地黃GGPPS1基因克隆及表達(dá)分析

趙　樂(lè)，史晶晶，馬利剛，何慶祥，馮衛(wèi)生，鄭曉珂，朱畇昊*

(1 河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，鄭州 450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046)

地黃GGPPS1基因克隆及表達(dá)分析

趙樂(lè)1,2，史晶晶1,2，馬利剛1,2，何慶祥1，馮衛(wèi)生1,2，鄭曉珂1,2，朱畇昊1,2*

(1 河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，鄭州 450046；2 呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046)

摘要:以地黃為材料，通過(guò)分析地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物，克隆了地黃牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)基因的cDNA序列，命名為RgGGPPS1，GenBank登錄號(hào)為KU258808。同時(shí)在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行原核表達(dá)、純化以及組織特異性表達(dá)分析。結(jié)果顯示：(1)RgGGPPS1基因開(kāi)放閱讀框?yàn)?87 bp，編碼328個(gè)氨基酸。(2)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，RgGGPPS1蛋白含有2個(gè)富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD)，與芝麻等雙子葉植物中的GGPPS蛋白相似性較高。(3)利用構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-32a-RgGGPPS1在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)RgGGPPS1重組蛋白，采用Ni2+親和層析得到了純化的RgGGPPS1重組蛋白。(4)熒光定量PCR結(jié)果顯示，RgGGPPS1基因在根中表達(dá)量最高，葉、莖中表達(dá)量較低。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究RgGGPPS1基因在地黃環(huán)烯醚萜苷生物合成途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:地黃；RgGGPPS1基因；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)；表達(dá)分析

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch)是玄參科地黃屬多年生草本植物，以其塊根入藥，是中國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥材，廣泛分布于河南、山西、山東和陜西等地，其中以河南古懷慶府地區(qū)(即溫縣、博愛(ài)、泌陽(yáng)、孟縣)為地黃的道地產(chǎn)區(qū)，該地區(qū)所產(chǎn)地黃稱為“懷地黃”，是著名的“四大懷藥”之一[1]。地黃的塊根中含有環(huán)烯醚萜、苯乙醇、三萜、黃酮、木脂素及多糖等化合物，其中以環(huán)烯醚萜及其苷類為主[2]。地黃藥理活性顯著，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)等方面均有一定作用，關(guān)于地黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中在環(huán)烯醚萜類成分，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種生物學(xué)活性[3]。

地黃的研究多集中在化學(xué)成分、藥理學(xué)和栽培學(xué)等方面，且已有良好的研究基礎(chǔ)，但關(guān)于地黃次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑方面的研究較少，Sun等[4]利用轉(zhuǎn)錄組分析研究了可能參與地黃梓醇生物合成的基因。目前已見(jiàn)報(bào)道地黃基因克隆有病程相關(guān)蛋白R(shí)gPR-10基因[5]、Ca2+-ATPase基因[6]等，地黃次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中關(guān)鍵基因的克隆報(bào)道較少。牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS)催化法呢基焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)和異戊烯基焦磷酸(isopentenyl phrophosphate，IPP)反應(yīng)，生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)，GGPP為赤霉素、二萜、類胡蘿卜素和葉綠素等物質(zhì)的合成提供了前體物，是二萜類化合物的共同前體[7]。因此GGPPS是植物次生代謝的關(guān)鍵酶之一，目前，已從多種植物中克隆得到GGPPS基因并進(jìn)行了功能分析，如擬南芥[8]、番茄[9]、丹參[10]、煙草[11]、銀杏[12]、西瓜[13]、雷公藤[14]等，關(guān)于地黃GGPPS基因的克隆則未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)分析本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，有一條在KEGG代謝通路中注釋為GGPPS的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到地黃GGPPS基因的cDNA序列，命名為RgGGPPS1，在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)，進(jìn)行原核表達(dá)、純化和組織特異性表達(dá)分析，這將為今后研究RgGGPPS1基因在地黃環(huán)烯醚萜苷生物合成途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

