蝴蝶蘭F3′5′H基因轉(zhuǎn)化OT雜種百合Robina的研究

劉愛玲,劉雅莉,婁　倩,張海芹

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵,712100)

蝴蝶蘭F3′5′H基因轉(zhuǎn)化OT雜種百合Robina的研究

劉愛玲,劉雅莉*,婁倩,張海芹

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊陵,712100)

摘要:為了定向育種獲得藍(lán)色百合，該研究以百合Robina為藍(lán)色基因最佳受體，以其花絲誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織和再生小植株小鱗片作為轉(zhuǎn)化材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將蝴蝶蘭F3′5′H基因?qū)氚俸蟁obina中。結(jié)果表明：以小鱗片為轉(zhuǎn)化材料，預(yù)培養(yǎng) 3 d，OD600為0.8，侵染10 min，共培養(yǎng)3 d，加入100 μmol/L AS穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率最高為12.78%；而以胚性愈傷為轉(zhuǎn)化材料，預(yù)培養(yǎng)2 d，OD600為0.8，侵染10 min，共培養(yǎng)3 d，加入100 μmol/L AS穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率最高為12.22%。2種轉(zhuǎn)化材料的最適潮霉素篩選濃度均為20 mg/L。對(duì)抗性植株分別進(jìn)行PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè),獲得9個(gè)陽(yáng)性株系，Southern印記分析進(jìn)一步確定了6株轉(zhuǎn)基因百合中攜帶藍(lán)色基因F3′5′H，為后續(xù)進(jìn)一步獲得藍(lán)色百合奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:F3′5′H；Robina百合；胚性愈傷組織；小鱗片；遺傳轉(zhuǎn)化

OT雜種百合 Robina (Liliumtenuifoliumoriental×trumpet)是東方百合雜交系(oriental hybrids)與喇叭型百合雜交系(trumpet hybrids)的雜交種[1]。其莖稈粗壯，花大艷麗，香氣濃郁，是百合中比較名貴的切花品種[2]。 百合Robina的花苞多為3～5個(gè)，花朵顏色為深粉紅色，高度120～135 cm，生長(zhǎng)周期100 d左右，喜歡排水性好的微酸性土壤，適宜溫度15～28 ℃，需要經(jīng)過低溫春化過程后才能開花，無葉燒現(xiàn)象[3]。如果生長(zhǎng)環(huán)境適宜， Robina百合的花朵直徑可達(dá)18～20 cm，為百合中花比較大的品種之一。近年來，隨著其在百合切花中所占的比重越來越大, 研究其花色具有重要的意義。

對(duì)于花卉的研究，花色改良一直是研究的熱點(diǎn)，以前的研究中一般采用的是傳統(tǒng)的育種方法，雖然也研究出許多新的花色，但是由于物種間存在種間隔離，傳統(tǒng)育種技術(shù)很難打破種內(nèi)基因資源的局限性[4]，所以大大制約了花色的創(chuàng)新。通過基因工程技術(shù)，可以克服傳統(tǒng)育種方法的局限性，創(chuàng)造出更多的新花色[5]。

飛燕草素(delphinidin)是存在于植物中的一種花青素，它可以使植物呈現(xiàn)藍(lán)紫色。而F3′5′H(類黃酮3′5′羥基化酶)是形成飛燕草素并決定花青素結(jié)構(gòu)和花色的關(guān)鍵酶[6]。百合中由于缺乏F3′5′H基因而缺乏飛燕草素，所以自然界中沒有紫色或藍(lán)色的百合花[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)10個(gè)百合品種的比較分析，利用灰色關(guān)聯(lián)分析理論確定適宜轉(zhuǎn)藍(lán)色基因的受體品種，確定花瓣中矢車菊色素含量少、黃酮醇含量高、液泡pH值高的OT雜種百合Robina為適宜轉(zhuǎn)藍(lán)色基因的受體品種[8]。前期實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了攜帶F3′5′H基因表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化[7]，本研究主要是改良受體材料和實(shí)驗(yàn)方法，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法穩(wěn)定轉(zhuǎn)化Robina百合，并通過PCR等方法來檢測(cè)，獲得大量的百合轉(zhuǎn)基因植株用于后續(xù)研究，為藍(lán)色百合的獲得奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

