CRISPR/Cas9介導(dǎo)靶向敲除擬南芥GGB基因突變體的鑒定

雷建峰，徐新霞，李　月，代培紅，劉　超，劉曉東*

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052；2新疆巴州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆庫爾勒841000)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)靶向敲除擬南芥GGB基因突變體的鑒定

雷建峰1，徐新霞2，李月1，代培紅1，劉超1，劉曉東1*

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊830052；2新疆巴州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，新疆庫爾勒841000)

摘要:GGB是抗旱負(fù)調(diào)控基因。為了獲得擬南芥ggb突變體材料，構(gòu)建了以擬南芥U6啟動子驅(qū)動GGB sgRNA的CRISPR/Cas9基因組編輯載體。將構(gòu)建好的編輯載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。對轉(zhuǎn)基因后代GGB基因的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在靶位點處有缺失4個堿基和增加1個T堿基的2種突變體產(chǎn)生。分別對野生型擬南芥和上述2種ggb突變體進行半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，突變體材料中幾乎檢測不到GGB基因表達(dá)，說明獲得了GGB基因敲除突變體。對野生型和ggb突變體葉片失水率、耐旱表型及單株種子量的測定結(jié)果表明，與野生型相比，擬南芥GGB基因突變后，葉片失水率顯著減少，抗旱性明顯增強，而單株種子量卻并沒有改變。研究表明，GGB是一種理想的作物分子育種的候選靶基因，獲得的突變體為今后從農(nóng)作物中克隆的GGB同源基因進行功能互補驗證提供了有用的遺傳材料。

關(guān)鍵詞:擬南芥；CRISPR/Cas9；GGB；基因敲除；失水率

蛋白異戊二烯化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種形式，具體是指把15個碳的法呢基或20個碳的香葉?；矁r連接到蛋白質(zhì)碳末端最后4個氨基酸CaaX的半胱氨酸上，其中C是半胱氨酸，a常常是脂肪族氨基酸，而X通常是甲硫氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸或半胱氨酸[1]。目前已知有3種蛋白酶復(fù)合體參與了蛋白異戊二烯化的修飾：蛋白法呢基轉(zhuǎn)移酶、Ⅰ型蛋白香葉?；D(zhuǎn)移酶和Ⅱ型蛋白香葉?；D(zhuǎn)移酶。蛋白法呢基轉(zhuǎn)移酶和Ⅰ型蛋白香葉?；D(zhuǎn)移酶都是由α和β兩個亞基組成，兩者共用同一個α亞基，但β亞基不同。在擬南芥中蛋白法呢基轉(zhuǎn)移酶的β亞基是ERA1，而Ⅰ型蛋白香葉酰基轉(zhuǎn)移酶的β亞基是GGB[1]。研究發(fā)現(xiàn)ERA1對底物蛋白的碳末端最后4個氨基酸CaaX缺乏偏好性，而GGB幾乎只異戊二烯化修飾最后一位是亮氨酸的蛋白質(zhì)，即碳末端最后4個氨基酸是CaaL的蛋白質(zhì)，尤其是對于碳末端為CaIL的蛋白質(zhì)的修飾活性最高[2]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白異戊二烯化修飾與抗旱反應(yīng)存在非常緊密的關(guān)系，擬南芥era1突變體抗旱性明顯增強[3-4]。然而era1突變體出現(xiàn)部分花敗育，而且開花時間會推遲[5]。與era1突變體相比，擬南芥ggb突變體僅在氣孔關(guān)閉上對ABA更加敏感，當(dāng)擬南芥受到干旱脅迫時，GGB基因突變后，促使植株氣孔關(guān)閉，抗旱性明顯增強。最重要的是，ggb突變體在生長發(fā)育上與野生型相比沒有明顯差異[1]，表明它可能特異性地修飾活化了ABA信號通路中的一個關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，進而負(fù)調(diào)控了ABA在氣孔關(guān)閉中的功能。

