廣藿香香葉醇合酶基因克隆及表達(dá)分析

歐陽蒲月,曾少華，莫小路*

(1 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣州 510520；2 中國科學(xué)院華南植物園,廣州 510650)

廣藿香香葉醇合酶基因克隆及表達(dá)分析

歐陽蒲月1,曾少華2，莫小路1*

(1 廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院,廣州 510520；2 中國科學(xué)院華南植物園,廣州 510650)

摘要:香葉醇合酶(geraniol synthase，GES)是香葉醇形成過程中非常重要的酶，是萜類代謝途徑的限速酶。根據(jù)課題組廣藿香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的GES 轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)基因全長擴(kuò)增引物，采用RT-PCR方法克隆了廣藿香GES基因的全長cDNA序列。對(duì)該基因進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，并利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)了PcGES1基因在4個(gè)廣藿香栽培種中不同時(shí)期莖、葉中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：廣藿香GES基因包含一個(gè)完整的ORF框，長1 734 bp，編碼577個(gè)氨基酸，命名為PcGES1,GenBank登錄號(hào)為KF926075 ；PcGES1基因編碼的氨基酸序列與羅勒GES基因編碼的氨基酸序列最為相近。廣藿香GES蛋白定位在葉綠體中，無跨膜區(qū)域。PcGES1主要在葉中表達(dá)，老葉中表達(dá)量最高；從不同栽培種來看，PcGES1在石牌廣藿香和高要廣藿香中表達(dá)模式相似，在海南廣藿香與印尼廣藿香中表達(dá)相似，在海南廣藿香老葉中表達(dá)最高。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明廣藿香萜類代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:廣藿香；香葉醇合酶；萜類合成

香葉醇合酶(geraniol synthase，GES)是香葉醇形成過程中非常重要的酶，是環(huán)烯醚萜類成分合成途徑的限速酶。2007年，以色列科學(xué)家向西紅柿中成功地導(dǎo)入了一種檸檬羅勒基因，該基因能夠制造一種香葉醇合酶，從而使西紅柿產(chǎn)生類似檸檬的芳香氣味，花果香味的新型轉(zhuǎn)基因西紅柿誕生了。目前，香葉醇合酶基因的研究已經(jīng)被越來越多的科學(xué)家們所關(guān)注[1]。香葉醇是大多數(shù)藥用植物、香料植物產(chǎn)生香味的主要化學(xué)成分。前體物質(zhì)geranyl diphosphate (GDP)在香葉醇合酶的作用下生成香葉醇的中間體，進(jìn)而生成了香葉醇[1-2](圖1)。目前，在唇形科羅勒屬植物[3-4]、紫蘇屬植物[5]，樟科細(xì)毛樟[6]、夾竹桃科長春花[7]、敗醬科纈草與馬鞭草科甜舌草[8]中展開了香葉醇合酶的研究。

廣藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth]為唇形科刺蕊草屬植物，以全草入藥[9]，是“藿香正氣軟膠囊”、“藿香正氣丸(水)”、“保濟(jì)丸”等中成藥以及香料/化妝品等商品的主要原料。

廣藿香的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油，屬萜類化合物[10-11]。廣藿香作為一個(gè)自然分類群屬于亞洲熱帶種，原產(chǎn)東南亞菲律賓、馬來西亞等國。然自宋代從南洋傳入中國嶺南地區(qū)(今廣東)后，經(jīng)過長期人工栽培，在中國各地引種的廣藿香形態(tài)上雖有一些變異，但干燥藥材差別不明顯，采用傳統(tǒng)的形態(tài)組織學(xué)方法難以區(qū)分種內(nèi)的分化類型，且各地廣藿香含油量有所差異。廣藿香目前存在4個(gè)栽培種：石牌廣藿香、高要廣藿香、海南廣藿香和原產(chǎn)地的印尼廣藿香。文獻(xiàn)報(bào)道廣藿香揮發(fā)油化學(xué)組成與產(chǎn)地分布、種植和采收季節(jié)有關(guān)；廣藿香按其揮發(fā)油的成分可分為兩種類型：即酮型廣藿香(石牌廣藿香與高要廣藿香)和醇型廣藿香(海南廣藿香與原產(chǎn)地的印尼廣藿香),并認(rèn)為廣藿香存在產(chǎn)地及揮發(fā)油成分不同的分化類型，是適應(yīng)特定環(huán)境的結(jié)果，其本質(zhì)上由遺傳變異所決定[12]。