試驗(yàn)于2014年7月～2015年9月，在農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室和旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。以購(gòu)于云南花卉市場(chǎng)的Robina百合為試驗(yàn)材料，誘導(dǎo)花苞的花絲產(chǎn)生胚性愈傷，再生植株，花絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L PIC(毒莠定)+30 g/L蔗糖+3.0 g/L植物凝膠。

試驗(yàn)中使用的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株是 LBA4404，導(dǎo)入的質(zhì)粒是p1300-pPZP-F3′5′H-DFR， 質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段上攜帶CHS花特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蝴蝶蘭F3′5′H基因， E35S Pro(增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)的風(fēng)信子的DFR基因(蝴蝶蘭F3′5′H基因表達(dá)的輔助基因)，以及潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPTⅡ(選擇標(biāo)記基因)，該載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建(圖1)。

1.2方法

1.2.1胚性愈傷的懸浮培養(yǎng)取1.0 mg·L-1毒莠定誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織2.0 g(鮮重)切碎, 接種至 100 mL錐形瓶中，在瓶?jī)?nèi)加入40 mL 含與該胚性愈傷繼代相同激素和蔗糖的液體培養(yǎng)基, 進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。然后將錐形瓶置于 (24±2)℃，100 r/min恒溫?fù)u床中，暗培養(yǎng)。前2次每3 d繼代1次，其后每 7 d繼代1次直到停止增長(zhǎng)。繼代時(shí)，要注意一定要靜置至懸浮液中細(xì)胞團(tuán)沉至錐形瓶底部后，倒去上部 1/2 舊的上清液，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)液。每 6 d稱量各瓶懸浮培養(yǎng)物的鮮重，測(cè)定每個(gè)懸浮系的增殖量，直至停止增長(zhǎng)，獲得懸浮培養(yǎng)物。

1.2.2農(nóng)桿菌菌液的制備吸取甘油凍存的含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株100 μL 添加到含 50 mg·L-1kan和 25 mg·L-1Rif 的 25 mL 液體 YEB 培養(yǎng)基中, 28 ℃、180 r/min 搖菌 30 h左右。

CHS pro.花特異啟動(dòng)子；PhalaenopsisF3′5′H .蝴蝶蘭類黃酮3’5’羥基化酶基因；NOS ter. NOS終止子；E35S pro. 增強(qiáng)型CaMV 35S啟動(dòng)子; Hyacinth DFR .風(fēng)信子二氫黃酮醇4-還原酶基因；HPTⅡ.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因圖1　質(zhì)粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR的T-DNA示意圖CHS pro. Flower specific promoter; Phalaenopsis F3′5′H. Phalaenopsis flavonoid 3′5′ hydroxylase gene; NOS ter. NOS terminator; E35S pro. Enhanced CaMV 35S promoter; Hyacinth DFR.Hyacinth dihydroflavonol 4-reductase gene;HPTⅡ. Hygromycin phosphotransferase geneFig. 1　T-DNA schematic diagram of plasmid p1300-pPZP-F3′5′H-DFR

將搖好的菌液置于 50 mL離心管中,封口后再將離心管置于 4 ℃、5 000 r/min離心機(jī)中,離心 15 min，棄上清液，往下層沉淀中加入30 mL 重懸液(MS+10 mmol·L-1MES+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖)，重懸混勻后吸取 2 mL 用于菌液 OD600值測(cè)定，通過計(jì)算,向菌液中添加適量重懸液以調(diào)整其 OD600為 0.8。 最后在28 ℃、180 r/min 搖床中搖菌2～3 h, 搖完后以其作為浸染液。

1.2.3轉(zhuǎn)化受體的預(yù)培養(yǎng)將懸浮培養(yǎng)后的胚性愈傷置于預(yù)培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-1PIC +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠上;將大小一致的再生植株的小鱗片置于預(yù)培養(yǎng)基MS+1.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠上, 在(25±2) ℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng), 預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為0、1、2、3和 4 d。

