甘蔗生長素結(jié)合蛋白ScABP4基因的克隆與表達(dá)

鄧宇晴，翟玉山，彭　磊，董　萌，徐　倩，程光遠(yuǎn)，林彥銓，徐景升

(福建農(nóng)林大學(xué)/農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳改良重點實驗室, 福州 350002)

甘蔗生長素結(jié)合蛋白ScABP4基因的克隆與表達(dá)

鄧宇晴，翟玉山，彭磊，董萌，徐倩，程光遠(yuǎn)，林彥銓，徐景升*

(福建農(nóng)林大學(xué)/農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳改良重點實驗室, 福州 350002)

摘要:生長素結(jié)合蛋白(auxin binding protein, ABP)在生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物生長發(fā)育調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。該研究利用RT-PCR方法從甘蔗品種Badila中克隆得到了1個ABP基因，序列分析顯示該基因的開放讀碼框(ORF)長度為615 bp，編碼204個氨基酸。多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明它與高粱(Sorghum bicolor)和玉米(Zea mays)的ABP4蛋白的親緣關(guān)系最近，因此將該基因命名為ScABP4。將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，成功表達(dá)出一個分子量約為22.5 kD的蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ScABP4主要定位于細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜；生物信息學(xué)分析顯示ScABP4是一個帶有信號肽的分泌蛋白，說明ScABP4蛋白可能儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并在質(zhì)膜上執(zhí)行其生物學(xué)功能。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，ScABP4基因在甘蔗的芽、根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在芽中相對表達(dá)量最高。生長素和黑暗處理下ScABP4基因的表達(dá)上調(diào)，說明ScABP4基因可能參與甘蔗對生長素的響應(yīng)及與光信號通路的互作。此外，ABA、JA、SA、CuCl2脅迫能夠誘導(dǎo)ScABP4基因的表達(dá)，CdCl2脅迫可抑制ScABP4的表達(dá)。由此推測,ScABP4基因可能參與甘蔗對病害、干旱、滲透、重金屬等脅迫的應(yīng)答過程。該研究結(jié)果為探討甘蔗生長素結(jié)合蛋白基因的功能提供了實驗證據(jù)。

關(guān)鍵詞:甘蔗；生長素結(jié)合蛋白；同源克??；表達(dá)分析

生長素(auxin)是植物調(diào)控生長發(fā)育和逆境響應(yīng)最重要的激素之一，參與植物整個周期的生命活動，如胚形成、細(xì)胞分裂和伸長、維管束分化、側(cè)根分化、向地性、向光性等。生長素可以直接作用于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)組分，也可以間接參與基因的表達(dá)調(diào)控。研究生長素的作用機制，闡明生長素在細(xì)胞及分子水平的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制對于了解植物生長發(fā)育的調(diào)控、信息傳遞以及環(huán)境脅迫應(yīng)答機制具有重要意義。

生長素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是其調(diào)控植物生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中第一步是與受體結(jié)合。目前已知主要有3類生長素受體：其中2類是位于細(xì)胞內(nèi)的泛素化復(fù)合體(SCFTIR1/AFB和SCFSKP2A)，1類是位于質(zhì)膜上的生長素結(jié)合蛋白(auxin-binding protein1, ABP1)[1]。這3類受體各自介導(dǎo)了1個信號通路，目前研究得較清楚的是由SCFTIR1/AFB介導(dǎo)的信號途徑：當(dāng)生長素濃度較低時，轉(zhuǎn)錄抑制子Aux/IAA與ARF(調(diào)控生長素基因響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子)相結(jié)合阻止其結(jié)合到生長素響應(yīng)基因啟動子上的生長素反應(yīng)元件(auxin response element, ARE)上，抑制生長素響應(yīng)基因的表達(dá)；當(dāng)生長素濃度升高時，Aux/IAA被連接到SCFTIR1/AFB復(fù)合體上經(jīng)泛素途徑降解，ARF釋放出來與ARE結(jié)合，啟動生長素下游響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響植物的生長發(fā)育[2-3]；SCFSKP2A復(fù)合體則通過結(jié)合生長素調(diào)控細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄阻遏物的蛋白水解并誘導(dǎo)細(xì)胞分裂[1,4]；ABP1通過與生長素結(jié)合，然后與跨膜激酶蛋白(transmembrane kinase, TMK)形成細(xì)胞表面生長素傳感復(fù)合體，激活小G蛋白RhoGTPase(ROP)2或6信號通路，快速傳遞生長素信號，從而調(diào)控PIN的定位，調(diào)控非轉(zhuǎn)錄細(xì)胞質(zhì)反應(yīng)以及相關(guān)過程，并參與大量的生長素早期應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞擴展和細(xì)胞分裂、生長素的極性輸出與反饋調(diào)控等[5-10]。但是，由于ABP1在植物體中的表達(dá)量低且敲除通常會致死，故ABP1介導(dǎo)的信號途徑研究相對滯后。植物體內(nèi)的幾條生長素信號途徑也并非完全相互獨立，而是存在交叉。最近研究發(fā)現(xiàn)，ABP1位于TIR1/AFB的上游，它可以增強Aux/IAA蛋白的穩(wěn)定性，對SCFTIR1/AFB信號途徑起到負(fù)調(diào)控的作用，植物體通過這兩種途徑的精確平衡從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。