圖1　香葉醇的形成過程[1-2]Fig. 1　Synthesis process of geraniol[1-2]

為探索廣藿香各栽培品種間的遺傳差異與其揮發(fā)油成分之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)基于廣藿香的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，對(duì)廣藿香萜類代謝途徑中的香葉醇合酶進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析研究。

1材料和方法

1.1材料

4個(gè)廣霍香栽培種石牌廣霍香、高要廣霍香、海南廣霍香和印尼廣霍香種植于廣東省中藥研究所嶺南中藥園。選取海南廣藿香[P.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensis]葉，迅速放入裝有液氮的保溫瓶中，后置于-75℃冰箱保存?zhèn)溆?。本材料?jīng)廣東省中藥研究所蔡岳文老師鑒定。DH-5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1RNA提取取-75 ℃保存的葉，在180～200 ℃烘烤過的研缽中用液氮將其充分研磨，迅速倒入DEPC處理過的離心管中，待液氮揮發(fā)后，按100 mg材料1 mL 試劑的比例加入適量Trizol，下面的步驟按說明書(Tiangen DP421)進(jìn)行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000c)測(cè)定總RNA濃度和純度。

1.2.2cDNA合成初始反應(yīng)體系：Oligo dT(20 pmol/μL，廣州凱基生物有限公司)2 μL；RNA 10 μL；dNTPmix(25 μmol/L)2 μL；RNase-free ddH2O 12 μL。將反應(yīng)體系于65 ℃變性5 min，取出后置于冰上1 min以上，向初始反應(yīng)體系中加入下列試劑：5×first-strand buffer 8 μL；0.1 μmol/L DTT 4 μL；Superscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶(200 u/μL，Life公司)2 μL；H2O 2 μL。再將總反應(yīng)體系于42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min,于PCR儀上進(jìn)行第一鏈cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA可在-20 ℃保存。

1.2.3基因克隆根據(jù)廣藿香轉(zhuǎn)錄組中長為1 591 bp Unigene10850序列，利用ORF閱讀框預(yù)測(cè)其含有一個(gè)完整的開放閱讀框，并利用Primer3在線設(shè)計(jì)正向引物GES1-F(5’- AATTAAACTACCAAACAACATTA -3’)和 反向引物GES1-R(5’-AGTTTTTATGTACAAATCCACGCAT-3’)。PCR反應(yīng)體系：3 μL第一鏈cDNA(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍)為模板； 2.5 μL LA PCR buffer；2 μL正向及反向特異引物(10 mmol/L，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)；0.25 μL LATaqDNA聚合酶(日本寶生物有限公司)；用無菌去離子水將體系補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。結(jié)果檢測(cè)：取PCR 產(chǎn)物5 μL，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。將上述PCR產(chǎn)物割膠，使用凝膠回收試劑盒(日本寶生物有限公司)過柱回收?；厥粘绦蛞罁?jù)試劑盒說明書進(jìn)行。各取4.5 μL回收產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體(日本寶生物有限公司)過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂布培養(yǎng)，在氯芐抗性平板上進(jìn)行陽性克隆篩選，各取4～8個(gè)進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，后各取2個(gè)陽性克隆進(jìn)行雙向測(cè)序(廣州中美泰和生物技術(shù)有限公司)。

