柳樹β微管蛋白基因家族的克隆和序列分析

睢金凱，饒國棟,2，張建國,2*

(1 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

柳樹β微管蛋白基因家族的克隆和序列分析

睢金凱1，饒國棟1,2，張建國1,2*

(1 國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037)

摘要:該研究克隆鑒定了旱柳和龍爪柳β微管蛋白基因，并對其進(jìn)行了序列相似性、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位以及表達(dá)模式的分析。結(jié)果顯示，2種柳樹β微管蛋白基因家族各有20個(gè)成員，家族內(nèi)部成員間核酸和氨基酸序列相似性分別在74.0%和86.6%以上，種間同源蛋白氨基酸序列相似性在85.8%以上，柳樹與其它植物β微管蛋白間的氨基酸序列相似性在81.5%以上。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，柳樹β微管蛋白家族被分為4個(gè)亞組，結(jié)合楊樹β微管蛋白基因染色體定位，推測柳樹β微管蛋白基因家族經(jīng)歷了楊柳科全基因組重復(fù)事件和串聯(lián)重復(fù)事件，而柳樹TUB11和TUB12可能來源于區(qū)段重復(fù)或者轉(zhuǎn)座。基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員的表達(dá)具有一定的組織特異性，并且部分重復(fù)基因?qū)υ谒鶛z測組織中表達(dá)差異較大。柳樹β微管蛋白基因家族成員序列的高度相似性、成員數(shù)量的進(jìn)化擴(kuò)張、以及表達(dá)模式的多樣性可能賦予了細(xì)胞分裂與生長更高的靈活性，這對多年生木本植物的生長發(fā)育習(xí)性意義重大。

關(guān)鍵詞:柳樹；β微管蛋白；系統(tǒng)發(fā)育；序列相似性；表達(dá)模式

微管(MT)是由α微管蛋白(TUA)和β微管蛋白(TUB)構(gòu)成的異質(zhì)二聚體，它是真核生物細(xì)胞骨架的重要組成部分，在細(xì)胞有絲分裂[1]和減數(shù)分裂[2]中具有重要作用，植物微管骨架參與冷信號的傳導(dǎo)[3]，參與細(xì)胞的形態(tài)建成[4]，并在植物細(xì)胞壁形成過程中引導(dǎo)纖維素微纖維的沉積[5]。因此，研究微管蛋白可能會有助于揭示植物的形態(tài)建成或植物外部形態(tài)形成的分子機(jī)制。

早期發(fā)現(xiàn)的動物、植物、原生生物和真菌中的TUA和TUB蛋白氨基酸序列相似性高達(dá)88%以上[6-12]。到目前為止，很多植物的微管蛋白基因已被克隆或鑒定，如擬南芥的6個(gè)TUA[13]和9個(gè)TUB基因[14]，毛果楊(PopulustrichocarpaTorr. & Gray)的8個(gè)TUA和20個(gè)TUB基因[15]，美洲山楊(PopulustremuloidesMichx.)的8個(gè)TUA和20個(gè)TUB基因[15]，玉米(ZeamaysL.)的6個(gè)可編碼TUA基因[16]和8個(gè)有功能的TUB基因[17]，水稻(OryzasativaL.)中有4個(gè)TUA基因[18]和8個(gè)TUB基因[19]等。

本研究以中國特有的旱柳(SalixmatsudanaKoidz.)及其變種龍爪柳[S.matsudanavar.tortusoa(Vilm.)Rehd.][20]為材料，克隆了2種柳樹的TUB基因，并對克隆的基因進(jìn)行了組織特異性表達(dá)分析，進(jìn)行了核酸和氨基酸序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析以及染色體定位，為木本植物微管蛋白的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

基因克隆以旱柳與龍爪柳水培苗葉片作為RNA提取材料；實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)所用的一年生枝條材料于成年大樹上采集，成樹生長于北京植物園。

