AOX途徑在蘋果離體葉片失水過程中的光破壞防御作用

徐秀玉，程來亮，金立橋，孫　山*，劉美君

(1 山東省果樹研究所，山東泰安271000；2 山東農業(yè)大學生命科學學院，山東泰安271018)

AOX途徑在蘋果離體葉片失水過程中的光破壞防御作用

徐秀玉1,2，程來亮1，金立橋2，孫山1*，劉美君2

(1 山東省果樹研究所，山東泰安271000；2 山東農業(yè)大學生命科學學院，山東泰安271018)

摘要:為探討線粒體交替氧化酶呼吸途徑(AOX途徑)對水分脅迫下蘋果葉片光破壞的防御作用，以蘋果砧木平邑甜茶離體葉片為試材，通過AOX抑制劑水楊基羥肟酸(SHAM)處理，同時測定蘋果葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線和820 nm光的吸收曲線，結合JIP-test分析，探討了失水過程中AOX途徑的光保護作用。結果表明：水分脅迫條件下，平邑甜茶葉片的AOX活性顯著增加， SHAM抑制AOX途徑后，葉片發(fā)生更嚴重的光抑制；在失水脅迫條件下，平邑甜茶葉片PSⅡ原初光化學反應的量子產額(TRo/ABS)、PSⅡ捕獲的電子從QA傳遞到QB的概率(ETo/TRo)下降，PSⅡ單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)上升，而PSⅠ的最大氧化還原活性(ΔI/Io)未受影響；SHAM抑制AOX途徑后，TRo/ABS和ETo/TRo進一步下降，ABS/RC進一步上升，同時引起了ΔI/Io的下降。研究認為，水分脅迫條件下，平邑甜茶葉片PSⅡ發(fā)生了光抑制，而SHAM處理在加重PSⅡ光抑制的同時，引起了PSⅠ的光抑制；葉片失水過程中，AOX呼吸上調是平邑甜茶葉片的重要光破壞防御機制，特別是對PSⅠ具有重要的保護作用。

關鍵詞:蘋果；平邑甜茶；失水；交替呼吸途徑；光破壞防御

隨著全球變暖和環(huán)境惡化，干旱問題日益嚴重[1]。干旱會引起植物葉片失水，發(fā)生光抑制，導致過剩光能的增加，嚴重時可引起植物光合器官的光破壞[2-4]。在長期的進化過程中，植物進化出一系列的光破壞防御機制，從而保護光合機構免受過剩光能的傷害，以前的光破壞防御研究多集中于葉綠體內，例如環(huán)式電子傳遞[5]、依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散[6]、Mehler反應[7]及活性氧的酶促和非酶促清除系統(tǒng)等[8]，而對于葉綠體外的光破壞防御機制研究甚少。近年的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體中的AOX途徑能夠有效地消耗葉綠體內的過剩還原力，從而緩解強光對葉片造成的光抑制[9-10]。AOX途徑的光破壞防御作用已在擬南芥、小麥、黃瓜等草本植物上被實驗證實[11-13]，但其在木本植物中是否仍具有重要的光破壞防御作用尚未見報道。

蘋果是中國重要的落葉果樹樹種，大多分布在干旱、半干旱地區(qū)，其生長過程中經常遭遇到干旱脅迫。有關干旱脅迫對蘋果屬植物的形態(tài)和生理生化指標等方面的影響已有大量報道[14-16]，而干旱脅迫下的光破壞防御機制研究相對較少。李春霞等研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下蘋果屬植物熱耗散增加[17]，Jia等證實干旱環(huán)境下光呼吸、米勒反應的增加可減輕蘋果葉片的光抑制[18]，但AOX途徑對干旱脅迫下蘋果屬植物光破壞防御的影響目前尚未見報道。因此，本研究選用蘋果優(yōu)良砧木平邑甜茶離體葉片作試材，探討AOX呼吸途徑的光破壞防御作用，以期為蘋果抗旱栽培和育種提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

試驗材料為種植于山東省果樹研究所試驗場的2年生平邑甜茶(Malus hupehensis)，于2014～2015年生長季選取長勢一致的苗木，取第3～4片完全展開葉，用濕紗布包裹后，快速帶回實驗室用于試驗。