1.2.4序列的生物信息學(xué)分析先將所測(cè)得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast 搜索，初步確定這些基因的類別。使用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，再進(jìn)行PcGES基因的一系列分析。其編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)；PcGES蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)搜索分別采用在線工具ExPASy PROSITE (http://www.expasy.ch/prosite/)和美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。在線HMMOTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；在線分析氨基酸序列/疏水性分析(http://web.expasy.org/protscale)；用HMMTOP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)檢測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP4.0Server進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；利用WOLFPSORT (http://wolfpsort.org/) 進(jìn)行蛋白定位信號(hào)預(yù)測(cè)，使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域搜索。采用MEGA6.06軟件內(nèi)置的NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。所有軟件如無特殊說明，均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.5PcGES1基因表達(dá)分析取廣藿香4個(gè)栽培種的嫩葉、成熟葉、老葉、嫩莖、成熟莖和老莖等組織，同上方法提取各組織總RNA 1 μg，使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser (Takara) 進(jìn)行DNA消化和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈，并且將cDNA 原液稀釋10倍作為qPCR的模板。以actin(ACT)基因作為內(nèi)參，參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)說明書(日本寶生物有限公司)設(shè)計(jì)引物:PcACT基因上游引物5-GCTCCTAGCAGCATGAAGATCA-3，下游引物5-AGCATCAGCAGACAGCAATCAT-3；PcGES1基因上游引物5-GGAAGGATTTGAATGGGGAG-3，下游引物5-TGCTTGTACACCACTTGGGA-3。qPCR反應(yīng)在羅氏lightcycle480定量PCR儀上完成。反應(yīng)體系20 μL：SYBR premix Ex Taq Ⅱ(2x)10 μL, 正反引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，H2O 6.4 μL。qPCR 反應(yīng)程序采用兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，循環(huán)數(shù)40；反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)運(yùn)行溶解曲線程序，以確保目的產(chǎn)物的特異擴(kuò)增。以Actin作為內(nèi)參，使用2ΔΔCt方法來確定基因相對(duì)表達(dá)量，其中參照物表達(dá)量定為“1”[13]，表達(dá)數(shù)據(jù)運(yùn)用SigmaPlot10.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1廣藿香PcGES1基因的克隆

以海南廣藿香總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA序列，利用RT-PCR擴(kuò)增得到1條1 800 bp左右的條帶，對(duì)于擴(kuò)增所得條帶進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆檢測(cè)和測(cè)序后獲得1條1 828 bp的正確序列，利用NCBI的ORF Finder預(yù)測(cè)該序列含有一個(gè)完整的開放總計(jì)框，長1 734 bp，編碼577個(gè)氨基酸(圖2)。將該基因命名為PcGES1，GenBank登錄號(hào)為KF926075。

2.2PcGES1基因編碼蛋白特性分析

PcGES1基因預(yù)測(cè)編碼577個(gè)氨基酸，利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。推測(cè)PcGES1的分子式為C3006H4727N791O868S24，分子量為66.61 kD，等電點(diǎn)為5.88；帶負(fù)電殘基(Asp+Glu)為79，正電殘基(Arg+Lys)為73。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為54.35，脂肪系數(shù)為95.01，親水性系數(shù)為-0.257。在線SignalP4.0 Server 軟件分析結(jié)果表明PcGES1為非分泌蛋白。WOLFPSORT預(yù)測(cè)表明PcGES1定位在葉綠體中(chlo: 12.0, cyto: 1.0)。用HMMTOP預(yù)測(cè)PcGES1無跨膜區(qū)域。應(yīng)用protscale對(duì)PcGES1蛋白的氨基酸序列/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，PcGES1多肽鏈第437位的亮氨酸具有最高的分值2.700，疏水性最強(qiáng)；第505位的谷氨酸具有最低的分值-2.833，親水性最強(qiáng)。整個(gè)來看，其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，為親水蛋白。使用InterProScan進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域搜索，發(fā)現(xiàn)其主要有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，第63～260為一個(gè)結(jié)構(gòu)域，這個(gè)區(qū)域?yàn)檩祁惌h(huán)化酶/α-α環(huán)-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶蛋白域，也是萜類合酶， N末端區(qū)域；第249～574為另一個(gè)結(jié)構(gòu)域，主要為類異戊二烯合酶域與萜類合酶金屬結(jié)合域(圖3)。