簸箕柳(S.suchowensisW. C. Cheng ex G. Zhu)TUB基因通過本地Blast獲得，其基因組數(shù)據(jù)下載于http://115.29.234.170/willow/；毛果楊TUB基因下載于毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov /pz/portal.html)；擬南芥TUB基因下載于擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)；水稻、玉米、高粱(SorghumbicolorL.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyum(L.) Beauv.)和狗尾草(Setariaviridis(L.) Beauv.)等植物TUB基因通過Blast搜索Genbank數(shù)據(jù)庫獲得。

1.2方法

1.2.1柳樹TUB基因的克隆以毛果楊β微管蛋白氨基酸序列為探針Blast搜索Genbank數(shù)據(jù)庫，篩選獲得20個(gè)鉆天柳(Choseniaarbutifolia(Pall.) A. Skv.)TUB基因。由于TUB基因在各物種間的保守性很高，旱柳、龍爪柳與鉆天柳又同屬于楊柳科柳屬植物，因此本研究以鉆天柳TUB基因?yàn)槟０?，利用NCBI的在線引物設(shè)計(jì)工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)設(shè)計(jì)引物，克隆旱柳與龍爪柳TUB基因。利用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)和SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行旱柳與龍爪柳總RNA提取和cDNA第一鏈合成，PCR克隆采用2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)進(jìn)行。所用引物如表1所示?？寺∷@得的CDNA片段由北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司測序。

1.2.2TUB基因家族序列比對利用Bioedit軟件將克隆獲得的旱柳和龍爪柳TUB基因編碼區(qū)(CDS)翻譯成氨基酸序列，與鉆天柳、簸箕柳、毛果楊、擬南芥、水稻、玉米、高粱、二穗短柄草和狗尾草等TUB基因進(jìn)行物種間和物種內(nèi)部核酸和氨基酸序列比對，分析TUB基因家族在同一物種不同成員間的序列相似性，以及在不同物種中的保守性。

1.2.3TUB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析利用ClustalW將柳樹與其它植物的TUB氨基酸序列進(jìn)行序列比對，使用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)，分支可信度檢測自展值(bootstrap)為1 000次重復(fù)，氨基酸替換模型選用JTT(Jones-Taylor-Thornton)模型[21]，缺失位點(diǎn)處理方法為完全刪除。

1.2.4TUB基因的染色體定位利用基因家族全基因組定位工具WGMapping(http://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v3_dicots/genome_mapping/index)分析TUB基因在其染色體上的定位。

1.2.5柳樹TUB基因家族的實(shí)時(shí)定量PCR將旱柳(Sm)與龍爪柳(Smt)一年生枝條分基部(S1)、中段(S2)、上部伸長區(qū)(S3)和莖尖(S4)4個(gè)部位分別提取RNA，利用SYBR?Fast qPCR Mix試劑盒(Takara)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，分析TUB基因在2種柳樹一年生枝條不同部位的表達(dá)模式。

表1　柳樹β微管蛋白基因引物

2結(jié)果與分析

2.1TUB基因家族序列相似性

克隆獲得旱柳和龍爪柳TUB基因各20個(gè)，家族成員開放讀碼框(ORF)長度范圍為1 335～1 353 bp，核酸序列相似性分別為74.1%～99.5%和74.0%～99.9%。預(yù)測的蛋白質(zhì)氨基酸序列長度為445～451。旱柳中SmTUB2和SmTUB11基因編碼的氨基酸序列相同，SmTUB7和SmTUB12編碼的氨基酸序列相同，其它成員間的氨基酸序列相似性為86.6%～98.8%。龍爪柳中SmtTUB7和SmtTUB12基因編碼的氨基酸序列相同，其它成員間的氨基酸序列相似性為87.0%～99.5%。雖然柳樹TUB蛋白保守性很高，但其C末端也像其它植物一樣是多變的。旱柳SmTUB4、SmTUB6、SmTUB10、SmTUB14-15、SmTUB17、SmTUB19-20與龍爪柳直系同源蛋白的氨基酸序列完全一致，其它直系同源蛋白的氨基酸序列相似性為98.0%～99.7%；旁系同源蛋白相似性為85.8%～99.7%。