生物信息學(xué)分析顯示在水稻、玉米、棉花、番茄、馬鈴薯、葡萄等作物中均有1個拷貝的、與擬南芥GGB高度同源的基因。這些同源基因是否具有與擬南芥GGB同樣的功能，能否可以作為作物抗旱育種的一種理想靶標(biāo)基因？這需要進一步確認(rèn)這些基因的功能，而最快捷可靠的證據(jù)來自于這些同源基因是否能功能互補擬南芥ggb突變體的表型。然而由于擬南芥ggb突變體研究報道時間較久，相關(guān)突變體的種子已喪失萌發(fā)能力，因此只能通過其他途徑來獲取。

基因組編輯技術(shù)是新出現(xiàn)的一種研究基因功能的重要技術(shù)工具，它可以高效產(chǎn)生特定基因功能失活突變體，能為生物體功能基因組學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)的遺傳材料。目前它包括3種技術(shù)體系：鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)、TALE核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)，以及2013年興起的CRISPR/Cas9技術(shù)系統(tǒng)[6]。這些人工核酸酶都可以在基因組DNA特定位點上產(chǎn)生雙鏈斷裂，最后通過非同源末端連接或同源重組兩種DNA修復(fù)途徑來實現(xiàn)對雙鏈DNA斷裂點的修復(fù)。在自然狀態(tài)下，同源重組修復(fù)是一種完全修復(fù)方式，而非同源末端連接修復(fù)則是一種不完全修復(fù)方式，修復(fù)完成后其雙鏈DNA斷裂處的堿基會發(fā)生缺失或增加或改變，從而導(dǎo)致基因組序列的定點編輯[7]。ZFNs和TALENs這兩項技術(shù)在實施操作過程中技術(shù)難度較大、構(gòu)建組裝時間較長、花費較高[8]。近年來，逐漸被最新的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)所取代。CRISPR/Cas9系統(tǒng)原本是細(xì)菌在長期進化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[9-10]。2013年，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被改造成一種新的基因組定點編輯技術(shù)[11-12]。首先在基因組DNA上選擇需要改造的基因靶位點，設(shè)計構(gòu)建一段帶有靶序列的sgDNA，然后與Cas9基因一起通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在轉(zhuǎn)錄出的sgRNA的引導(dǎo)下，通過堿基互補配對，將Cas9蛋白靶向結(jié)合到基因組DNA的對應(yīng)位置上，Cas9切割目標(biāo)DNA序列產(chǎn)生雙鏈斷裂，而斷裂的DNA被非同源末端連接方式修復(fù)后最終實現(xiàn)對基因組靶目標(biāo)位點的編輯。該技術(shù)操作相對簡單，制作成本低。目前已經(jīng)在多種植物物種(如番茄、煙草、水稻、小麥和玉米等)中成功地敲除目標(biāo)基因[6,13-14]。本研究將利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，定點敲除GGB基因，獲得新的擬南芥ggb突變體，并測試其抗旱性和種子產(chǎn)量，為驗證其他作物GGB同源基因的功能提供互補轉(zhuǎn)基因的受體材料。

1材料和方法

1.1實驗材料

AtU6-26::sgRNA載體[15]、GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞、植物表達(dá)載體p1300均為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存，擬南芥Cas9表達(dá)載體[15]由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所惠贈。引物合成及測序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建基于AtGGB(At2g39550)基因組序列，查找Cas9潛在靶向位點，根據(jù)靶位點的位置和GC含量設(shè)計sgRNA(表1)。靶序列通過退火：95 ℃每5 s降低0.5 ℃至20 ℃，插入到經(jīng)BbsⅠ酶切的AtU6-26::sgRNA載體相應(yīng)的位置上，T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆測序鑒定帶有GGB靶序列的sgRNA表達(dá)載體。

表1　本研究中使用的引物序列

注： 下劃線為EcoRⅠ酶切位點

Note：Underlined sequences areEcoRⅠ restriction enzyme site

圖1　sgRNA和Cas9共表達(dá)載體Fig. 1　Construction of sgRNA and Cas9 expression vector

1.2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建采用酶切連接的方式構(gòu)建sgRNA和Cas9共表達(dá)載體，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切AtU6-26::sgRNA表達(dá)載體，回收AtU6-26::sgRNA片段(600 bp)，連接同樣經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ酶切的Cas9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定的質(zhì)粒命名為AtU6::sgRNA-Cas9(圖1)。然后將sgRNA和Cas9共表達(dá)載體構(gòu)建在植物表達(dá)載體p1300上，用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切AtU6::sgRNA-Cas9質(zhì)粒，回收目標(biāo)片段(5.9 kb)，連接同樣經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的植物表達(dá)載體p1300質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，候選的陽性克隆經(jīng)酶切鑒定正確后，取10 μL AtU6::sgRNA-Cas9-p1300質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用于下一步侵染。