圖2　PcGES1基因的全長cDNA及推衍的氨基酸序列Fig. 2　The full-length cDNA and deduced amino acid sequence of PcGES1

圖3　利用InterProScan分析PcGES1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig. 3　Analysis of PcGES1 conserved domains using InterProScan

2.3PcGES1編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)，目前，已公布的植物GES基因并不多。從NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)中選取與PcGES1基因編碼蛋白相似性較高的6條蛋白序列，采用MEGA6.06軟件,用其內(nèi)置NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果(圖4)表明，廣藿香PcGES1基因編碼的氨基酸序列與羅勒(Ocimumbasilicum，Q6USK1.1)GES編碼的氨基酸序列聚在一起，再與油橄欖(Oleaeuropaea，AFS59975.1,AFI47926.1)、長春花(Catharanthusroseus,AFD64744.1)GES編碼的氨基酸序列聚在一起。

S. 石牌廣藿香； G. 高要廣藿香； H. 海南廣藿香； Y. 印尼廣藿香 圖5　PcGES1基因在廣藿香4個(gè)栽培種中的時(shí)空表達(dá)量P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis； G. P. cablin (Blanco) Benth.cv. gaoyaoensis； H . P. cablin (Blanco) Benth. cv. hainangensis；Y.P. cablin (Blanco) BenthFig. 5　Spatiotemporal expression profile of PcGES1 in four P. cablin(Blanco) Benth cultivars

2.4PcGES1的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)PcGES1進(jìn)行基因分析。結(jié)果表明：PcGES1在廣藿香的不同栽培種、同一栽培種不同部位或不同時(shí)期均存在差異表達(dá)(圖5)。從不同栽培種來看，PcGES1在海南廣藿香中表達(dá)量最高，在印尼廣藿香中表達(dá)較高，在高要廣藿香的表達(dá)較低，在石牌廣藿香中的表達(dá)最低；從不同組織來看，PcGES1在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于莖，莖的表達(dá)量非常低，基本不表達(dá)；從不同發(fā)育時(shí)期來看，PcGES1在老葉中的表達(dá)量最高，比成熟葉與嫩葉高很多。

3討論

GES基因是萜類代謝中環(huán)烯醚萜苷類成分合成途徑的限速酶，前體物質(zhì)GDP在香葉醇合酶(GES基因)的作用下形成了香葉醇。香葉醇是大多數(shù)香料植物產(chǎn)生香味的主要化學(xué)成分。目前，GES基因表達(dá)研究涉及的植物很少，僅在細(xì)毛樟[6]中進(jìn)行了較詳細(xì)的研究，其結(jié)果表明，細(xì)毛樟具有3種不同化學(xué)型。通過對(duì)3種不同化學(xué)型細(xì)毛樟GES基因表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，不同化學(xué)型的基因表達(dá)也不同，導(dǎo)致香葉醇主成分CtGerS在香葉醇化學(xué)型葉片中有明顯表達(dá)，而在其余2個(gè)化學(xué)型只有較低表達(dá)量，此結(jié)果將化學(xué)型主成分的不同與形成主成分的基因直接聯(lián)系起來。本研究立足于實(shí)驗(yàn)室所建立的廣藿香高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從中克隆到的1條GES基因，其與羅勒的GES基因一致性最高。從實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果來看，PcGES1基因主要在葉中表達(dá)，且在高要廣藿香、海南廣藿香、印尼廣藿香老葉中表達(dá)量最高，而在莖中的表達(dá)較低。對(duì)廣藿香植株不同部位化學(xué)成分含量的分析結(jié)果表明，葉的揮發(fā)油含量最高[14-16]，因此，PcGES1表達(dá)可能與揮發(fā)油的合成有關(guān)。已有研究[17]表明，成熟廣藿香植株的葉中PTS基因表達(dá)量明顯高于莖和根,莖略高于根,但差異不顯著,即在成熟廣藿香植株中,廣藿香醇合成酶在葉中活性最高，葉是萜類成分基因表達(dá)的主要部位。本研究中，PcGES1在海南廣藿香、印尼廣藿香中表達(dá)量均比較高，而在高要廣藿香、石牌廣藿香中的表達(dá)量均較低，顯示了PcGES1的表達(dá)與廣藿香的物種屬性有關(guān)[18-19]。PcGES1在高要廣藿香、石牌廣藿香中表達(dá)量都不高，但有意思的是，PcGES1在石牌廣藿香中表達(dá)量最高的部位是較成熟的葉片，與其它3個(gè)栽培種存在明顯差異，PcGES1的這種表達(dá)差異可能是導(dǎo)致石牌廣藿香與其它3個(gè)栽培種揮發(fā)油成分差異的原因之一。本研究結(jié)果為萜類化合物生物合成的分子機(jī)制探究提供了新思路。