1.2.4浸染及共培養(yǎng)用預(yù)先制備好的浸染液對(duì)經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的2種轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行浸染,侵染時(shí)間為 10 min，浸染后將轉(zhuǎn)化受體置于共培養(yǎng)基上共培養(yǎng), 共培養(yǎng)時(shí)間0、1、2、3、4和5 d。胚性愈傷的共培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1PIC +10 mmol·L-1MES+(0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝膠; 再生小鱗片的共培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L NAA +10 mmol·L-1MES+( 0、50、100、150、200)μmol·L-1AS+ 30 g·L-1蔗糖+ 3 g·L-1植物凝膠。

1.2.5脫菌處理及篩選培養(yǎng)將共培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化受體置于含 500 mg·L-1cef 的無菌水中脫菌處理 10 min，無菌水沖洗2～3 次后置于吸水紙上瀝干，接于篩選培養(yǎng)基上。胚性愈傷篩選培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg·L-1PIC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt；再生小鱗片的篩選培養(yǎng)基為MS+1.5 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠+200 mg·L-1carb+(0、5、10、15、20、25) mg·L-1hpt，每隔2周在各自培養(yǎng)基上繼代1次。

表1　用于本研究的引物

1.2.6植株再生篩選培養(yǎng)在25 ℃、16 h光照條件下進(jìn)行，40 d后，轉(zhuǎn)化受體即可在各自的篩選培養(yǎng)基分化出小苗。在篩選培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的小苗, 轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基(1/2MS +0.5 mg·L-1IBA+0.1% AC+30 g·L-1蔗糖+3 g·L-1植物凝膠)。生根后的小苗繼續(xù)培養(yǎng), 使其生長(zhǎng)更加強(qiáng)壯。

以上各個(gè)處理均取轉(zhuǎn)化受體40～60個(gè), 每個(gè)處理重復(fù)3次。每個(gè)處理在篩選培養(yǎng)3個(gè)月后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)得到的潮霉素抗性苗數(shù)，計(jì)算穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率(穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率=潮霉素抗性苗數(shù)/轉(zhuǎn)化受體數(shù))。

1.2.7轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)剪取抗性植株的細(xì)嫩葉片，采用 CTAB 法提取基因組 DNA。以提取的百合葉片的 DNA 為模板，根據(jù)載體中插入的F3′5′H、DFR和HPTⅡ 基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測(cè)。其中F3′5′H擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 550 bp，DFR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 110 bp，HPTⅡ擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為554 bp。設(shè)計(jì)引物(見表1)。將質(zhì)粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR作為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因植株的DNA作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系選取25 μL體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 3 min； 94 ℃變性30 s， 55 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃再延伸2 min。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，得到PCR結(jié)果。

1.2.8轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測(cè)使用Omega試劑盒提取百合PCR陽(yáng)性植株和未轉(zhuǎn)化植株總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA的純度及濃度檢測(cè)。使用Preme Script RT reagent kit試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈。以cDNA為模板對(duì)F3′5′H基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析。

1.2.9轉(zhuǎn)基因植株Southern印跡分析選取PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因抗性植株提取足量DNA，使用購(gòu)買于羅氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 試劑盒進(jìn)行Southern印跡分析。以質(zhì)粒p1300-pPZP-F3′5′H-DFR為模板，使用HPTⅡ-F和HPTⅡ-R為引物，合成的片段進(jìn)行回收制備探針。選取EcoRI酶切過夜，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)變性，中和后用高鹽轉(zhuǎn)移法將膠上的樣品轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，進(jìn)行雜交，洗膜，顯影。