將柳樹TUB與其它被子植物β微管蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)TUB在被子植物中非常保守。其中，旱柳SmTUB4、SmTUB14和SmTUB19與鉆天柳直系同源蛋白的氨基酸序列完全一致；SmTUB14與毛果楊直系同源蛋白的氨基酸序列完全一致；而簸箕柳的TUB家族成員在搜索過程中只獲得了12條完整序列，沒有發(fā)現(xiàn)與旱柳完全一致的TUB同源蛋白。旱柳與上述3種楊柳科植物的其它TUB直系同源蛋白間的序列相似性則依次為95.9%～99.7%、91.5%～99.7%和90.5%～99.7%，旁系同源蛋白的序列相似性依次為85.8%～99.3%、85.6%～99.1%和81.5%～98.8%。相比之下，旱柳與其它被子植物如擬南芥、水稻、玉米、高粱、二穗短柄草和狗尾草中TUB同源蛋白的氨基酸序列相似性稍低，依次為86.0%～97.1%、86.8%～97.7%、86.6%～97.3%、87.0%～97.3%、88.8%～96.8%和88.8%～96.6%。

由于和旱柳親緣關(guān)系非常近，龍爪柳與其它植物TUB同源蛋白間的序列相似性與旱柳中情況基本相同。它與鉆天柳間完全一致的直系同源蛋白同樣為TUB4、TUB14和TUB19；與毛果楊除TUB14外還有TUB18也完全一致；與簸箕柳間同樣沒有發(fā)現(xiàn)一致的TUB直系同源蛋白。龍爪柳與以上3種植物的其它TUB直系同源蛋白間的序列相似性依次為95.9%～99.7%、90.9%～99.5%和90.5%～99.7%，旁系同源蛋白間的序列相似性依次為86.0%～99.3%、85.8%～99.3%和81.8%～98.8%。同旱柳一樣，龍爪柳與擬南芥、水稻、玉米、高粱、二穗短柄草和狗尾草中TUB同源蛋白的氨基酸序列相似性也低于楊柳科植物，序列相似性數(shù)據(jù)依次為86.2%～97.3%、87.0%～97.7%、86.8%～97.3%、87.2%～97.5%、89.0%～96.8%和 89.0%～96.6%。

2.2TUB蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

TUB蛋白家族在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了顯著的擴(kuò)張，其中包括雙子葉植物全基因組復(fù)制事件、楊柳科植物全基因組復(fù)制事件以及串聯(lián)重復(fù)，最終使得楊柳科的4個(gè)物種旱柳、龍爪柳、鉆天柳和毛果楊TUB基因進(jìn)化為現(xiàn)在的各20個(gè)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，TUB蛋白家族可分為四大類(圖1)，這與Oakley等[15]的研究一致。第一類包括Class I與Class I-like，其成員最多，占全部分析序列的41.13%(51/124)。這一分支中包含SmTUB、SmtTUB與CaTUB各8個(gè)，約占各自成員總數(shù)的一半，而PtTUB則正好有一半聚類在此分支中。由于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不緊密，3種柳樹各有2個(gè)TUB蛋白(SmTUB9～10、SmtTUB9～10與CaTUB9～10)被劃分在Class I-like中，毛果楊中有4個(gè)TUB蛋白(PtTUB9～12)歸于此類。此外，Class I中包含有2個(gè)主要由單子葉植物TUB蛋白組成的小分支，其中包括12個(gè)單子葉TUB和1個(gè)擬南芥TUB(AtTUB6)。

第二分支Class Ⅱ成員數(shù)僅次于Class I，所占比例為33.87%(42/124)。其中大部分為雙子葉植物TUB蛋白，包括6個(gè)旱柳(SmTUB1、SmTUB2/11、SmTUB3～6)、7個(gè)龍爪柳(SmtTUB1～6和SmtTUB11)、7個(gè)鉆天柳(CaTUB1～6和CaTUB11)、6個(gè)楊樹(PtTUB1～6)、5個(gè)簸箕柳(SsTUB1和SsTUB3～6)與3個(gè)擬南芥TUB(AtTUB2、AtTUB7 和AtTUB8)；單子葉植物TUB只有玉米(ZmTUB1)、高粱(SbTUB2)、水稻(OsTUB2)和二穗短柄草(BdTUB2)各1個(gè)，4個(gè)單子葉植物TUB獨(dú)成一支。