地黃(R.glutinosa)栽培品種‘北京3號(hào)’和野生種均種植于河南中醫(yī)學(xué)院河南中藥植物園，在地黃成熟期(10月28日)，采集栽培品種和野生種的根、莖和葉片，樣品采集后經(jīng)液氮冷凍，保存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2方法

1.2.1RNA提取與反轉(zhuǎn)錄使用植物RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)公司)提取地黃根、莖和葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，用NanoDrop 2 000測(cè)定總RNA濃度和純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金公司)說(shuō)明書(shū)，以得到的地黃各組織的總RNA為模板，oligo(dT)20為引物，反轉(zhuǎn)錄合成得到地黃各組織的cDNA。

1.2.2RgGGPPS1基因克隆根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中GGPPS基因的序列信息，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)地黃GGPPS基因的特異性引物，正向引物RgGGPPS1-F(5’-TGCGAAATCAAGAACATAACC-3’)和反向引物RgGGPPS1-R(5’-TGCTCCGCCATAGCGAATAG-3’)，以地黃‘北京3號(hào)’根cDNA為模板，擴(kuò)增RgGGPPS1基因的cDNA序列，PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，回收與預(yù)期大小一致的條帶，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金公司)，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3RgGGPPS1基因的生物信息學(xué)分析將測(cè)序得到的序列提交到NCBI ORF Finder 查找開(kāi)放閱讀框，并通過(guò)Blastp與nr 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析。RgGGPPS1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam；使用InterPro Scan預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；采用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)的三維同源建模；使用SignalP 4.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；利用Target P 1.1 Server預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位；跨膜區(qū)預(yù)測(cè)通過(guò)TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)；使用MEGA5軟件相鄰連接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.4RgGGPPS1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)RgGGPPS1基因的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)1對(duì)RgGGPPS1基因的原核表達(dá)引物，正向引物RgGGPPS1-Exp-F(5’-CGGAATTCATGATTTTCTCAACAG-3’，下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))和反向引物RgGGPPS1-Exp-R(5’-CCGCTCGAGTCAAACTGGTGCGGCA-3’，下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))，以測(cè)序正確的pMD19-T-RgGGPPS1質(zhì)粒為模板，用Primer STAR HSTaq(Takara公司)擴(kuò)增RgGGPPS1基因的ORF序列，PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根公司)回收純化目的基因條帶，然后用EcoR I和XhoI對(duì)純化的PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pET-32a分別進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，T4DNA Ligase 16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金公司)，挑單克隆提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送北京三博公司測(cè)序。

將測(cè)序正確的單克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素)過(guò)夜培養(yǎng)，第二天按照1:100比例接種到LB液體培養(yǎng)基中(含氨芐青霉素)，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600至0.6)，然后在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 h，誘導(dǎo)地黃RgGGPPS1重組蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)完成后，用SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

1.2.5RgGGPPS1重組蛋白的純化根據(jù)RgGGPPS1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，擴(kuò)大培養(yǎng)體積，誘導(dǎo)完成后，在10 000 g、4 ℃離心收集菌體，用PBS (pH7.3)重懸菌體后，超聲破碎大腸桿菌細(xì)胞。大腸桿菌裂解液在12 000 g、4 ℃離心20 min，收集上清，經(jīng)0.45 μm濾器過(guò)濾后，按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(康為世紀(jì)公司)說(shuō)明書(shū)純化RgGGPPS1重組蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)不同咪唑濃度洗脫的目的蛋白，確定最佳洗脫濃度，洗脫的目的蛋白經(jīng)透析和超濾后，用Bradford法測(cè)定蛋白含量。