除了ABP1外，ABPs家族還有多個成員，如玉米中至少存在5類ABPs[12-13]，且不同物種的ABPs家族成員數(shù)目都不同，不同類型的ABPs可能受時空調(diào)節(jié)并在功能上存在冗余[14-15]。ABPs最早在玉米上被發(fā)現(xiàn)[16]，隨后在擬南芥[17]、辣椒[18]、煙草[19]、棉花[20]、水稻[21]、苧麻[22]、小麥[23]等植物中也克隆了該類基因并進(jìn)行了相關(guān)功能研究，但是迄今為止國內(nèi)外尚未見到此類基因在甘蔗上的研究報道。

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是中國最重要的糖料作物，也是高生物量的能源作物。甘蔗的收獲物是營養(yǎng)體，即蔗莖，甘蔗的莖徑、株高等是甘蔗產(chǎn)量形成的最重要因素，它們對生長素的應(yīng)答非常明顯。因此，研究生長素的受體基因，解析生長素對甘蔗的生長發(fā)育調(diào)控和逆境響應(yīng)機制對于甘蔗生產(chǎn)具有重要意義。本研究從甘蔗中克隆到一個ABP基因，并通過原核表達(dá)、亞細(xì)胞定位、實時熒光定量技術(shù)對其進(jìn)行了表達(dá)分析，為初步了解甘蔗ABP基因的功能提供了實驗證據(jù)。

1材料和方法

1.1材料及處理

從福建農(nóng)林大學(xué)試驗田中選取長勢一致的甘蔗品種Badila健康植株，取正一葉、莖、白色嫩根和芽，用于基因的組織特異性表達(dá)實驗，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3株。

使用Badila組培苗研究不同處理下基因的表達(dá)。將5葉期的組培苗放入蒸餾水中培養(yǎng)10 d，選取長勢一致的小苗用于處理，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定取樣時間點，每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3株。處理組處理條件為水楊酸(5 mmol·L-1SA水溶液)、茉莉酸(100 μmol·L-1JA水溶液)、脫落酸(100 μmol·L-1ABA水溶液)，分別于處理3、12和24 h取樣；CuCl2(100 μmol·L-1水溶液)、CdCl2(50 μmol·L-1水溶液)處理分別于12、24和48 h取樣；生長素(200 μmol·L-1IAA水溶液)處理分別于3、12、24和48 h取樣；黑暗處理分別于1、3、6和12 d取樣。未處理幼苗為對照。取樣后用液氮速凍，然后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1ScABP4基因的克隆以高粱和玉米ABP基因序列(XM_002442193.1、EU975483.1、JN243771.1、S53630.1、X16308.1、X16309.1和EU944559.1)作為參考序列，利用Primer Premier 5軟件在基因序列5′、3′端保守區(qū)域設(shè)計特異性引物(表1)。采用Trizol法提取甘蔗品種Badila葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)體系為25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，將其連接到pMD19-T Vector中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選以及菌液PCR驗證后，委托生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.2.2生物信息學(xué)分析利用DNAMAN和ORF Finder軟件，對克隆獲得的ScABP4基因的核酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析；利用ExPASy服務(wù)器(http://www.expasy.org/proteomics)的ProtParam、Compute PI/Mw和ProtScale工具預(yù)測ScABP4蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性；利用TEPred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)工具分析 ScABP4蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/)預(yù)測ScABP4蛋白的信號肽；利用GOR IV(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)對