1.2.3擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的帶有AtGGB靶序列的AtU6::sgRNA-Cas9-p1300農(nóng)桿菌凍存液10 μL接種于LB培養(yǎng)基(含50 μg·mL-1Kan和25 μg·mL-1Rif)中活化。28 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)20 h左右。然后按1∶100體積比將活化菌液接種到15 mL LB培養(yǎng)基中，于28 ℃，180 r/min震蕩培養(yǎng)，搖至菌液的OD600≈1.8～2.0時，4 000×g離心10 min收集菌體，棄之上清液，重懸于新鮮配制的轉(zhuǎn)化液(1/2 MS液體培養(yǎng)基含5%蔗糖，0.02% Silwet L-77)，至終濃度OD600≈0.6～0.8。采用浸花法[16]轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，待種子成熟后收獲T1代種子，干燥7 d。將T1代種子消毒處理，播種在含有30 μg·mL-1潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上，4 ℃放置72 h，然后25 ℃(16 h光培養(yǎng)，8 h暗培養(yǎng))篩選陽性苗，并統(tǒng)計陽性苗植株數(shù)量。

1.2.4擬南芥ggb突變體檢測以轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA為模板，利用 Primer 5.0軟件設(shè)計擬南芥ggb突變位點檢測引物(表1)。PCR擴增AtGGB基因，以野生型擬南芥為對照。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)后于72 ℃延伸10 min，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。對野生型和突變體PCR產(chǎn)物進行EcoRⅠ酶切鑒定，37 ℃ 3 h，對沒有消化的PCR產(chǎn)物進行回收，連接到平端載體B-Zero(Transgen)上，挑單克隆測序，測序結(jié)果與AtGGB基因的參考序列進行序列比對分析。最后，統(tǒng)計ggb突變體在所有轉(zhuǎn)化子中的突變頻率。

1.2.5AtGGB基因表達(dá)RT-PCR檢測按照ZolPlant RNA(Transgen)提取試劑盒操作步驟提取苗齡為20 d的野生型與突變體植株葉片的RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，Transgen)合成cDNA。以cDNA為模板，Actin2基因為內(nèi)參對照。采用EasyTaq酶(Transgen)擴增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。按照調(diào)整內(nèi)參基因的模板量，進行AtGGB基因靶位點目標(biāo)片段的擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。所有引物見表1。

1.2.6擬南芥離體葉片失水率測定采用稱重法[17]比較野生型擬南芥和ggb突變體植株離體葉片相對含水量差異，剪取苗齡為30 d的野生型擬南芥和ggb突變體植株地上部，分別用稱量紙進行稱重。每隔1 h稱量其鮮重測定其失水率，設(shè)置3個重復(fù)。葉片失水率(%)=(原始質(zhì)量某-時間點失水后質(zhì)量)/原始質(zhì)量×100%。數(shù)據(jù)整理與分析采用Excel 2013軟件；采用DPS v7.05軟件的LSD最小顯著差數(shù)法進行差異顯著性檢驗。

1.2.7抗旱表型鑒定及單株種子量測定將苗齡為20 d的野生型和ggb突變體植株進行干旱以及干旱后復(fù)水處理，拍照記錄處理前后表型差異，并統(tǒng)計植株存活率。另外未處理的同批長勢一致的野生型和突變體植株種子成熟后，采用稱重法測定單株種子量，設(shè)置3個重復(fù)，探究突變體種子量是否與野生型種子量存在差異。

2結(jié)果與分析

2.1AtGGB突變位點選擇

在擬南芥AtGGB基因組序列536 bp 處一個PAM(the protospacer-adjacent motif)位點前，設(shè)計了2條長為24 bp、帶有EcoRⅠ酶切位點的靶序列DNA(GATTGTCTCTGCAGGAGAATTCTA和AAACTAGAATTCTCCTGCAGAGAC)，該靶序列經(jīng)退火復(fù)性插入到經(jīng)BbsⅠ酶切的AtU6-26::sgRNA載體上(圖2)。