1.2.6RgGGPPS1基因表達(dá)模式分析地黃各組織的cDNA稀釋50倍作為熒光定量PCR反應(yīng)模板，以RgTIP41基因[15]為內(nèi)參，GenBank登錄號(hào)為KT306007(正向引物5’-ATTGGGTAGATTGCCAGGAG-3’；反向引物5’-CCATTGTCAGCCAATTCATC-3’)，檢測(cè)RgGGPPS1基因在地黃栽培品種‘北京3號(hào)’和野生種各組織的表達(dá)量，RgGGPPS1基因RT-PCR正向引物(5’-CCCATCTAGAAGAGGCAAGC-3’)，反向引物(5’-GAACAATGCGTCTCCTGCTA-3’)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，RT-PCR反應(yīng)體系為：10 μL 2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN)、正反向引物各0.4 μL、cDNA 模板2 μL、加ddH2O 至20 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，根據(jù)溶解曲線判斷RT-PCR產(chǎn)物的特異性，相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCt方法[16]，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析，以地黃野生種根的Ct值的平均數(shù)設(shè)為l，進(jìn)行RgGGPPS1基因表達(dá)模式分析。

2結(jié)果與分析

2.1RgGGPPS1基因的克隆

通過(guò)分析本實(shí)驗(yàn)室獲得的地黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，有1條注釋為GGPPS的轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為1 323 bp，將序列信息提交到NCBI ORF Finder發(fā)現(xiàn)其包含1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，根據(jù)該基因的序列信息，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以地黃‘北京3號(hào)’根的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物約為1 100 bp，電泳結(jié)果如圖1所示，測(cè)序后得到地黃RgGGPPS1基因完整的ORF序列，大小為987 bp，編碼328個(gè)氨基酸，RgGGPPS1基因的序列信息已經(jīng)提交到NCBI GenBank，登錄號(hào)為KU258808。

2.2RgGGPPS1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

由ExPASy Server提供的ProtParam tool預(yù)測(cè)地黃RgGGPPS1蛋白的分子量35.90 kD，等電點(diǎn)是5.77，RgGGPPS1基因cDNA的核苷酸序列及對(duì)應(yīng)氨基酸序列如圖2所示。

M. DL2 000；1. RgGGPPS1圖1　PCR擴(kuò)增RgGGPPS1基因Fig. 1　PCR amplification of RgGGPPS1 gene

用InterProScan預(yù)測(cè)RgGGPPS1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：多聚異戊烯基合成相關(guān)酶(IPR017446)、多聚異戊烯基合成酶(IPR000092)、異戊二烯合成酶結(jié)構(gòu)域(isoprenoid synthase domain)(IPR008949)，說(shuō)明RgGGPPS1蛋白屬于多聚異戊烯基合成酶家族的成員。

根據(jù)SignalP預(yù)測(cè)RgGGPPS1蛋白不含信號(hào)肽，TargetP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白可能位于葉綠體中，用TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜區(qū)，結(jié)果顯示RgGGPPS1蛋白不含跨膜區(qū)。

用SWISS-MODEL在線服務(wù)器預(yù)測(cè)RgGGPPS1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，以擬南芥位于葉綠體的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶11(PDB ID：5e8l)的晶體結(jié)構(gòu)為模板，在第38～320位氨基酸殘基建模，序列的一致性為45.71%，三維模型覆蓋率為85%，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果RgGGPPS1蛋白可能以同源二聚體的形式發(fā)揮作用。

2.3多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

Blast比對(duì)結(jié)果顯示，RgGGPPS1蛋白與芝麻(Sesamumindicum，SiGGPPS，XP_011092951.1)、丹參(Salviamiltiorrhiza，SmGGPPS，AEZ55680.1)、番茄(Solanumpennellii，SpGGPPS，XP_015087865.1)、煙草(Nicotianatabacum，NtGGPPS，AIC77784.1)、三七(Panaxnotoginseng，PnGGPPS，AIZ00598.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana，AtGGPPS，AAA81879.1)等植物的GGPPS蛋白序列一致性較高，分別為92%、87%、77%、79%、76%和65%。用DNAMAN軟件對(duì)這7種植物GGPPS蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果(圖3)顯示，GGPPS蛋白N端變異較大，多肽鏈中部和C端保守性較強(qiáng)，有2個(gè)富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD)，在地黃RgGGPPS1蛋白的氨基酸序列中也有這2個(gè)保守基序，分別是DDLPCMDD和DDILE(圖3)。