2結(jié)果與分析

2.1Robina百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

2.1.1預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響對(duì)百合的2種轉(zhuǎn)化受體分別進(jìn)行 0 ～ 4 d 預(yù)培養(yǎng)(圖2)。結(jié)果表明不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)直接進(jìn)行浸染的胚性愈傷和小鱗片都比較容易發(fā)生褐化(圖版I ，a)，抗性芽誘導(dǎo)率很低。小鱗片預(yù)培養(yǎng) 3 d 時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率最高，為 12.78%；預(yù)培養(yǎng) 4 d 后抗性芽誘導(dǎo)率又開始下降。而胚性愈傷預(yù)培養(yǎng)2 d穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率最高, 為12.22%?？梢姴唤?jīng)過預(yù)培養(yǎng)的百合胚性愈傷和小鱗片直接與菌液接觸會(huì)傷害到細(xì)胞，不利于抗性芽的產(chǎn)生，但時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞則轉(zhuǎn)化不敏感，也不利于農(nóng)桿菌侵染。

2.1.2共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響預(yù)培養(yǎng)完后, 對(duì)百合胚性愈傷和小鱗片進(jìn)行共培養(yǎng)。由圖3可以得出, 胚性愈傷和小鱗片都是共培養(yǎng)3 d穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率最高, 分別是12.23%和11.94%。其中胚性愈傷共培養(yǎng)時(shí)間超過3 d轉(zhuǎn)化率急速下降, 而小鱗片的轉(zhuǎn)化率下降緩慢。共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng), 轉(zhuǎn)化材料越不易脫菌, 所以轉(zhuǎn)化率也會(huì)降低。

2.1.3AS濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響在侵染和共培養(yǎng)的過程中都需要加入一定量的AS, 加入AS有利于提高農(nóng)桿菌Vir基因活性，Vir基因(virulence genes)決定了農(nóng)桿菌侵染能力[9-10]，從而可以提高轉(zhuǎn)化效率。由圖4可以看出，AS為100 μmol/L時(shí)，兩者轉(zhuǎn)化率最高，胚性愈傷為11.67%，小鱗片為11.11% 。雖然愈傷組織和小鱗片的最適AS濃度相同，但是小鱗片在AS<100 μmol/L時(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率低于胚性愈傷，在AS>100 μmol/L時(shí)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化明顯高于胚性愈傷。

2.1.4潮霉素濃度篩選在轉(zhuǎn)化過程中選用潮霉素進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過2個(gè)月的篩選，結(jié)果表明(表2)，當(dāng)不加入潮霉素時(shí)，小鱗片和胚性愈傷的分化率分別是88.89%和91.33%，隨著潮霉素濃度的的增加，分化率不斷降低，當(dāng)潮霉素濃度為20 mg·L-1時(shí)，外植體幾乎全部褐化，所以小鱗片和胚性愈傷的潮霉素的篩選濃度確定為20 mg·L-1。

2.2轉(zhuǎn)基因植株的再生

2種轉(zhuǎn)化受體的獲得(圖版Ⅰ, b～i), 經(jīng)過篩選培養(yǎng)45 d后,未轉(zhuǎn)化的胚性愈傷和小鱗片逐漸褐化死亡, 而轉(zhuǎn)化的會(huì)產(chǎn)生抗性芽(圖版Ⅰ,j 和k)。產(chǎn)生的抗性芽長(zhǎng)度長(zhǎng)到3～5 cm時(shí)，切下進(jìn)行再培養(yǎng)，使用高糖培養(yǎng)基可以使其生長(zhǎng)更加強(qiáng)壯(圖版Ⅰ,l)?？剐悦玳L(zhǎng)大后,就可以進(jìn)行檢測(cè)和移栽。

2.3轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)

獲得187株百合潮霉素抗性苗，隨機(jī)挑選生長(zhǎng)強(qiáng)壯的小苗進(jìn)行PCR檢測(cè)，分別對(duì)F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，最終有15株百合苗擴(kuò)增得到目的條帶，其中9株的PCR結(jié)果如下(圖5),說明外源基因整合到百合苗中(圖5)。

圖2　預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)百合胚性愈傷和小鱗片穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 2　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different pre-culture time

圖3　共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)百合胚性愈傷和小鱗片穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 3　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different co-culture time

圖4　AS濃度對(duì)百合胚性愈傷和小鱗片穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4　Stable transformation rate of lily embryonic callus and bulb scale in different acetosyringone concentration

2.4轉(zhuǎn)化植株的RT-PCR檢測(cè)

對(duì)PCR檢測(cè)獲得目的條帶的15株百合苗再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，最終有9株出現(xiàn)F3′5′H基因的目的條帶(圖6)，說明藍(lán)色花基因F3′5′H在百合植株中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

表2　百合再生小鱗片和胚性愈傷組織的潮霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

注：表中數(shù)據(jù)代表3次重復(fù)試驗(yàn)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”；同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示在P=0.05水平差異顯著。

Note：Data in the table are “average±standard error”of there repeat tests. Data in the same column with different lowercase letters have significant differences atP=0.05 level.