第三和第四分支成員較少，分別為16和19個(gè)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也比較簡單，其中單、雙子葉植物TUB都是分開聚類，且Class Ⅲ與Class Ⅳ中各有2個(gè)擬南芥TUB自成一支，分別為AtTUB1、AtTUB5和AtTUB4、AtTUB9。Class Ⅲ中包括10個(gè)楊柳科TUB，旱柳、龍爪柳、鉆天柳、簸箕柳和毛果楊蛋白各2個(gè)，分別是SmTUB19～20、SmtTUB19～20、CaTUB19～20、SsTUB19～20和PtTUB19～20，這些蛋白的一個(gè)共同特點(diǎn)是都在其序列第39位上比其它TUB蛋白多了3個(gè)氨基酸殘基，而其它蛋白在39位及其附近也是比較多變的。本分支的4個(gè)單子葉植物TUB分別為OsTUB8、SbTUB6、ZmTUB3和ZmTUB4。Class Ⅳ中包括2個(gè)旱柳TUB(SmTUB7/12和SmTUB8)、2個(gè)龍爪柳TUB(SmtTUB7/12和SmtTUB8)、2個(gè)鉆天柳TUB(CaTUB7/12和CaSmTUB8)、2個(gè)毛果楊TUB(PtTUB7和PtTUB8)和1個(gè)簸箕柳TUB(SsTUB8)，共9個(gè)楊柳科TUB蛋白。另外還包括3個(gè)水稻、3個(gè)高粱、1個(gè)玉米和1個(gè)二穗短柄草共8個(gè)單子葉植物TUB蛋白。

2.3TUB基因家族染色體定位分析

TUB基因染色體定位顯示，20個(gè)PtTUB基因分布在超過半數(shù)的染色體上(10/19)。其中1號染色體上分布的TUB基因最多(6個(gè))；其次是9號染色體，分布有3個(gè)；3、6和16號染色體各分布有2個(gè)，而其余染色體(2、5、11、12和15號)上各有1個(gè)。毛果楊全基因組測序[22]表明楊樹至少經(jīng)歷了三次全基因組重復(fù)事件，以及后來的多區(qū)段重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)和轉(zhuǎn)座。對比最近的一次楊柳科全基因組復(fù)制事件后楊樹染色體連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)20個(gè)楊樹TUB基因都經(jīng)歷了本次復(fù)制事件，并且定位在重復(fù)區(qū)段的2個(gè)基因都被保留下來(圖2)。其中，TUB3和TUB9、TUB4和TUB10、TUB13和TUB15以及TUB14和TUB16等4對基因還發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)，然而它們的進(jìn)化歷史并不相同。因?yàn)椋到y(tǒng)發(fā)育分析顯示前2對串聯(lián)重復(fù)基因中TUB3和TUB4的關(guān)系較近，同樣TUB9和TUB10也在同一個(gè)分支上，據(jù)此推測它們是先經(jīng)歷了串聯(lián)重復(fù)事件，由一個(gè)祖先基因進(jìn)化成為TUB3/4和TUB9/10，然后發(fā)生了楊柳科基因組重復(fù)事件使得2個(gè)基因加倍至4個(gè)：TUB3、TUB4、TUB9和TUB10。相反，后2對基因則是TUB13和TUB15進(jìn)化關(guān)系較近，而TUB14和TUB16在同一分支，因此可以推測它們先由一個(gè)祖先基因經(jīng)過基因組重復(fù)事件進(jìn)化成TUB13/15和TUB14/16等2個(gè)基因，隨后又發(fā)生串聯(lián)重復(fù)造成基因加倍，形成4個(gè)基因。