植物、動(dòng)物和微生物中都普遍存在GGPPS蛋白，從NCBI blastp的比對(duì)結(jié)果中，選取不同物種來(lái)源的共26條GGPPS蛋白序列作為參考，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從結(jié)果(圖4)中可以看出，不同物種來(lái)源的GGPPS蛋白在進(jìn)化上歸屬不同的分支，分別聚為動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、植物四大類，RgGGPPS1蛋白屬于植物分支中的雙子葉植物，與芝麻親緣關(guān)系較近。

終止密碼子用*標(biāo)記，左側(cè)數(shù)字表示核苷酸位置，右側(cè)數(shù)字表示氨基酸位置，小寫斜體為RgGGPPS1基因的克隆引物序列圖2　RgGGPPS1基因的cDNA序列及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列The marker “*” represents termination codon, the left number indicates nucleotide position, the right number indicates amino acid position, the italic lowercase letters represent cloning primer sequences of RgGGPPS1 geneFig. 2　Nucleotide sequence and amino acid sequence of RgGGPPS1 gene cDNA

2個(gè)富含天冬氨酸的保守基序用黑色框標(biāo)出;Si.芝麻；Sm.丹參；Sp.番茄；Nt.煙草；Pn.三七；At.擬南薺圖3　地黃RgGGPPS1蛋白與其他植物中GGPPS蛋白的多序列比對(duì)分析The two Asp-rich conserved motifs are boxed in black; Si. Sesamum indicum; Sm. Salvia miltiorrhiza; Sp. Solanum pennellii; Nt. Nicotiana tabacum; Pn. Panax notoginseng; At. Arabidopsis thalianaFig. 3　Multiple sequence alignment of RgGGPPS1 and GGPPS proteins from other plant species

物種名稱后括號(hào)內(nèi)為蛋白登錄號(hào)，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值為通過(guò)bootstrap檢驗(yàn)次數(shù)的百分?jǐn)?shù)圖4　RgGGPPS1蛋白與其他物種GGPPS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)The protein accession numbers are showed after the name of species, bootstrap values of the nodes represent the percentage drawn from the bootstrap testFig. 4　Phylogenetic tree analysis of RgGGPPS1 protein and GGPPS proteins from other species

2.4RgGGPPS1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用含有酶切位點(diǎn)EcoR I和XhoI的原核表達(dá)引物，將RgGGPPS1基因插入原核表達(dá)載體pET-32a，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切后，有6 000 bp左右的載體片段和1 000 bp左右的插入片段(圖5)。將酶切正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-32a-RgGGPPS1中插入基因序列與目的基因RgGGPPS1序列完全一致，說(shuō)明RgGGPPS1基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M. DL 2 000；1、2. EcoR I和Xho I雙酶切圖5　原核表達(dá)載體pET32a-RgGGPPS1的雙酶切鑒定M. DL 2 000; 1, 2. Double digestion results by EcoR I and Xho IFig. 5　Identification of prokaryotic expression vector pET32a-RgGGPPS1 with double digestion