ScABP4蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用MEGA6.0(Neighbor-Joining法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3ScABP4原核表達(dá)根據(jù)測序得到的目的基因ORF，設(shè)計原核表達(dá)特異性引物(表1)，以pMD19-T-ScABP4質(zhì)粒為模板，擴增目的基因片段。反應(yīng)體系為25 μL，含ExTaq0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.375 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和XhoI酶切，利用T4連接酶連接到同樣酶切過的表達(dá)載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切檢測、質(zhì)粒PCR鑒定及測序，陽性克隆命名為pGEX-6P-1-ScABP4。將空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入宿主菌E.coliRosetta(DE3)中，挑取單菌落，在10 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Amp)中37 ℃培養(yǎng)過夜。取400 μL培養(yǎng)物于30 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1Amp)中二次活化至OD600為0.6;加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)至10 h(每2 h取樣1 mL)，分別收集菌液，4 ℃、8 000g離心10 min后收集菌體;加入30 μL蛋白加樣緩沖液，沸水浴5 min;常溫下12 000g離心5 min，吸取10 μL上清液點樣，12% SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達(dá)。

1.2.4ScABP4亞細(xì)胞定位利用在線軟件PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)預(yù)測ScABP4的亞細(xì)胞定位并進(jìn)行實驗驗證。根據(jù)目的基因ORF，設(shè)計亞細(xì)胞定位特異性引物(表1)，以PMD19-T-ScABP4質(zhì)粒為模板，擴增目的基因片段。純化后的目的基因片段經(jīng)BamH I 和XbaI酶切后與同樣酶切過的pCAMBIA 2300-GFP載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過雙酶切檢測、質(zhì)粒PCR鑒定及測序，陽性克隆命名為35S-ScABP4-GFP。將獲得的重組質(zhì)粒陽性克隆和空載體35S-GFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，在LB液體培養(yǎng)基(含50·μg mL-1Kan和35·μg mL-1Rif)中28 ℃培養(yǎng)過夜，制備農(nóng)桿菌懸浮液，調(diào)整菌液OD600為0.8，注入本氏煙葉片，2 d后觀察熒光定位結(jié)果。

1.2.5ScABP4基因表達(dá)分析采用Trizol法提取甘蔗伸長期的正一葉、芽、莖、幼根及處理組和對照組葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為定量PCR的模板。根據(jù)克隆獲得的ScABP4基因的ORF序列，設(shè)計實時熒光定量PCR引物(表1)，以GAPDH作為內(nèi)參基因[24]，按照SYBR Green PCR Master Mix Kit(Roche)說明書配置定量反應(yīng)體系，在7500型實時熒光定量PCR儀(ABI，USA)上完成定量PCR擴增，每個樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。擴增程序為50 ℃ 2 min(只有當(dāng)反應(yīng)液中加入了UNG酶時選用)；95 ℃ 10 min(激活TaqDNA聚合酶)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)；添加溶解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt算法分析獲得數(shù)據(jù)[25]。

表1　ScABP4基因克隆與表達(dá)所用引物

2結(jié)果與分析

2.1ScABP4基因序列的獲得與生物信息學(xué)分析

克隆得到一個長度為640 bp的單一條帶(圖1)。通過測序和序列分析顯示，該基因ORF長度為615 bp，編碼204個氨基酸(圖2)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BlastN工具比對得知，該基因與高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)和谷子(Setariaitalica)等

物種ABP4基因高度同源，相似性分別為95%、94%和87%。表明該基因為甘蔗生長素結(jié)合蛋白基因，因此命名為ScABP4，并將其登錄到GenBank，登錄號為KT880509。

ProtParam、Compute PI/Mw預(yù)測表明，ScABP4分子量為22.5 kD，等電點5.87，負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)22，正電荷殘基(Arg+Lys)17，不穩(wěn)定系數(shù)42.67，為不穩(wěn)定蛋白。ProtScale預(yù)測表明，ScABP4第27位氨基酸具有最高分值2.911，第61位氨基酸具有最低分值-2.378，平均疏水性(GRAVY)為-0.119，故推測為親水蛋白。TMPred預(yù)測表明，ScABP4蛋白有2個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中一個總分為1 750，有從內(nèi)到外的跨膜能力；另一個總分為1 542，有從外到內(nèi)的跨膜能力。總GOR IV 預(yù)測表明，ScABP4中無規(guī)則卷曲所占的比例最高為55.88%，其次是α-螺旋占25.00%，延伸鏈所占比例是19.12%，無β-折疊結(jié)構(gòu)。信號肽預(yù)測表明，第42位絲氨酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.364和最高的綜合剪切位點分值0.546，第28位亮氨酸殘基具有最高的信號肽分值0.987。根據(jù)最后算得氨基酸殘基的加權(quán)平均值0.642，推測ScABP4基因所編碼的蛋白中存在信號肽，為分泌蛋白。

