表達較弱，在營養(yǎng)生長向生殖生長過渡時期的表達較高[15]，這與ERECTA基因具有調控節(jié)間和葉柄的伸長、葉及花的發(fā)育與分化的功能相吻合。Chen等通過對擬南芥胚胎發(fā)育時期的組織結構觀察發(fā)現，ERECTA基因家族是通過促進細胞增殖并抑制氣孔分化從而促進子葉的伸長[16]。由此可見，ERECTA基因確實參與了調控植株矮化的生長過程，對該矮化基因進行挖掘和功能驗證，能為研究植物株型調控機理及種質創(chuàng)新提供理論支撐。

在葫蘆科作物中，對ERECTA蛋白的相關研究尚未見報道。本課題組前期的研究發(fā)現(文章未發(fā)表)，來源于黃瓜的CsERECTA基因，參與調控黃瓜的株型，造成植株矮化且株型緊湊，為了在蛋白水平上研究黃瓜CsERECTA的表達情況，用原核表達的重組蛋白來制備相應抗體是開展研究工作的前提。

與擬南芥中發(fā)現的ERECTA家族基因類似，在大豆中發(fā)現并克隆了PvERECTA和PvERECTA-like基因[17]，水稻中也克隆了OsERECTA基因家族[18]，它們都是多拷貝。但是，本課題組在NCBI和黃瓜全基因組數據庫中預測的CsERECTA基因家族成員只有1個且是單拷貝。CsERECTA基因編碼991個氨基酸，理論上成熟的蛋白質分子量大小為109kD，可是通過Westernblot檢測的結果顯示成熟蛋白質的分子量在125kD左右，此間造成的偏差可能與蛋白質的糖基化有關。Shpak等[3]發(fā)現，在擬南芥中內源的成熟ERECTA蛋白大小為145kD左右，與預測的105kD的理論值也有偏差，因為ERECTA蛋白的胞外域中有12個潛在的N-糖基化位點[1]，蛋白質發(fā)生糖基化作用導致分子量比預期值偏大。Shen等[8]也在擬南芥中檢測到了約145kD的ERECTA蛋白。本研究檢測到的黃瓜CsERECTA蛋白的分子量與擬南芥略有不同，通過進化樹分析可以發(fā)現(結果未顯示)，黃瓜與甜瓜的親緣關系最近，而與擬南芥親緣關系較遠，所以CsERECTA蛋白與擬南芥ERECTA蛋白在結構和功能上有所差異，導致該蛋白在分子量大小上也有區(qū)別。

由于CsERECTA蛋白是一個疏水的跨膜蛋白，分子量較大，且內源的ERECTA蛋白表達量很低[3]，所以一定程度上增大了提取蛋白和Westernblot驗證的難度。本試驗在提取膜蛋白方面嘗試了多種方法，比如醋酸鈉沉淀法提取黃瓜的總蛋白[13]，用TritonX-100去污劑法[3]和TritonX-114去污劑法[19](結果未顯示)提取黃瓜中的膜蛋白，結果均不理想，都不能檢測到CsERECTA蛋白的免疫反應信號。最后參考Qian等[12]的超速離心法提取膜蛋白，才檢測到黃瓜中CsERECTA的特異信號。Wang等[20]和Yan等[21]也都是通過超速離心的方法提取到了大分子量的膜蛋白。程彥偉等[22]研究水稻OsRLK蛋白發(fā)現，在總蛋白、微粒體粗膜蛋白和細胞質蛋白中均未檢測到OsRLK蛋白的免疫反應信號，只在超速離心提取的質膜中檢測到了相應信號，這說明，位于質膜上的某些低豐度的膜蛋白，由于表達量較低，通常需要通過質膜純化富集的方法才能檢測到蛋白的表達。本研究的結果表明，提取疏水的跨膜蛋白，用植物總蛋白的提取方法難度很大，而且，用TritonX-100、TritonX-114等去污劑提取膜蛋白的方法也存在著局限性，提取大分子量的膜蛋白效果還不太理想。所以，超速離心法是提取大分子量跨膜蛋白的有效方法之一。

在本研究中，首次對黃瓜內源的CsERECTA蛋白進行特異性檢測，在成功獲得對CsERECTA特異的多克隆抗體的基礎上，可以后續(xù)研究在生物脅迫和非生物脅迫條件下該蛋白的時空表達特征，也可部分驗證其在調控黃瓜矮化株型中的作用。

參考文獻:

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(編輯:宋亞珍)

ProkaryoticExpressionofCucumberCsERECTAGeneandPreparationofItsPolyclonalAntibody

WANGQiqi1,LIYuhong1*,HULiangliang1,QINYaguang1,ZHAOZiyao1,CHENPeng2

(1CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China；2CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

Abstract:ERECTA gene encodes a leucine-rich repeat receptor-like Ser/Thr kinase. It participates in regulating morphogenesis of plant organs and plays an important role in the change of plant type and resistance to adversity. In the present study, pET21a-CsERECTA, a prokaryotic expression vector with maltose binding protein tags was constructed and successfully expressed in E. coli BL21(DE3)．Expression conditions were optimized in the optimal temperature ,induction duration, and IPTG concentration．The fusion protein MBP-CsERECTA was purified by nickel chelating chromatography and enzyme digestion was conducted by rTEV protease. The CsERECTA protein was obtained and it was used to prepare polyclonal antibody．The results showed that CsERECTA was expressed in the form of soluble and inclusion bodies in E. coli BL21(DE3), and a large number of proteins were soluble at low temperature. The optimal temperature,induction duration and IPTG concentration were 23 ℃,6 h and 0.5 mmol·L-1, respectively．Western blot showed that the polyclonal antibody of CsERECTA has good specificity, because endogenous CsERECTA was detected. The successfully prepared polyclonal antibody can be used for further investigation, which establish the foundation for investigating the function of the CsERECTA gene in cucumber．

Key words:cucumber; CsERECTA gene; prokaryotic expression; polyclonal antibodies

文章編號:1000-4025(2016)05-1031-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.1031

收稿日期:2016-03-01;修改稿收到日期:2016-05-11

基金項目:國家自然科學基金(31071791)；高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(YQ2013003)；西北農林科技大學國際科技合作基金項目

作者簡介:王琪琦(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事蔬菜育種與生物技術的研究。E-mail：wangqiqiwqq1989@163.com *通信作者:李玉紅，教授，博士，主要從事黃瓜的種質資源與生物技術的研究。E-mail：liyuhong73@126.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A