2.5RgGGPPS1重組蛋白的原核表達(dá)與純化

將含有pET-32a和pET-32a-RgGGPPS1質(zhì)粒的表達(dá)菌株，振蕩培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌生長(zhǎng)至OD600達(dá)到0.6 時(shí)，在0.4 mmol/L IPTG、28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)8 h后，對(duì)誘導(dǎo)前后的大腸桿菌總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。含有pET-32a-RgGGPPS1質(zhì)粒的表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌總蛋白中出現(xiàn)1條55 kD的條帶(圖6)，因?yàn)镽gGGPPS1重組蛋白在N-末端融合了pET-32a載體的標(biāo)簽序列(Trx-Tag，His-Tag和S-Tag)，總分子量為55.90 kD。含pET-32a空載體的菌株，在同樣條件下培養(yǎng)8 h后，未在55 kD處出現(xiàn)條帶，而在20 kD處出現(xiàn)條帶，因?yàn)閜ET-32a空載體的標(biāo)簽序列(Trx-Tag，His-Tag和S-Tag)在IPTG誘導(dǎo)時(shí)也會(huì)表達(dá)融合蛋白，大小約為20 kD。結(jié)果(圖6)表明，RgGGPPS1蛋白成功在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。

根據(jù)RgGGPPS1重組蛋白的誘導(dǎo)條件，擴(kuò)大培養(yǎng)體積，用超聲裂解菌體，裂解液經(jīng)離心取上清，利用Ni2+親和層析純化目的蛋白，最終得到純化的RgGGPPS1重組蛋白(圖6)。純化的RgGGPPS1重組蛋白可用于下一步多克隆抗體制備，以及體外酶促催化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)在檢測(cè)體系中添加底物FPP、IPP和純化的RgGGPPS1蛋白，用GC-MS檢測(cè)產(chǎn)物，進(jìn)一步鑒定地黃GGPPS1蛋白功能。

M. 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未誘導(dǎo)的含pET-32a空載體的E. coli菌株；2. IPTG誘導(dǎo)的含pET-32a空載體的E. coli菌株；3. 未誘導(dǎo)的含pET-32a-RgGGPPS1質(zhì)粒的E. coli菌株；4. IPTG誘導(dǎo)的含pET-32a-RgGGPPS1質(zhì)粒的E. coli菌株；5. 純化的RgGGPPS1重組蛋白。箭頭顯示為RgGGPPS1重組蛋白圖6　RgGGPPS1重組蛋白的原核表達(dá)與純化M. Protein marker; 1. Non-induced E. coli containing pET-32a used as control; 2. E. coli containing pET-32a under IPTG inducement; 3. Non-induced E. coli containing pET-32a-RgGGPPS1; 4. E. coli containing pET-32a-RgGGPPS1 under IPTG inducement; 5. The purified recombinant RgGGPPS1 protein. The arrows show the recombinant RgGGPPS1 proteinsFig. 6　Prokaryotic expression and purification of recombinant RgGGPPS1 protein

2.6RgGGPPS1基因表達(dá)模式分析

RT-PCR結(jié)果顯示，RgGGPPS1基因在地黃栽培品種‘北京3號(hào)’和野生種中，都是根中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量較低，莖中表達(dá)量最低，說(shuō)明RgGGPPS1基因的表達(dá)具有組織特異性。在栽培品種‘北京3號(hào)’的根中RgGGPPS1的表達(dá)量高于野生種，而在葉片中RgGGPPS1的表達(dá)量則是‘北京3號(hào)’低于野生種(圖7)。這樣的表達(dá)模式可能和地黃以根作為入藥部位有關(guān)，環(huán)烯醚萜苷類成分在膨大的塊根中含量較多而在葉片中含量較少[17]。

同一組織的不同小寫字母表示野生種和栽培品種在0.05水平存在顯著性差異圖7　地黃RgGGPPS1基因在各組織器官的表達(dá)量分析Different lowercase letters at the same tissue indicate significant difference among wild specie and cultivar at 0.05 levelFig. 7　Expression patterns of RgGGPPS1 in different organ tissues of R. glutinosa