M. 100 bp分子量標(biāo)記; 1. PCR 擴增產(chǎn)物圖1　甘蔗ScABP4基因的PCR擴增結(jié)果M. 100 bp ladder marker; 1. PCR amplified productFig. 1　PCR amplified products of ScABP4

下畫線表示翻譯起始位點；*表示終止密碼子圖2　甘蔗ScABP4基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Underline indicates translation initiation site; * indicates stop codonFig. 2　The nucleotide acid sequence of ScABP4 and its deduced amino acid sequence

2.2ScABP4氨基酸序列相似性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用NCBI中的BlastP程序，對ScABP4的氨基酸序列進(jìn)行相似性比對。結(jié)果(圖3)顯示，其與高粱(Sorghumbicolor_ref|XP_002442238.1|)、玉米(Zeamays_ref|XP_008662629.1|)、谷子(Setariaitalica_ref|XP_004962873.1|)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon_ref|XP_003575870.1|)和水稻(OryzasativaJaponicaGroup_ref|NP_001066918.1|)ABP蛋白的氨基酸序列相似性分別為94%、92%、86%、86%和85%。其編碼的蛋白質(zhì)具有ABP家族蛋白的典型特征(圖3)，即具有包含13～20個氨基酸殘基的BoxA、BoxB、BoxC 3個高度保守的生長素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合信號區(qū)(KDEL)。

Box A、B和C是植物ABP的3個高度保守結(jié)構(gòu)域；KDEL是C端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列圖3　甘蔗ScABP4氨基酸序列與其他植物相似性比對Boxes A, B and C correspond to highly conserved domains among all plant ABP; KDEL is the C-terminal sequence which may function as a signal for retaining the protein in the lumen of the ERFig. 3　Similarity comparison of ScABP4 amino acid sequences among sugarcane and other plant species

分支節(jié)點上的數(shù)值為自舉值；標(biāo)尺代表遺傳距離；括號內(nèi)編號氨基酸登錄號圖4　不同物種基于ABP基因氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Numbers above branches on the left indicate bootstrap values of 1 000 replicates; The scale bar represents genetic distance; The accession No. is given in bracketsFig. 4　Phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by ABP gene among different plant species

M1. 15 000+2 000 bp分子量標(biāo)記; M2. 100 bp 分子量標(biāo)記; 1. 重組質(zhì)粒雙酶切片段圖5　pGEX-6P-1-ScABP4重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M1. 15 000+2 000 bp marker; M2. 100 bp marker; 1. Enzyme digestion fractions of pGEX-6P-1-ScABP4Fig. 5　PCR identification of pGEX-6P-1-ScABP4 with BamH I/Xho I

ScABP4蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖4)結(jié)果顯示，進(jìn)化樹大體分為兩個分支，其中同屬單子葉植物的高粱、玉米、水稻、谷子、二穗短柄草、燕麥(Avenasativa_dbj|BAA25433.1|)、大麥(Hordeumvulgare_dbj|BAK02611.1|)和烏拉爾圖小麥(Triticumurartu_gb|EMS50686.1|)位于一個分支，雙子葉植物油棕(Elaeisguineensis_ref|XP_010931928.1|)、海棗(Phoenixdactylifera_ref|XP_008793651.1|)、龍眼(Dimocarpuslongan_gb|ACX54195.3|)為另一分支，ScABP4與高粱、玉米等物種ABP進(jìn)化距離較近。

2.3原核表達(dá)載體的鑒定與重組蛋白的SDS-PAGE分析

重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-ScABP4經(jīng)BamH I、XhoI酶切后產(chǎn)物呈現(xiàn)清晰的2條泳帶，分別在640 bp(目的基因片段)和5 000 bp(載體片段)左右(圖5)。對重組質(zhì)粒測序顯示，序列ORF與原克隆序列一致，表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，在分子量48 kD左右處

可見1條特異性條帶，ABP4蛋白的大小理論約為22 kD，加上pGEX-6P-1載體上的GST標(biāo)簽蛋白大小約為26 kD，因此與本文預(yù)測的蛋白大小基本相符，可以確定該融合蛋白成功表達(dá)(圖6)。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 未誘導(dǎo)空質(zhì)粒;2. IPTG 誘導(dǎo)8 h后的空質(zhì)粒;3. 未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒;4～7. IPTG分別誘導(dǎo)2、4、6、8 h后的重組質(zhì)粒圖6　誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析M. Protein molecular weight marker; 1. pGEX-6P-1 without induction; 2. pGEX-6P-1 after inducing for 8 h; 3. pGEX-6P-1-ScABP4 without induction; 4-7. pGEX-6P-1-ScABP4 after inducing for 2, 4, 6 and 8 h, respectivelyFig. 6　Analysis of expressed proteins by SDS-PAGE