標(biāo)尺表示JTT模型下估算的單位遺傳距離；SmTUB1～ SmTUB20，本研究克隆的20個(gè)旱柳TUB蛋白；SmtTUB1～ SmtTUB20，本研究克隆的20個(gè)龍爪柳TUB蛋白；SsTUB1～SsTUB6、SsTUB8～SsTUB10、SsTUB14和SsTUB8～SsTUB10，本地blast獲得的14個(gè)簸箕柳TUB蛋白；CaTUB1～CaTUB20，20個(gè)鉆天柳TUB蛋白；PtTUB1～PtTUB20，20個(gè)毛果楊TUB蛋白；AtTUB1～AtTUB9，9個(gè)擬南芥TUB蛋白；OsTUB1～ OsTUB8，8個(gè)水稻TUB蛋白；ZmTUB1～ ZmTUB7，7個(gè)玉米TUB蛋白；SbTUB1～ SbTUB6，6個(gè)高粱TUB蛋白；BdTUB1～ BdTUB5，5個(gè)二穗短柄草TUB蛋白；SvTUB1～SvTUB2，2個(gè)狗尾草TUB蛋白圖1　植物TUB蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析The bar means unit genetic distance estimated by JTT model; SmTUB1～ SmTUB20, 20 S. matsudana TUB proteins cloned in this study; SmtTUB1～ SmtTUB20, 20 S. matsudana var. tortusoa TUB proteins cloned in this study; SsTUB1～SsTUB6, SsTUB8～SsTUB10, SsTUB14 and SsTUB8～SsTUB10, 14 S.suchowensis TUB proteins obtained by local blast; CaTUB1～CaTUB20, 20 C. arbutifolia TUB proteins; PtTUB1～PtTUB20, 20 P. trichocarpa TUB proteins; AtTUB1～AtTUB9, nine A. thaliana TUB proteins; OsTUB1～ OsTUB8, eight O. sativa TUB proteins; ZmTUB1～ ZmTUB7, seven Z. mays TUB proteins; SbTUB1～ SbTUB6, six S. bicolor TUB proteins; BdTUB1～ BdTUB5, five B. distachyon TUB proteins; SvTUB1～SvTUB2, two S. viridis TUB proteinsFig. 1　Phylogenetic analysis of plant TUB proteins

共線性分析表明柳樹與楊樹染色體結(jié)構(gòu)高度相似[23]，據(jù)此推測柳樹TUB基因家族同樣經(jīng)歷了三次全基因組重復(fù)事件和串聯(lián)重復(fù)事件，導(dǎo)致其家族成員劇增到20個(gè)。然而，柳樹TUB11和TUB12基因(圖2)的進(jìn)化歷史與楊樹不同，楊樹PtTUB11和PtTUB12共同聚類在Class I-like中，而柳樹TUB11卻與TUB1和TUB2共同聚類在Class Ⅱ中，TUB12與TUB7氨基酸序列相同，并與TUB8聚類在Class Ⅳ中。因此，與楊樹不同，柳樹TUB11和TUB12不是來源于同一個(gè)祖先基因，它們可能是由TUB1/TUB2和TUB7分別通過區(qū)段重復(fù)或轉(zhuǎn)座產(chǎn)生。

虛線連接的是TUBs復(fù)制基因，實(shí)線連接的是柳樹TUB11和TUB12以及它們可能的重復(fù)基因。圖2　TUB基因染色體定位與基因重復(fù)事件The duplicated paralogous pairs of TUBs are connected with dotted lines. TUB11 and TUB12 from Salix are connected with their potential duplicated paralogous with solid linesFig. 2　Chromosomal location and gene duplication events of TUB genes

2.4柳樹TUB基因表達(dá)模式

近半數(shù)(9個(gè))柳樹TUB基因在所檢測組織中不表達(dá)，其中大部分是重復(fù)基因。Class I中只檢測到TUB13和TUB18在旱柳和龍爪柳枝條基部(S1)、中部(S2)、伸長區(qū)(S3)和頂端(S4)4個(gè)組織中表達(dá)(圖3)，且相對表達(dá)水平都很低(最高相對表達(dá)量為0.007 121)。在旱柳中，TUB13和TUB18在枝條的頂端表達(dá)水平最高，基部次之，中部和伸長區(qū)較低；而在龍爪柳中，SmtTUB13在枝條伸長區(qū)表達(dá)水平最高，其次是頂端分生區(qū)、基部和中部，SmtTUB18枝條頂端和伸長區(qū)表達(dá)水平都比較高，其次是基部和中部。作為TUB13的重復(fù)基因，TUB14、TUB15和TUB16均不在上述組織中表達(dá)；TUB17作為TUB18的重復(fù)基因也不表達(dá)。Class I-like中的2個(gè)基因TUB9和TUB10也不在上述組織中表達(dá)，而它們的重復(fù)基因TUB3和TUB4(Class Ⅱ)在上述4個(gè)組織中都有表達(dá)。