3討論

在地黃‘北京3號(hào)’膨大的塊根中克隆了RgGGPPS1基因的cDNA序列，通過(guò)氨基酸多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，RgGGPPS1蛋白含有2個(gè)富含天冬氨酸的保守基序，據(jù)報(bào)道這2個(gè)保守基序是和底物以及產(chǎn)物GGPP結(jié)合的部位[18]。在不同的植物中，GGPPS蛋白定位于不同的細(xì)胞器中，如在葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等[7]，根據(jù)SignalP預(yù)測(cè)結(jié)果RgGGPPS1蛋白可能定位于葉綠體中，說(shuō)明RgGGPPS1蛋白可能在葉綠體中發(fā)揮功能，在植物中GGPP由位于質(zhì)體的甲基赤蘚醇磷酸途徑(methylerythritol phosphate pathway，MEP pathway)合成，是二萜類化合物合成的重要前體物，所以GGPPS是植物次生代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。地黃主要藥效物質(zhì)是環(huán)烯醚萜苷類化合物，目前關(guān)于環(huán)烯醚萜苷類化合物的化學(xué)和藥理學(xué)研究已有良好基礎(chǔ)，但環(huán)烯醚萜苷類化合物的生物合成途徑及其關(guān)鍵基因方面研究較少，本研究克隆得到的RgGGPPS1基因是環(huán)烯醚萜苷類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵基因之一，RT-PCR結(jié)果顯示在地黃中RgGGPPS1基因的表達(dá)具有組織特異性，在根中表達(dá)量最高，葉片次之，莖中最低，而且在栽培品種‘北京3號(hào)’的根中RgGGPPS1的表達(dá)量高于野生種。栽培地黃和野生地黃塊根發(fā)育不同，在地黃成熟期，栽培地黃塊根發(fā)育為膨大塊根而野生地黃塊根膨大程度較小，地黃塊根能否正常發(fā)育膨大直接決定地黃的產(chǎn)量和藥用品質(zhì)[19]，栽培地黃‘北京3號(hào)’塊根發(fā)育正常為膨大的塊根，產(chǎn)量和藥用品質(zhì)較高，積累較多的藥效物質(zhì)環(huán)烯醚萜苷類成分，所以RgGGPPS1的表達(dá)量在栽培地黃‘北京3號(hào)’根中高于野生地黃。

環(huán)烯醚萜苷類化合物作地黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種藥理活性，但是在地黃中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量較低，而臨床需求量較大，所以如何通過(guò)生物技術(shù)提高地黃中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量具有重要的研究意義。隨著植物次生代謝途徑(如：紫杉醇和丹參酮等生物合成途徑)及其關(guān)鍵基因研究的深入，越來(lái)越多的關(guān)鍵基因被克隆，功能被鑒定，通過(guò)基因工程對(duì)藥用植物進(jìn)行遺傳改良提高藥用植物體內(nèi)藥效物質(zhì)含量，或者通過(guò)合成生物學(xué)方式直接生產(chǎn)有效成分，已經(jīng)成為最具發(fā)展?jié)摿Φ姆较?。本研究從地黃的塊根中獲得了RgGGPPS1基因的cDNA序列，通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-RgGGPPS1，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功誘導(dǎo)表達(dá)出RgGGPPS1重組蛋白，而且在表達(dá)的重組蛋白的N端帶有6個(gè)His-Tag標(biāo)簽，方便純化重組蛋白，所以采用Ni2+親和層析方法得到了純化的RgGGPPS1重組蛋白，為下一步RgGGPPS1蛋白多克隆抗體的制備、體外酶促催化實(shí)驗(yàn)以及研究RgGGPPS1基因在地黃環(huán)烯醚萜苷類化合物生物合成途徑中的功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn):

[1]溫學(xué)森, 楊世林, 魏建和, 等. 地黃栽培歷史及其品種考證[J]. 中草藥, 2002, 33(10): 946-949.

WEN X S, YANG S L, WEI J H,etal. Textual research on plant ing history ofRehmanniaglutinosaand its cultivated varieties[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs, 2002, 33(10): 946-949.

[2]李紅偉, 孟祥樂(lè). 地黃化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2015, 38(2): 218-228.