A. GFP對照; B. GFP空載的明場; C. GFP空載的葉綠體; D. GFP空載的疊加場; E. ScABP4-GFP; F. ScABP4-GFP的明場; G. ScABP4-GFP的葉綠體; H. ScABP4-GFP的疊加場圖7　ScABP4的亞細(xì)胞定位分析A. GFP control; B. GFP vision under natural light; C. Chlorophyll of 35S-GFP; D. GFP overlapped vision of A, B, and C; E. ScABP4-GFP; F. ScABP4-GFP vision under natural light; G. Chlorophyll of 35S-ScABP4-GFP;H. ScABP4-GFP overlapped vision of E, F and GFig. 7　Subcellular localization of ScABP4 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamiana (bars=50 μm)

2.4ScABP4的亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)Psort軟件預(yù)測，ScABP4蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(腔)、質(zhì)膜、微體(過氧物酶體)、高爾基體的可能性分別為80.0%、79.0%、63.1%和30%，其中定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(腔)和質(zhì)膜的概率最高，因此，推測其最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(腔)和質(zhì)膜上。

本氏煙葉片在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光。結(jié)果(圖7)顯示，對照組35S-GFP可單獨在煙草表皮細(xì)胞中大量表達(dá)，綠色熒光信號在細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜和細(xì)胞核中均有分布；與其相比，35S-ScABP4-GFP融合蛋白綠色熒光信號主要分布于細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上，該定位結(jié)果與Psort軟件預(yù)測結(jié)果基本一致。

不同字母表示差異顯著性(P<0.05)圖8　ScABP4基因的組織特異性表達(dá)分析The different subscriptions with different letters indicate significant difference (P < 0.05)Fig. 8　Tissue-specific expression analysis of ScABP4 from different tissues in sugarcane

2.5ScABP4基因的表達(dá)分析

ScABP4在伸長期甘蔗的不同組織中均有表達(dá)，而且具有組織特異性，其中在芽中表達(dá)量最高，其次是在葉中，在莖中表達(dá)量最低(圖8)。

ScABP4基因能夠被外源IAA(200 μmol·L-1)、黑暗、SA(5 mmol·L-1)、JA(100 μmol·L-1)、ABA(100 μmol·L-1)和CuCl2(100 μmol·L-1)強烈誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而在CdCl2(50 μmol·L-1)脅迫下基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(圖9)，說明CdCl2抑制ScABP4基因的表達(dá)。其中，ABA、IAA、CuCl2處理下ScABP4基因的表達(dá)量均在24 h達(dá)到最高，分別為對照的1.3、2.3、1.5倍；JA處理3 h后，ScABP4基因表達(dá)量顯著上調(diào)，約為對照的2.8倍，隨后表達(dá)量逐漸降低，但仍明顯高于對照(圖9，A)；黑暗處理6 d時ScABP4基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，為對照的3倍，此后隨著時間推移到12 d，表達(dá)量仍處于較高水平(圖9，B)。

3討論

生長素結(jié)合蛋白中研究得最深入的是ABP1，而其他家族成員則相對較少，尚不清楚它們在植物體內(nèi)時空表達(dá)、調(diào)控及功能上是否存在特異性。近年來有文獻(xiàn)報道，在玉米中ABP4參與幼苗生長，介導(dǎo)幼苗對生長素的響應(yīng)，與光信號通路互作并與ABP1在功能上互作[14-15]，但在其他植物上鮮見ABP4的研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)ScABP4主要定位于細(xì)胞質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜，但是由于本實驗沒有使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性標(biāo)記，所以ScABP4在細(xì)胞質(zhì)中的精細(xì)定位還有待進(jìn)一步探討。ScABP4是分泌蛋白，推測它可能與ABP1一樣，儲存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，通過分泌途徑在質(zhì)膜上發(fā)揮作用。

小寫字母表示同一處理下不同處理時間的差異顯著性(P<0.05)圖9　ScABP4基因在不同處理下的表達(dá)The different lowercase letters indicate significant difference of the same treatment during different treatment times (P < 0.05)Fig. 9　qRT-PCR analysis of ScABP4 expression in different treatments