2.2CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建

將構(gòu)建好的帶有GGB基因靶序列的AtU6::sgRNA-Cas9的重組基因片段(5.9 kb)連入植物表達(dá)載體p1300，經(jīng)酶切鑒定，酶切結(jié)果與預(yù)期酶切片段大小相符，表明靶向敲除擬南芥GGB基因的CRISPR/Cas9基因組編輯載體已構(gòu)建成功(圖3)。

2.3Atggb突變體檢測

用30 μg·mL-1潮霉素篩選T1種子，共篩選出45個T1代轉(zhuǎn)基因株系。為了驗證構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯體系是否具有打靶效應(yīng)，能否在預(yù)期設(shè)計的靶位點處產(chǎn)生DNA序列的編輯，對野生型和轉(zhuǎn)基因T2代植株GGB基因靶序列進行了分析。結(jié)果顯示野生型的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后會產(chǎn)生528 bp和208 bp兩條帶。而在轉(zhuǎn)基因植株中如果靶序列突變發(fā)生在EcoRⅠ酶切位點處，就會導(dǎo)致EcoRⅠ酶切位點被破壞，從而EcoRⅠ無法識別和酶切目標(biāo)位點，最終保留了736 bp 的原PCR目的條帶(圖4，A)。對沒有被EcoRⅠ切斷的PCR產(chǎn)物測序。測序結(jié)果表明：在靶位點處檢測到2種能引起閱讀框改變的突變體，一種為缺失4個堿基的突變，命名為GGB:-4；另一種是增加1個T堿基的突變,命名為GGB:+T(圖4，B)。與其他類型突變體一起進行統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)生序列改變的突變植株比例為84.4%(38/45)。

M. 1 kb DNA 標(biāo)注圖3　AtU6::sgRNA-Cas9-p1300基因編輯載體的酶切鑒定M. 1 kb DNA markerFig. 3　Identification of AtU6::sgRNA-Cas9-p1300 gene editing vector by restriction enzyme digestion

淺陰影序列表示擬南芥U6啟動子；深陰影部分表示擬南芥GGB基因sgDNA序列；下劃線表示GGB基因靶序列。圖2　擬南芥U6啟動子及GGB sgDNA序列The Arabidopsis U6 promoter is highlighted in light shadow；Dark shading indicates the sgDNA scaffold for GGB；GGB target sequence is underlinedFig. 2　The Arabidopsis U6 promoter and GGB sgDNA scaffold sequence

M.1 kb DNA； A. 采用PCR/RE的方法檢測突變體(1和2泳道分別為陽性對照野生型擬南芥PCR酶切后產(chǎn)物和PCR酶切前產(chǎn)物電泳圖；3泳道為ggb突變體PCR擴增產(chǎn)物；4～10泳道分別為ggb突變體PCR酶切后產(chǎn)物)；B. 第一行為野生型擬南芥GGB基因序列，藍(lán)色序列表示帶有EcoRⅠ酶切位點的靶序列，紅色序列表示PAM位點(NGG)，字母M表示突變體，堿基的插入用‘+’號表示，堿基的缺失用‘-’號表示；C. 野生型GGB測序峰圖；D. 突變體GGB;-4測序峰圖；E. 突變體GGB，+T測序峰圖圖4　擬南芥ggb突變體檢測M:1 kb DNA Maker；A. PCR/RE assays were performed to detect mutations(Lanes 1 and 2 represent undigested and digested PCR product of wild-type Arabidopsis respectively； Lanes 3 represent PCR amplification product of the ggb mutant； Lanes 4-10 represent digested PCR products of the ggb mutations)； B. The wild-type GGB sequence is given at the above, the target sequences with EcoRⅠrestriction site highlighted in blue and the PAM (NGG) highlighted in red. M represents mutation, ‘+’ represents insertion bases, ‘-’represents deletion bases； C. The Sanger sequencing result for wild-type GGB； D. The Sanger sequencing result for GGB：-4； E. The Sanger sequencing result for GGB：+TFig. 4　Detection of Arabidopsis ggb mutants