LI H W, MENG X L. Research progress on chemical constituents and pharmacological activities ofRehmanniaglutinosa[J].DrugEvaluationResearch, 2015, 38(2): 218-228.

[3]李慧芬. 地黃藥理作用和臨床應(yīng)用概況[J]. 藥學(xué)研究, 2014, 33(6): 345-347.

LI H F. Summary on pharmacological action and clinical usage ofRehmanniaeradix[J].JournalofPharmaceuticalResearch, 2014, 33(6): 345-347.

[4]SUN P, SONG S H, ZHOU L L,etal. Transcriptome analysis reveals putative genes involved in iridoid biosynthesis inRehmanniaglutinosa[J].InternationalJournalofMolecularSciences, 2012, 13(10): 13 748-13 763.

[5]郭玉海, 祁建軍, 周麗莉, 等. 地黃RgPR-10基因的克隆與表達(dá)[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(1): 300-304.

GUO Y H, QI J J, ZHOU L L,etal. Clonning and expression ofRgPR-10 gene fromRehmanniaglutinosa[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica, 2009, 18(1): 300-304.

[6]劉馳, 李明杰, 王鵬飛, 等. 地黃內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型(ER)Ca2+-ATPase基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(5): 445-451.

LIU C, LI M J, WANG P F,etal. Cloning and expression analysis of endoplasmic reticulum type (ER)Ca2+-ATPaseinRehmanniaglutinosaLibosch.[J].PlantPhysiologyJournal, 2013, 49(5): 445-451.

[7]BECK G, COMAN D, HERREN E,etal. Characterization of the GGPP synthase gene family inArabidopsisthaliana[J].PlantMolecularBiology, 2013, 82(4/5): 393-416.

[8]OKADA K, SAITO T, NAKAGAWA T,etal. Five geranylgeranyl diphosphate synthases expressed in different organs are localized into three subcellular compartments inArabidopsis[J].PlantPhysiology, 2000, 122(4): 1 045-1 056.

[9]鐘秋月, 國(guó)艷梅, 梁燕, 等. 兩個(gè)不同來(lái)源的番茄GGPS基因克隆和序列分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 15-22.

ZHONG Q Y, GUO Y M, LIANG Y,etal. Cloning and sequence analysis ofGGPSgene in two sources of tomato[J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica, 2009, 24(3): 15-22.

[10]張蕾, 戴住波, 崔光紅, 等. 丹參牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因的克隆與分析[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(21): 2 704-2 708.

ZHANG L, DAI Z B, CUI G H,etal. Cloning and characterization of geranylgeranyl diphosphate synthase gene ofSalviamiltiorrhiza[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2009, 34(21): 2 704-2 708.

[11]李鋒, 李明, 金立鋒, 等. 煙草牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析[J]. 煙草科技, 2012,(5):60-64.

LI F, LI M, JIN L F,etal. Cloning and characterization of a new gene encoding geranylgeranyl pyrophosphate synthase fromNicotianatabacum[J].TobaccoScience&Technology, 2012,(5):60-64.

[12]張洪娟, 譚碧玥, 曹福亮. 銀杏GbGGPS基因的克隆及序列分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2013, 37(4): 8-12.

ZHANG H J, TAN B Y, CAO F L. Cloning and characterization of the geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene fromGinkgobilobaLinn.[J].JournalofNanjingForestryUniversity(Natural Sciences Edition), 2013, 37(4): 8-12.

[13]呂品, 李娜, 谷輝輝, 等. 西瓜牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 生物技術(shù), 2014, (2): 11-15.

Lü P, LI N, GU H H,etal. Cloning and expression analysis of geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene in watermelon (Citrulluslanatus) [J].Biotechnology, 2014,(2): 11-15.

[14]張萌, 蘇平, 劉雨佳, 等. 雷公藤牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(6): 1 066-1 070.