Fellner[26-27]發(fā)現(xiàn)，ABP4在光和生長素誘導(dǎo)的生長響應(yīng)中起重要作用，在古老的玉米品種中ABP4基因在光照和外源生長素誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)。本研究中ScABP4在外源生長素處理下上調(diào)表達(dá)，與Fellner的結(jié)論一致，推測外源生長素誘導(dǎo)產(chǎn)生ScABP4與之結(jié)合，以便進(jìn)行下一步的運輸。但ScABP4在黑暗處理下也上調(diào)表達(dá)，與Fellner的結(jié)論相左，推測ABP家族成員的功能可能具有物種特異性。在玉米黃化苗中，ABP1和ABP4都響應(yīng)光信號并在下胚軸伸長上功能互補，但是在胚芽鞘的生長上，ABP1并非必需，而在葉片角度發(fā)育上，ABP4對ABP1可能起負(fù)調(diào)控作用[15]。甘蔗是高倍體植物，甘蔗中ABP家族成員的數(shù)目和功能可能更為復(fù)雜。植物激素可以調(diào)控植物生長發(fā)育，參與環(huán)境信號傳導(dǎo)。ABA是一種脅迫激素，它能誘導(dǎo)植物抗性基因的表達(dá)；JA能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對害蟲有毒、抗?fàn)I養(yǎng)和抗消化作用的化合物，對害蟲生理活動產(chǎn)生不利影響；SA在超敏反應(yīng)中能介導(dǎo)細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein，PR)基因的表達(dá)和一些防衛(wèi)基因的表達(dá)。在基因的啟動子區(qū)通常有多種反應(yīng)元件結(jié)合位點，這使得基因可以接受不同信號的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)表達(dá)，因此，這些激素信號通路之間相互作用，共同響應(yīng)環(huán)境刺激[28]。目前，尚未有ABP基因在上述激素脅迫下表達(dá)的相關(guān)報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在甘蔗幼苗中ScABP4受SA、JA和ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測這些激素處理對甘蔗幼苗造成逆境，而甘蔗苗處于旺盛的生長發(fā)育階段，因此合成更多生長素受體，調(diào)節(jié)內(nèi)源生長素的含量和分布，以此拮抗這些激素的負(fù)作用。銅是植物必需微量元素，是細(xì)胞色素氧化酶、多酚氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多胺氧化酶、Cu/Zn-SOD等蛋白質(zhì)的重要輔因子，參與呼吸代謝中的氧化還原反應(yīng)；在葉綠體質(zhì)體藍(lán)素中銅參與光合作用的電子傳遞過程，適量的銅對植物的生長發(fā)育有刺激和促進(jìn)作用，過量則對植物有害；鎘是植物非必需微量元素，高濃度下會對植物產(chǎn)生毒害作用[29-30]。在本研究中，CuCl2處理引起ScABP4上調(diào)表達(dá)，CdCl2處理引起ScABP4下調(diào)表達(dá)，說明ScABP4基因響應(yīng)了重金屬脅迫，但在不同重金屬脅迫下差異表達(dá)。已有報道顯示，高濃度的鎘能夠抑制生長素的合成[30]，推測ScABP4作為生長素受體而下調(diào)表達(dá)；也有研究表明，銅脅迫下誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工基因上調(diào)表達(dá)[31]，ScABP4是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分泌蛋白，故可能因此而上調(diào)表達(dá)。植物對外界環(huán)境信號的應(yīng)答機制復(fù)雜，本研究初步研究了ScABP4在不同處理下的表達(dá)，其具體的生物學(xué)功能，以及對生長素調(diào)控的分子機制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]SALEHIN M, BAGCHI R, ESTELLE M. SCFTIR1/AFB-based auxin perception: mechanism and role in plant growth and development[J].ThePlantCell, 2015, 27(1): 9-19.

[2]DHARMASIRI N, ESTELLE M. Auxin signaling and regulated protein degradation[J].TrendsinPlantScience, 2004, 9(6): 302-308.

[3]KEPINSKI S, LEYSER O. TheArabidopsisF-box protein TIR1 is an auxin receptor[J].Nature, 2005, 435(7 041): 446-451.

[4]JURADO S, ABRAHAM Z, MANZANO C,etal. TheArabidopsiscell cycle F-box protein SKP2A binds to auxin[J].ThePlantCell, 2010, 22(12): 3 891-3 904.

[5]XU T, DAI N, CHEN J,etal. Cell surface ABP1-TMK auxin-sensing complex activates ROP GTPase signaling[J].Science, 2014, 343(6 174): 1 025-1 028.

[6]TROMAS A, BRAUN N, MULLER P,etal. The AUXIN BINDING PROTEIN 1 is required for differential auxin responses mediating root growth[J].PLoSOne, 2009,4(9): e6648.