1.2試驗處理

將葉片用直徑1.0cm的打孔器打成葉圓片，平均分為兩組，一組浸泡于清水中(CK)，另一組浸泡于2mmol·L-1的水楊基羥戊酸(SHAM)溶液中，黑暗處理2h；然后將葉圓片表面擦拭干凈，漂浮在20%PEG溶液上，讓其自然脫水；脫水處理的同時用微波硫燈(MSL1000N1，寧波)進行1 000μmol·m-2·s-1的光照處理(光響應曲線的飽和光強)。分別在脫水處理的0、2、4h時取樣進行相關參數(shù)測定。

1.3測定指標及方法

1.3.1葉片水勢將葉圓片表面擦干，放入C-52樣品室，平衡60min后，用PSYPRO水勢儀(WESCOR，美國)進行水勢測定。

1.3.2交替呼吸速率根據(jù)孟祥龍等[19]的方法，利用OXYTHERM氧電極(Hansatech，英國)，在25 ℃條件下測定呼吸速率，反應室溫度由OXYTHERM氧電極的控溫裝置自動控制。于反應杯中添加2mL磷酸緩沖液(pH6.8)，加入直徑1.0cm的葉圓片，在黑暗中測定葉片的耗氧速率，當耗氧速率達到穩(wěn)定狀態(tài)后，根據(jù)10～20min區(qū)間氧氣濃度的下降斜率計算葉片總呼吸速率(Rtotal)；總呼吸速率測定后，重新在反應杯中加入2mL含有20mmol·L-1SHAM的磷酸緩沖液(pH6.8)，加入葉圓片，于25 ℃條件下恒溫20min，在黑暗中測定葉片的耗氧速率，當耗氧速率達到穩(wěn)定狀態(tài)后，根據(jù)10～20min區(qū)間氧氣濃度的下降斜率計算葉片COX途徑呼吸速率(RCOX)。AOX途徑呼吸速率(RAOX)=Rtotal-RCOX。根據(jù)上述方法分別測定經過不同脫水時間處理之后的總呼吸速率、AOX途徑呼吸速率和COX呼吸速率。

1.3.3瞬時熒光和820nm光吸收動力學曲線瞬時熒光和820nm光反射用MPEA-2多功能植物效率分析儀(Hansatech, 英國)測量。測定參照Strasser等[20]的方法，先在5 000μmol·m-2·s-1的飽和紅光下測量瞬時熒光；然后關掉紅光，在1 000μmol·m-2·s-1的遠紅光下測量820nm光反射。

根據(jù)Strasser等[21-22]建立的JIP-test數(shù)據(jù)分析方法，對獲得的OJIP熒光誘導動力學曲線進行分析，按下列公式計算相對可變熒光的差值(ΔVt)、單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)、K點的相對可變熒光(WK)、反應中心捕獲的量子產額(TRo/ABS)、捕獲能量中用于電子傳遞的量子產額(ETo/TRo)等參數(shù)：

ΔVt=Δ[(Ft-FO)/( Fm- FO)]；

ABS/RC=4×(FK-FO)×FM/(FJ-FO)/ (FM-FO);

WK=(FK-FO)/(FJ-FO)；

TRo/ABS=(FM-FO)/FM;

3.1.1 如果對手競技水平相對于自己較差，這樣運動員往往會出現(xiàn)精神狀態(tài)不緊張、攻擊意識不強、低估敵人的能力現(xiàn)象，認為自己可以自由發(fā)揮，輕而易舉就能拿下比賽。對自己也沒有了進攻和防守的欲望。這時球員在身體和心理上都是非常放松的狀態(tài)，慢慢這場比賽輸?shù)娘L險被逐漸顯露出來，那么一旦比賽處于不利狀態(tài)，情緒開始暴躁，心理也受到了波動，比賽節(jié)奏已經超出控制，逐漸失去自我控制。這時的運動員很難再回到合適的比賽狀態(tài)。（見表1）