A. F3′5′H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker；P.質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；WT.未轉(zhuǎn)化植株；1～9.轉(zhuǎn)基因植株圖5　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H、DFR和HPTⅡ基因的PCR檢測(cè)A. F3’5’H; B. DFR; C. HPTⅡ；M.Marker; P.Positive control; WT. Non-transformed; 1-9.Transformed plantletsFig. 5　PCR detection of transformed plantlets for presence of F3′5′H gene,DFR gene and HPTⅡ gene

2.5轉(zhuǎn)化植株的Southern 印跡分析

為了再進(jìn)一步檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)入到百合基因組中，對(duì)經(jīng)過PCR和RT-PCR的植株再進(jìn)行Southern印跡分析。結(jié)果表明(圖7)，有6株出現(xiàn)雜交帶，分別為植株1、2、3、4、5、9，其中植株1、2、3、4、5為單一雜交帶，說明其為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單拷貝；植株9有2條雜交帶，說明其為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的2個(gè)拷貝，植株6、7、8和對(duì)照未出現(xiàn)雜交信號(hào)，說明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因沒有轉(zhuǎn)入到百合基因組中。

3討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是現(xiàn)代百合轉(zhuǎn)基因研究中常用的方法[11]，自1992年Cohen等[12]首次通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因百合以來，百合轉(zhuǎn)基因的研究取得了非常大的進(jìn)步。其中轉(zhuǎn)化材料對(duì)轉(zhuǎn)化結(jié)果有很大的影響[11]，愈傷組織和小鱗莖是最常用的轉(zhuǎn)化材料。張杰等[13]使用不同濃度配比的激素NAA和6-BA，對(duì)LA系列百合Eyeliner 的花器官進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。本實(shí)驗(yàn)室[1-2]發(fā)現(xiàn)使用不同濃度的PIC 激素對(duì)OT系列百合Robina花器官進(jìn)行誘導(dǎo)，也可以誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。本研究中使用1.0 mg·L-1PIC誘導(dǎo)花絲同時(shí)獲得了胚性愈傷和小植株。

M.Marker；P.質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；WT.未轉(zhuǎn)化植株；1～15.轉(zhuǎn)基因植株圖6　百合潮霉素抗性植株的F3′5′H基因的RT-PCR檢測(cè)M.Marker; P. Positive control; WT. Non-transformed; 1-15.Transformed plantletsFig. 6　RT-PCR detection of transformed plantletsfor presence of F3′5′H gene

N. 未轉(zhuǎn)化植株(對(duì)照)；1～9.RT- PCR陽(yáng)性潮霉素抗性植株圖7　潮霉素抗性植株的Southern blot印記分析N. Non-transformed plants(comparison); 1-9. RT- PCR positive transgenic plantsFig. 7　Southern blot analysis of putative transgenic lines

胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)基因受體材料具有很多的優(yōu)點(diǎn)，例如繁殖速度比較快速，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率比較高，嵌合體比較少[14]。2003年時(shí)Mercuri A等[15]就利用胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，成功轉(zhuǎn)化了百合。本研究中對(duì)胚性愈傷組織進(jìn)行了懸浮培養(yǎng)[16-17]，前期權(quán)永輝[2]對(duì)Robina百合懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究，本研究在其基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，加入30 mg·L-1檸檬酸降低百合褐化率，成功獲得Robina百合的懸浮系，用作百合轉(zhuǎn)基因的受體材料。