[7]CHEN D, REN Y, DENG Y,etal. Auxin polar transport is essential for the development of zygote and embryo inNicotianatabacumL. and correlated with ABP1 and PM H+-ATPase activities[J].JournalofExperimentalBotany, 2010, 61(6):1 853-1 867.

[8]TROMAS A, PAPONOV I, PERROT-RECHENMANN C. AUXIN BINDING PROTEIN 1: functional and evolutionary aspects[J].TrendsinPlantScience, 2010, 15(8): 436-446.

[9]EFFENDI Y, SCHERER G F E. AUXIN BINDING-PROTEIN1 (ABP1), a receptor to regulate auxin transport and early auxin genes in an interlocking system with PIN proteins and the receptor TIR1[J].PlantSignaling&Behavior, 2011, 6(8): 1 101-1 103.

[10]SHI J H, YANG Z B. Is ABP1 an auxin receptor yet[J].MolecularPlant, 2011, 4(4): 635-640.

[11]TROMAS A, PAQUE S, STIERLV,etal. Auxin-Binding Protein 1 is a negative regulator of the SCFTIR1/AFBpathway[J].NatureCommunications, 2013, 4: 2 496.

[12]HESSE T, FELDWISCH J, BALSHSEMANN D,etal. Molecular cloning and structural analysis of a gene fromZeamays(L.) coding for a putative receptor for the plant hormone auxin[J].TheEMBOJournal, 1989, 8(9): 2 453.

[13]SCHWOB E, CHOI S Y, SIMMONS C,etal. Molecular analysis of three maize 22 kDa auxin-binding protein genes-transient promoter expression and regulatory regions[J].ThePlantJournal, 1993, 4(3): 423-432.

[14]BORUCKA J, FELLNER M. Auxin binding proteins ABP1 and ABP4 are involved in the light-and auxin-induced down-regulation of phytochrome gene PHYB in maize (ZeamaysL.) mesocotyl[J].PlantGrowthRegulation, 2012, 68(3): 503-509.

[16]HERTEL R, THOMSON K S, RUSSO V E A. In-vitro auxin binding to particulate cell fractions from corn coleoptiles[J].Planta, 1972, 107(4): 325-340.

[17]KLODE M, DAHLKE R I, SAUTER M,etal. Expression and subcellular localization ofArabidopsisthalianaauxin-binding protein 1 (ABP1)[J].JournalofPlantGrowthRegulation, 2011, 30(4): 416-424.

[18]CHOI S Y. Molecular cloning and expression of the hot pepperERabp1 gene encoding auxin-binding protein[J].PlantmolecularBiology, 1996, 32(5): 995-997.

[19]SHIMOMURA S, ICHIKAWA H, WATANABE S. Characterization of auxin-binding protein 1 from tobacco: Content, localization and auxin-binding activity[J].Planta, 1999, 2 008(4): 21-25.

[20]孫建波, 崔百明, 劉德兵, 等. 棉花生長素結(jié)合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及序列分析[J]. 棉花學(xué)報, 2007, 19(4): 243-247.

SUN J B, CUI B M, LIU D B,etal. Cloning and analysis of auxin-binding protein 1 cDNA genes inGossypiumhirsutum[J].CottonScience, 2007, 19(4): 243-247.

[21]龔蓉, 黃志剛, 王若仲, 等. 水稻生長素結(jié)合蛋白ABP1的原核表達(dá)及純化[J]. 激光生物學(xué)報, 2011, 20(1): 78-82.

GONG R, HUANG Z G, WANG R Z,etal. Prokaryotic expression and purification of the auxin binding protein 1 in rice[J].ActaLaserBiologySinica, 2011, 20(1): 78-82.

[22]黃妤, 劉峰, 郭清泉, 等. 苧麻生長素結(jié)合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及表達(dá)[J]. 作物學(xué)報, 2008, 34(8): 1 358-1 365.

HUANG Y, LIU F, GUO Q Q,etal. Cloning and expression of auxin-binding proteins 1 gene in ramie [Boehmerianivea(Linn.) Gaud.][J].ActaAgronomicaSinica, 2008, 34(8): 1 358-1 365.

[23]喬麟軼, 張磊, 張文萍, 等. 小麥生長素結(jié)合基因TaABP1-D的克隆、功能標(biāo)記開發(fā)及其與株高的關(guān)聯(lián)[J]. 作物學(xué)報, 2012,38(11): 2 034-2 041.