Class Ⅱ中的TUB11是上述4個(gè)柳樹組織中的主要表達(dá)基因(圖3)，相對表達(dá)水平均在0.25以上，在旱柳枝條伸長區(qū)的表達(dá)水平最高(相對表達(dá)量為9.05)，而在龍爪柳相應(yīng)組織中的表達(dá)水平明顯低于旱柳(相對表達(dá)量為1.80)，該基因在2種柳樹的頂端中表達(dá)水平也比較高且表達(dá)水平相當(dāng)，而在枝條中部和基部表達(dá)水平較低。TUB1和TUB2作為TUB11的重復(fù)基因是除TUB11外表達(dá)量較高的基因，TUB3和TUB4次之。而旱柳TUB1～4在的枝條中部和頂端表達(dá)水平均高于龍爪柳，伸長區(qū)表達(dá)水平與龍爪柳相當(dāng)；TUB2在龍爪柳枝條基部表達(dá)水平高于旱柳。TUB5和TUB6在兩種柳樹的上述4個(gè)組織中均未表達(dá)。

Sm. 旱柳；Smt. 龍爪柳；S1. 枝條基部；S2. 枝條中部；S3. 枝條伸長區(qū)；S4. 枝條頂端圖3　柳樹TUB基因表達(dá)模式Sm. S. matsudana; Smt. S. matsudana var. tortusoa; S1. Basal region of branch; S2. Middle region of branch; S3. Elongation region of branch; S4. Apical region of branchFig. 3　The expression profile of TUB in willows

Class Ⅲ中只有TUB19表達(dá)(圖3)，該基因在2種柳樹的枝條頂端表達(dá)水平最高，在龍爪柳枝條伸長區(qū)表達(dá)水平也比較高，在其它組織中表達(dá)水平較低。未檢測到其重復(fù)基因TUB20在上述組織中表達(dá)。Class Ⅳ中的3個(gè)基因(由于TUB7和TUB12核酸序列相似性非常高，導(dǎo)致無合適引物可以將2個(gè)基因的表達(dá)水平分開測定)在上述組織中均有表達(dá)，其中TUB8在旱柳枝條伸長區(qū)的表達(dá)水平明顯高于旱柳和龍爪柳其它枝條組織。TUB7/12在旱柳枝條基部、中部、伸長區(qū)和頂端分生區(qū)的表達(dá)水平均高于龍爪柳的相應(yīng)組織，其中以在旱柳枝條伸長區(qū)的表達(dá)水平最高，中部、頂端分生區(qū)和基部依次次之；該基因在龍爪柳枝條各組織中表達(dá)水平高低次序依次為伸長區(qū)、中部、基部和頂端分生區(qū)。

3討論

通過克隆獲得旱柳和龍爪柳TUB基因各20個(gè)，與毛果楊和美洲山楊的TUB基因家族[15]成員數(shù)相等，且其家族內(nèi)部成員間核酸和氨基酸序列相似性也與楊樹相當(dāng)，甚至高于楊樹，在分子水平一定程度上說明旱柳和龍爪柳親緣關(guān)系很近，印證了中國植物志中龍爪柳是旱柳的變種一說[20]。旱柳和龍爪柳TUB蛋白家族成員的氨基酸序列高度保守，其C末端與其它植物一樣也是多變的，有研究表明TUB蛋白C末端調(diào)節(jié)微管的組裝[24]，決定微管多聚體的聚合效率[25]，可能構(gòu)成馬達(dá)蛋白的結(jié)合表面[26]，并且還是很多微管結(jié)合蛋白的互作區(qū)域[27-33]。因此，可以推測柳樹TUB蛋白的C末端也在其微管的組裝，及與微管結(jié)合蛋白的互作中起重要作用。