ETo/TRo=(FM-FJ)/(FM-FO)；

其中, FM=FP，F(xiàn)O、FK、FJ和FP分別為暗適應后20μs、300μs、3ms和30ms及最大瞬時熒光值。

根據(jù)820nm的光吸收曲線(由735±15nm的遠紅光誘導)，以820nm光吸收的最大值和最小值差值的相對值(ΔI/I0)作為衡量PSⅠ 最大氧化還原能力的指標。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2003軟件對數(shù)據(jù)進行處理和繪圖，采用DPS軟件對不同處理的測定結果進行統(tǒng)計分析。采用最小差異顯著法(LSD,α=0.05)比較不同處理之間的差異顯著性。

2結果與分析

2.1強光下脫水和SHAM處理對平邑甜茶葉片水勢的影響

圖1顯示，平邑甜茶離體葉片的水勢隨脫水時間的延長而逐漸下降，其在脫水前、脫水2h和脫水4h分別約為-0.5MPa,、-0.8MPa和-1.5MPa，且其間均存在顯著性差異(P<0.05)。整個脫水處理過程中，對照組和SHAM處理組之間葉片水勢不存在顯著差異。

2.2強光下脫水和SHAM處理對平邑甜茶葉片不同呼吸途徑的影響

從表1可以看出，隨著水分脅迫程度的增加，對照組平邑甜茶葉片的總呼吸和AOX呼吸均顯著升高，與脫水前相比，脫水2h時總呼吸和AOX呼吸分別上調了15.1%和41.7%，脫水4h時分別上調了29.4%和83.7%。而同期COX呼吸途徑的活性雖然輕微增加(P>0.05)，但其所占總呼吸的比例不升反而顯著下降。而SHAM處理組的平邑甜茶葉片總呼吸速率和AOX呼吸速率明顯下降，且整個脫水過程中SHAM對AOX途徑抑制效果穩(wěn)定。這表明脫水過程中平邑甜茶葉片總呼吸的增加主要是由于AOX呼吸途徑增加導致的。

不同小寫字母表示處理時間之間在0.05水平存在顯著性差異；下同圖1　強光下脫水過程中平邑甜茶葉片水勢的變化The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.The same as belowFig. 1　Changes in the water potential of M. hupehensis leaves during dehydration with light

處理Treatment脫水時間Dehydrationtime/h總呼吸Totalrespiration/(μmol·m-2·s-1)AOX呼吸AOXrespiration/(μmol·m-2·s-1)COX呼吸COXrespiration/(μmol·m-2·s-1)AOX呼吸/總呼吸AOXrespiration/Totalrespiration/%COX呼吸/總呼吸COXrespiration/Totalrespiration/%CK02.92±0.45c0.78±0.13c2.14±0.32a27±4c73±10a23.36±0.21b1.11±0.08b2.25±0.13a33±2b67±9b43.78±0.48a1.45±0.13a2.34±0.35a38±3a62±10bSHAM02.47±0.25b0.32±0.05b2.16±0.21a13±3d87±11a22.74±0.33a0.43±0.03a2.31±0.3a16±2d84±10a42.84±0.32a0.49±0.05a2.36±0.27a17±4d83±11a

注：不同字母表示同一處理不同脫水時間之間在0.05水平存在顯著性差異；下同

Note:Differentlettersinthesametreatmentbutdifferentdehydrationtimesindicatesignificantdifferenceamongtreatmentsat0.05level；Thesameasbelow.

2.3強光下脫水及SHAM處理對平邑甜茶葉片快速葉綠素熒光誘導曲線的影響

2.4強光下脫水及SHAM處理對平邑甜茶葉片的葉綠素熒光參數(shù)的影響

為了闡明水分脅迫下，AOX呼吸途徑對平邑甜茶葉片PSⅡ反應中心和光合電子傳遞鏈的影響，進一步分析了相關的葉綠素熒光參數(shù)。由圖3，A可以看出，隨著脫水程度的增加，反映PSⅡ最大光化學效率的參數(shù)(TRo/ABS)逐漸下降， 而SHAM處理的TRo/ABS進一步下降，表明失水脅迫下平邑甜茶葉片發(fā)生了光抑制，而抑制AOX途徑后加重了失水脅迫下的光抑制程度。同時，WK的上升可作為葉片光合電子傳遞鏈P680供體側受抑的標志，且與放氧復合體(OEC)的受損有關[21-22]。在脫水過程中，脫水處理和SHAM處理均未使平邑甜茶葉片WK出現(xiàn)明顯差異(圖3，B)，說明脫水處理和脫水過程中抑制AOX途徑處理對PSⅡ供體側均無明顯影響。另外，隨著脫水處理時間的延長，平邑甜茶葉片的ABS/RC顯著升高，而其ETo/TRo顯著下降；而SHAM處理進一步加劇了葉片ABS/RC升高和ETo/TRo下降的幅度，且大多達到顯著水平。這表明脫水過程中抑制AOX途徑后進一步降低了PSⅡ的光能吸收、轉換和兩個光系統(tǒng)之間的電子傳遞。