圖中分支上的數(shù)字表示bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度的百分比；標(biāo)尺代表遺傳距離；括號(hào)內(nèi)編號(hào)為氨基酸登錄號(hào)圖4　PcGES1與其它植物GES編碼氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replications; The scale bar represents genetic distance; The accession No. is given in bracketFig. 4　Phylogenetic tree of amino acid sequences of GES1 between P. cablin(Blanco) Benth. and other plants

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression Analysis of Geraniol Synthase Gene

inPogostemoncablin

OUYANG Puyue1, ZENG Shaohua2, MO Xiaolu1*

(1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China; 2 South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)

Abstract:Geraniol synthase (GES), which is very important to the biosynthesis of geraniol, is one of the key enzymes in terpenoids pathways. Based on the transcriptome analysis of P.cablin, one unique sequence encoding GES was discovered and the primers for PCR were designed from it, the full-length GES cDNA was cloned using RT-PCR strategy and its bioinformatics analysis has been done. Gene expression profile of PcGES1 in leaves and stems of different development stages of four cultivars was evaluated using quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). The results showed that the gene GES in P.cablin, named as PcGES1, accession number KF926075 in GenBank, contains a 1 734bp open reading frame and encodes a predicted protein of 577 amino acids. Phylogenetic analysis indicated that the amino acids encoded by GES1 of P. cablin were closest to that of Ocimum basilicum. PcGES protein was located in chloroplast, no transmembrane district. qRT-PCR analysis indicated that PcGES1 mainly expressed in leaves, and the highest expression was in old leaves. The expression pattern analysis of PcGES1 among four cultivars indicated that the expression pattern of P. cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis

was similar toP.cablin(Blanco) Benth. cv.gaoyaoensis, while that ofP.cablin(Blanco) Benth. cv.hainangensiswas similar toP.cablin(Blanco) Benth. This study provided a foundation for exploring the mechanism of terpenoid biosynthesis inP.cablinplants.

Key words:Pogostemon cablin; geraniol synthase; terpenoids synthesis

文章編號(hào):1000-4025(2016)05-0896-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0896

收稿日期:2016-01-24;修改稿收到日期:2016-05-06

基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A040404029)；廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2015YZ007)

作者簡介:歐陽蒲月(1978-)，女，碩士，副教授，研究方向：藥用植物分子生物學(xué)。E-mail：ouyangpy@gdyzy.edu.cn *通信作者:莫小路，教授，研究方向：藥用植物生物技術(shù)。E-mail：moxl@gdyzy.edu.cn

中圖分類號(hào):Q785；Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A