系統(tǒng)發(fā)育和染色體定位分析顯示，柳樹TUB基因家族同楊樹[22]一樣經(jīng)歷了3次全基因組重復(fù)事件，以及后來的區(qū)段重復(fù)、串聯(lián)重復(fù)和轉(zhuǎn)座等基因重復(fù)事件。柳樹與楊樹TUB11和TUB12在進(jìn)化上的區(qū)別暗示，在楊柳科植物基因組重復(fù)事件發(fā)生后楊屬和柳屬植物各自具有不同的進(jìn)化歷史。另外，由目前基因家族成員的數(shù)量判斷，楊柳科植物TUB基因家族的進(jìn)化擴(kuò)張比草本植物更明顯。比如，擬南芥中只有9個(gè)TUB基因[14]、玉米中目前只鑒定出8個(gè)TUB基因[17]、水稻中也只有8個(gè)TUB基因[19]等，而楊樹和柳樹都有20個(gè)TUB基因。這種基因擴(kuò)張的不對等可能對木本植物多年生的生長習(xí)性意義重大。

柳樹與楊樹TUB基因的表達(dá)模式差異較大，楊樹Class I和Class I-like亞組中的TUB9、TUB13、TUB15和TUB16是木質(zhì)部中的主要表達(dá)基因[15]，而柳樹一年生枝條4個(gè)組織中未檢測到TUB9、TUB15和TUB16的表達(dá)，且TUB13的表達(dá)水平也很低。相比之下，Class Ⅱ中的TUB11及其重復(fù)基因TUB1和TUB2在柳樹中的表達(dá)量最高，因此柳樹TUB11、TUB1和TUB2極有可能代替了楊樹TUB9、TUB13、TUB15和TUB16的功能，調(diào)節(jié)柳樹木質(zhì)部的生長發(fā)育。但是，柳樹TUB12并沒有像TUB11一樣在柳樹一年生枝條中高表達(dá)，暗示重復(fù)事件產(chǎn)生的新基因進(jìn)化命運(yùn)是不同的。另外，TUB13的重復(fù)基因TUB14、TUB15和TUB16，TUB18的重復(fù)基因TUB17，TUB3和TUB4的重復(fù)基因TUB9和TUB10，以及TUB19的重復(fù)基因TUB20等基因在所檢測組織中不表達(dá)，說明重復(fù)基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了功能缺失或功能分歧。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Sequence Analysis of β-Tubulin Gene Families in Willows

SUI Jinkai1, RAO Guodong1, 2, ZHANG Jianguo1, 2 *

(1 Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China; 2 Collaborative Innovation Center of Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Abstract:In this study, β-tubulin genes of Salix matsudana Koidz. and S. matsudana var. tortusoa (Vilm.)Rehd. were cloned and identified. The sequence similarity, phylogeny, chromosomal localization and expression patterns were further analyzed. The result showed that each willow contained 20 β-tubulin genes, and each gene shared more than 74.0% and 86.6% nucleotide and amino acid sequence similarity with one another in each willow species. There was over 85.8% amino acid sequence similarity of the β-tubulin between the two willows. While the amino acid sequence similarity among Salix and other plants were larger than 81.5%. In the phylogenetic analysis, β-tubulin proteins formed four classes, and it was presumed that Salix β-tubulin gene families had undergone salicoid duplication and tandem duplication events combined with the study of chromosomal location of poplar β-tubulin. However, TUB11 and TUB12 were possibly derived from segmental duplication or replicative transposition. The expression pattern analysis showed a tissue specificity of β-tubulin genes in willows, and a section of duplicated-gene pairs showed different expression patterns in tested tissues. High degree of sequence similarity, evolutionary expansion and of members and expression pattern diversity of Salix β-tubulin gene families might confer flexibility in cell division and growth which is of important significance to the development and growth habit of perennial woody plants.

Key words:willow; β-tubulin; phylogenetic; sequence similarity; expression pattern

文章編號:1000-4025(2016)05-0902-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0902

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-04-25

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31400569)

作者簡介:睢金凱(1985-)，男，博士，主要從事人工林定向培育研究。E-mail: suijinkai@163.com *通信作者:張建國，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事森林培育研究。E-mail: rgd@caf.ac.cn

中圖分類號:Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A