圖2　SHAM處理下脫水過程中平邑甜茶葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的變化Fig. 2　Changes of the fast chlorophyll a fluorescence transient in M. hupehensis leaves during dehydration andSHAM application

圖3　SHAM處理下脫水過程中平邑甜茶葉片的快速葉綠素熒光參數(shù)的變化Fig. 3　Changes of the prompt fluorescence parameters in M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

圖4　SHAM處理下脫水過程中平邑甜茶葉片820 nm 光反射(遠紅光測定)的變化Fig. 4　Changes of kinetic curves of modulated 820 nm reflection (measured with far red light) in M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

2.5強光下脫水及SHAM處理對平邑甜茶葉片PSⅠ活性的影響

單純的水分脅迫并未使遠紅光誘導的820nm光吸收曲線的形狀發(fā)生明顯變化(圖4，A)；而用SHAM抑制AOX途徑后，隨著水分脅迫程度的增加， 820nm光吸收曲線的振幅逐漸變小(圖4，B)。同時，ΔI/Io反映了PSⅠ反應中心P700的最大氧化還原能力，表示PSⅠ的活性[23]。由圖5可知，隨著脫水時間的延長，對照組平邑甜茶葉片PSⅠ的活性沒有顯著影響；在正常水分條件下(0h)，AOX途徑受抑對平邑甜茶葉片PSⅠ的活性也沒有顯著影響，但在水分脅迫下，抑制AOX呼吸顯著降低了PSⅠ的活性，且時間越長抑制程度越嚴重。以上結果說明平邑甜茶葉片PSⅠ 在強光及脫水脅迫下未發(fā)生光抑制，而其在SHAM抑制AOX途徑后和脫水脅迫下卻發(fā)生光抑制，且脫水脅迫時間越長，PSⅠ光抑制越嚴重。

3討論

本研究結果表明，強光下平邑甜茶葉片線粒體中AOX的活性隨著脫水脅迫程度的增加而明顯上升；當抑制AOX途徑后，進一步加重了平邑甜茶葉片脫水過程中的光抑制，說明脫水脅迫下，線粒體中AOX途徑在平邑甜茶的光破壞防御中起著重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，低溫、高溫、干旱、病原菌感染等逆境脅迫會誘導植物AOX活性的上調[12，24-26]，推測這可能是由于逆境脅迫下呼吸鏈復合物過度還原將導致活性氧的產生，植物可通過激活AOX途徑來維持電子傳遞能力，降低氧化損傷[27]。但以上對逆境下AOX的研究大都集中在擬南芥、小麥、豌豆等草本植物，木本植物中并未探究。本實驗首次在木本植物中證明了干旱脅迫下AOX活性上升這一點。

圖5　SHAM處理下失水脅迫下平邑甜茶葉片PSⅠ最大氧化還原能力(ΔI/Io)的變化Fig. 5　Changes of the maximum PSⅠ redox activity (ΔI/Io) of M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

以往關于干旱下AOX途徑的研究大部分是將AOX途徑作為一條純粹的呼吸電子傳遞鏈，關注的焦點多放在代謝、產熱、抗病以及活性氧的產生和消耗方面[28-30]，但對AOX途徑的光破壞防御作用極少研究。雖然Carlos等研究了干旱下AOX途徑能保護光合電子傳遞[12]，但該研究并未探究干旱下AOX途徑對光合系統(tǒng)具體的保護位點。我們知道，光合作用電子傳遞是由PSⅠ和PSⅡ協(xié)調作用共同完成的，無論是PSⅠ還是PSⅡ受到傷害，都會導致光合能力的下降。為了探討干旱下AOX途徑對光合電子傳遞具體的保護位點，我們接下來分析了熒光參數(shù)。