QIAO L Y, ZHANGL, ZHANG W P,etal. Molecular cloning and development of a functional marker ofTaABP1-Dgene associated with plant height in bread wheat[J].ActaAgronomicaSinica, 2012, 38(11): 2 034-2 041.

[24]ISKANDAR H M, SIMPSON R S, CASU R E,etal. Comparison of reference genes for quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of gene expression in sugarcane[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2004, 22(4): 325-337.

[25]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[26]FELLNER M, HORTON L A, COCKE A E,etal. Light interacts with auxin during leaf elongation and leaf angle development in young corn seedlings[J].Planta, 2003, 216(3): 366-376.

[27]FELLNER M, FORD E D, VOLKENBURGH E V. Development of erect leaves in a modern maize hybrid is associated with reduced responsiveness to auxin and light of young seedlings in vitro[J].PlantSignaling&Behavior, 2006, 1(4): 201-211.

[28]溫小杰, 張學(xué)勇, 郝晨陽, 等. 植物激素信號傳導(dǎo)途徑研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2010, 12(6): 10-17.

WEN X J, ZHANG X Y, HAO C Y,etal. Research progress on plant hormone signal pathways[J].JournalofAgriculturalScienceandTechnology, 2010, 12(6): 10-17.

[29]PONGRATZ R. Arsenic speciation in environmental samples of contaminatedsoil[J].ScienceoftheTotalEnvironment, 1998, 224(1): 133-141.

[30]吳坤, 吳中紅, 邰付菊,等. 鎘脅迫對煙草葉激素水平、光合特性、熒光特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2011, 31(16): 4 517-4 524.

WU K, WU Z H, TAI F J,etal. Effects of cadmium on the contents of phytohormones, photosynthetic performance and fluorescent characteristics in tobacco leaves[J].ActaEcologicaSinica, 2011, 31(16): 4 517-4 524.

[31]張黛靜, 王多多, 董文, 等. 銅脅迫下小麥幼根轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 44(4): 31-35.

ZHANG D J, WANG D D, DONG W,etal. Transcriptomics and proteomics analysis in root of wheat under copper stress[J].JournalofHenanAgriculturalSciences, 2015, 44(4): 31-35.

(編輯:宋亞珍)

Molecular Cloning and Expression ofScABP4 Gene in Sugarcane

DENG Yuqing，ZHAI Yushan，PENG Lei，DONG Meng，XU Qian，CHENG Guangyuan，LIN Yanquan，XU Jingsheng*

(Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fuzhou 350002,China)

Abstract:Auxin binding protein (ABP) plays an important role in auxin signal transduction and the regulation of plant growth and development. To study the function and expression features of the ABP gene in sugarcane, we cloned an ABP gene from a sugarcane cultivar (Badila) using RT-PCR. Sequence analysis showed that it contained a 615 bp open reading frame (ORF) and encoded a deduced protein of 204 amino acids. It was designated as ScABP4 because of the multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis results revealed that it had closer relationships with ABP4 in Sorghum bicolor and Zea mays. It was cloned into the prokaryotic expression vector pGEX-6P-1 and expressed a 22.5 kD protein successfully in E. coli. Subcellular localization assay showed that ScABP4 protein is located in the reticular of cytoplasm and on the cytomembrane; protein structure prediction showed that it has a signal-peptide, speculate it may be stored in the endoplasmic reticulum, and exert its function on the plasma membrane. qRT-PCR showed that ScABP4 expressed in bud, root, stem and leaf in sugarcane with the highest expression level in bud. ScABP4 was up-regulated by IAA or dark treatments indicated that ScABP4 might participate in sugarcane responses to auxin, and involved in light signaling pathway(s). In addition, the expression of ScABP4 in sugarcane was induced by ABA, JA, SA and CuCl2 but was down-regulated by CdCl2. These results indicated that ScABP4 might involve in the sugarcane resistance to disease, osmotic and heavy metal stress, which provides the basis for further studying the functions of ScABP4.

Key words:sugarcane；auxin binding protein；homologous cloning；expression analysis

文章編號:1000-4025(2016)05-0865-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0865

收稿日期:2016-01-31;修改稿收到日期:2016-04-20

基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2013AA102604)；國家自然科學(xué)基金(31171605;31371688)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-20-1-1)

作者簡介:鄧宇晴(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事甘蔗病原與寄主互作分子機制方面的研究。E-mail：dyqdyq999@163.com *通信作者:徐景升，副研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事甘蔗功能基因組學(xué)研究。E-mail：xujingsheng@126.com

中圖分類號:Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A