ZHANG M, SU P, LIU Y J,etal. Cloning and bioinformatics analysis of geranylgeranyl diphosphate synthase gene ofTripterygiumwilfordii[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2015, 40(6): 1 066-1 070.

[15]侯維海, 孫鵬, 陳全家,等. 地黃實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2011, 27(17):76-82.

HOU W H, SUN P, CHEN Q J,etal. Selection of the reference genes for gene expression studies inRehmanniaglutinosaby real-time quantitative PCR[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2011, 27(17):76-82.

[16]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[17]ZHANG Y L, FENG W S, ZHENG X K,etal. Three new ursane-type triterpenes from the leaves ofRehmanniaglutinosa[J].Fitoterapia, 2013, 89(1): 15-19.

[18]JOLY A, EDWARDS P A. Effect of site-directed mutagenesis of conserved aspartate and arginine residues upon farnesyl diphosphate synthase activity[J].JournalofBiologicalChemistry, 1993, 268(36): 26 983-26 989.

[19]王鵬飛, 李鑫宇, 李明杰, 等. 地黃塊根膨大發(fā)生和驅(qū)動(dòng)的組織觀察及激素相關(guān)基因的調(diào)控分析[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(17): 3 245-3 253.

WANG P F, LI X Y, LI M J,etal. Observation of prime position and driving zones in process of tuberous root expanding and expression analysis of phytohormone relative genes inRehmanniaglutinosa[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica, 2014, 39(17): 3 245-3 253.

(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression Analysis ofGGPPS1 Gene fromRehmanniaglutinosa

ZHAO Le1,2, SHI Jingjing1,2, MA Ligang1,2, HE Qingxiang1, FENG Weisheng1,2,ZHENG Xiaoke1,2, ZHU Yunhao1,2*

(1 School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China; 2 Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China)

Abstract:Rehmannia glutinosa was used as experimental material in this study. Through analyzing the transcriptome data of R. glutinosa and designing specific primers, we isolated the cDNA sequence of geranylgeranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) from R. glutinosa and named as RgGGPPS1 (GenBank accession No. KU258808). Meanwhile, on the basis of bioinformatic analysis, we performed the prokaryotic expression, purification and tissue-specific expression analysis. The results indicated that: (1) RgGGPPS1 has an open reading frame (ORF) of 987 bp, which encoded a protein of 328 amino acid residues. (2) Bioinformatic analysis indicated that RgGGPPS1 protein contains the two conserved motifs (DDXXXXDD) and (DDXXD); RgGGPPS1 protein showed the highest homology, 92% identity, with GGPPS protein from Sesamum indicum. (3) By utilizing the construction of prokaryotic expression vector pET-32a-RgGGPPS1, we successfully expressed the recombinant RgGGPPS1 protein in E. coli BL21 (DE3) cells. Furthermore, the recombinant RgGGPPS1 protein was purified through Ni2+affinity chromatography. (4) Real-time PCR analysis indicated that RgGGPPS1 was expressed in high transcript level in roots, low levels in leaves and stems. The results of this study provided the fundamental information about RgGGPPS1 gene for follow-up research of its function involved in iridoid glycoside biosynthesis pathway.

Key words:Rehmannia glutinosa; RgGGPPS1 gene; bioinformatic analysis; prokaryotic expression; expression analysis

文章編號(hào):1000-4025(2016)05-0888-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0888

收稿日期:2016-01-27;修改稿收到日期:2016-04-18

基金項(xiàng)目:國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2011BAI06B02)；河南中醫(yī)學(xué)院博士科研基金(BSJJ2011-07，BSJJ2011-18)；第六屆河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)項(xiàng)目(YXCX [2015] 3)

作者簡(jiǎn)介:趙樂(lè)(1983-)，男，博士，講師，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E-mail: zhaole1983@126.com *通信作者:朱畇昊，博士，講師，主要從事藥用植物資源研究。E-mail: guxinhan123@163.com

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A