葉綠素熒光誘導動力學曲線中K點的出現(xiàn)是PSⅡ供體側放氧復合體(OEC)受傷害的一個標志[31]；PSII捕獲能量中用于電子傳遞的量子產額(ETo/TRo)，與PQ庫氧化還原的比例有關[32]。本研究中，脫水及SHAM處理均未引起WK發(fā)生明顯變化，說明水分脅迫和SHAM處理對平邑甜茶葉片PSⅡ供體側沒有明顯影響。但SHAM處理后進一步增加了葉片脫水過程中ABS/RC的上升，說明AOX途徑受抑后進一步加劇了PSⅡ反應中心的失活，即AOX途徑對失水過程中的PSⅡ反應中心具有一定的保護作用；而SHAM處理后ETo/TRo的下降又說明AOX受抑后降低了水分脅迫下PSⅡ與PSⅠ之間電子傳遞。

PSⅠ受體側的電子傳遞，除了受PSⅡ活性和受體側電子傳遞體的影響外，同時也受PSⅠ活性的影響[33]。PSⅠ光抑制的典型指標是其最大氧化還原能力(ΔI/Io)的下降[31]。本研究中，ΔI/Io在水分脅迫下并無明顯變化，而用SHAM抑制AOX途徑后，ΔI/Io顯著下降，說明AOX途徑對脫水葉片的PSⅠ具有重要的保護作用。

綜上所述，線粒體中AOX活性的主動上調，在水分脅迫下平邑甜茶葉片的光破壞防御中發(fā)揮著重要的作用，特別是對PSⅠ具有重要的保護作用。至于干旱脅迫下AOX途徑在蘋果屬植物中具體的光破壞防御機制，我們將進一步研究。

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(編輯:裴阿衛(wèi))

RoleofMitochondrialAlternativeOxidase(AOX)inPhotoprotectioninAppleDetachedLeafunderWaterStress

XUXiuyu1,2,CHENGLailiang1,JINLiqiao2,SUNShan1*,LIUMeijun2

(1ShandongInstituteofPomology,Taian,Shandong271000,China; 2CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,China)

Abstract:The purpose of this study is to explore the role of mitochondrial alternative oxidase (AOX) in photoprotection in apple leaves under water stress. After treated with salicylhydroxamic acid (SHAM) to inhibit the AOX pathway, we studied the effects of AOX pathway on photoprotection in Malus hupehensis detached leaves under water stress by simultaneously analyzing chlorophyll a fluorescence transient and light absorbance at 820 nm. The results indicated that water stress induced the up-regulation of AOX activity. The inhibition of AOX pathway caused more severe photoinhibition. Under water stress, maximum quantum yield of primary PSⅡ photochemistry (TRo/ABS) and PSⅡ trapped electron being transferred from QA to QB (ETo/TRo) decreased, average absorbed photon flux per PSⅡ reaction center (ABS/RC) increased, while the maximum PSⅠ redox acitity(ΔI/Io) was not affected. After treated with SHAM to inhibit the AOX pathway, ABS/RC markedly increased, TRo/ABS, ETo/TRo as well as ΔI/Io significantly decreased. It was indicated that under water stress the inhibition of AOX pathway caused more severe photoinhibition, especially to the PSⅠ. Generally, the results demonstrate that the AOX pathway played an important role in the photoprotection in M. hupehensis leaves under water stress, particularly in the photoprotection of PSⅠ.

Key words:apple；Malus hupehensis Rehd.; water stress; mitochondrial alternative oxidase; photoprotection

文章編號:1000-4025(2016)05-0964-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0964

收稿日期:2016-01-25;修改稿收到日期:2016-04-30

基金項目:山東省自然科學基金(ZR2012CM039)、泰山學者建設工程專項經費和作物生物學國家重點實驗室開放基金(2012KF05)

作者簡介:徐秀玉(1988-)，女，博士研究生，主要從事光合作用與抗逆生理方面的研究。E-mail:xxy555111@163.com *通信作者:孫山，博士，研究員，主要從事果樹生理與品質資源研究。E-mail:sunshan03@163.com

中圖分類號:Q945.78

文獻標志碼:A