使用小鱗片作為百合轉(zhuǎn)化的受體材料的研究有很多，因?yàn)橛眯△[片不定芽分化率高，在器官發(fā)生過程中不易形成嵌合體[18]。例如，2012年袁霖等[19]使用東方百合索邦的鱗片成功轉(zhuǎn)化了花青素合成調(diào)節(jié)基因Rosea1；2014年李云華等[20]使用新鐵炮百合鱗片成功轉(zhuǎn)化了LfMADS1基因；2014年張煥等[21]使用亞洲百合鱗片成功轉(zhuǎn)化了GsZFP1基因。本研究使用的是再生植株的小鱗片，轉(zhuǎn)化時(shí)污染率低, 可以提高轉(zhuǎn)化的成功率。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)在Robina百合中, 只使用NAA一種激素即可使小鱗片再生出小苗，節(jié)約了研究的成本。

在本研究中同時(shí)使用了2種轉(zhuǎn)化材料，都獲得了百合抗性植株，經(jīng)過PCR、RT-PCR以及Southern印記分析最終得到了6株攜帶藍(lán)色基因F3′5′H的轉(zhuǎn)基因百合，為后續(xù)獲得藍(lán)色的百合花提供了技術(shù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。

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圖版Ⅰ　百合胚性愈傷和小鱗片的產(chǎn)生及其轉(zhuǎn)化成苗過程a.預(yù)培養(yǎng)褐化的外植體；b.花絲產(chǎn)生胚性愈傷；c.胚性愈傷組織；d.百合懸浮培養(yǎng)系；e.胚性愈傷的共培養(yǎng)；f .花絲誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽；g.百合小芽；h.長(zhǎng)大的百合苗；i.小鱗莖的共培養(yǎng)；j.胚性愈傷產(chǎn)生的抗性芽；k.小鱗片產(chǎn)生的抗性芽；l.抗性植株P(guān)late Ⅰ　Production of lily embryonic callus and bulb scales and the transformation into seedlinga. Pre-cultured explants browning; b.Filaments produce embryogenic callus; c. Embryogenic callus; d.Suspension culture system of Lily; e.Co-culture of embryogenic callus; f.Filaments induced bud; g .Lily bud; h. Growing lily seedlings; i. Co-culture of small bulbs; j.Resistant buds produced from embryogenic callus; k. Resistant bud produced by bulb scale; l.Resistant plants

(編輯:宋亞珍)

Genetic Transformation of thePhalaenopsisF3′5′Hto OT Lily Robina

LIU Ailing, LIU Yali*, LOU Qian, ZHANG Haiqin

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, College of forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China)

Abstract:To obtain bluish Lilium spp. in direct breeding, we screened the suitable variety-OT lily Robina for genetic transformation. Here, both embryonic callus induced from filament and regenerated bulb scales of OT lily Robina were used as the transformation material. Agrobacterium-mediated transformation of Phalaenopsis F3′5′H was studied. The results showed：with the pre-culture 3 d, OD600=0.8, infection time 10 min, co-cultured for 3 d, 100 μmol/L acetosyringone conditions, the stable transformation rate of regenerated bulb scales could reach to the highest 12.78%; however, embryogenic callus pre-culture 2 d, OD600= 0.8, infection time 10 min, co-cultured 3 d, with 100 μmol/L acetosyringone conditions, which the stable transformation rate was the highest 12.22%. In all the conditions, the best hygromycin-resistant screening concentrations always was 20 mg/L. PCR and reverse transcription PCR assay showed 9 putative transgenic plants were obtained. Southern hybridization analysisfurther proved 6 plants that the transgenic lilium flowers carry blue gene F3′5′H. The results provided technical support and material basis for the continuing development of novel bluish Lilium flowers.

Key words:F3′5′H；lily Robina; embryonic callus; bulb scales; genetic transformation

文章編號(hào):1000-4025(2016)05-0874-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0874

收稿日期:2016-01-31;修改稿收到日期:2016-04-26

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31471905)

作者簡(jiǎn)介:劉愛玲(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事園林分子植物育種方面的研究。E-mail：1032239251@qq.com *通信作者:劉雅莉，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園林遺傳育種方面的研究。E-mail：lyl6151@126.com

中圖分類號(hào):Q785;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A