2.4AtGGB基因表達(dá)量檢測

為了進一步檢測突變體中AtGGB基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)變化，采用半定量RT-PCR方法分析了野生型與突變體植株中AtGGB的表達(dá)水平。結(jié)果(表5)顯示，野生型材料中GGB基因表達(dá)水平較高，而2種突變體材料中幾乎檢測不到GGB的表達(dá)。

2.5Atggb突變體失水率測定

干旱是導(dǎo)致植物可利用水分虧缺的主要因素，而失水率是植株是否耐旱的重要生理指標(biāo)[18]。前人研究結(jié)果表明擬南芥ggb基因T-DNA插入純合突變體離體葉片失水率顯著低于野生型擬南芥[1]。本研究測定了新ggb突變體植株離體失水率，結(jié)果顯示，與擬南芥ggb基因T-DNA插入純合突變體的表型相似，ggb突變體失水率也顯著低于野生型擬南芥(圖6)。

2.6Atggb突變體耐旱性表型鑒定

干旱處理前，野生型擬南芥和ggb突變體植株生長發(fā)育基本一致，這與前人[1]研究結(jié)果相同。干旱處理23 d后，野生型植株開始發(fā)生萎蔫，突變體植株并沒有發(fā)生萎蔫。隨著缺水時間的延長，野生型植株逐漸干枯死亡，而突變體植株表型相對較輕。干旱處理28 d后進行土壤復(fù)水，植株存活率測定結(jié)果顯示，野生型材料由于失水過度而死亡，突變體材料復(fù)水后大多數(shù)能正常生長，GGB:-4突變體存活率為86.67%，GGB:+T突變體為51.11%(圖7)，表型上與同批處理的野生型材料差異顯著(圖8)。

圖5　AtGGB基因表達(dá)量分析Fig. 5　Expression analysis of GGB in Arabidopsis

圖6　擬南芥葉片失水率測定Fig. 6　The water loss rate of Arabidopsis leaves

不同小寫字母表示不同處理存在顯著差異(P < 0.05)圖7　復(fù)水后存活率測定Fig. 7　Determination of survival rate after rehydrationDifferent letters indicate significance differences among different treatments for the same parameter (P< 0.05)

圖9　擬南芥單株種子量測定Fig. 9　Determination of seed weight per plant in Arabidopsis

2.7Atggb突變體單株種子量測定

單株種子產(chǎn)量是評價植株生產(chǎn)能力的重要指標(biāo)。過表達(dá)的正調(diào)控基因通常會引起基因沉默或者因為異位表達(dá)而導(dǎo)致產(chǎn)量減少[19-20]。ggb抗旱性明顯增強，雖然生長發(fā)育沒有受到影響，但并不代表種子產(chǎn)量沒有變化。通過測定成熟后ggb突變體與野生型擬南芥單株種子量，結(jié)果顯示，ggb突變體植株單株種子量與野生型并沒有明顯差異，收獲的種子量基本一致。說明擬南芥GGB基因突變后，其種子產(chǎn)量并沒有受到抑制(圖9)。

3討論

干旱是限制植物生長的首要非生物脅迫因素，傳統(tǒng)的育種手段很難解決這個問題。采用轉(zhuǎn)基因方法，過量表達(dá)抗逆正調(diào)控基因是目前最經(jīng)濟有效，也是最普遍使用的抗逆育種途徑。然而在實踐過程中卻出現(xiàn)了許多問題。首先超表達(dá)的基因，由于共抑制現(xiàn)象，常常導(dǎo)致基因沉默，相關(guān)性狀不能長期穩(wěn)定遺傳[19]；其次由于這些基因異位超表達(dá)，經(jīng)常使作物正常的生長發(fā)育受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)量減少[20]。即使使用誘導(dǎo)型啟動子來驅(qū)動抗逆基因的表達(dá)，但基因沉默導(dǎo)致的遺傳穩(wěn)定性問題還依然存在。最重要的是它們所培育出的新品種都帶有轉(zhuǎn)基因成分，其所帶來的生物安全性問題極大地限制了作物新品種的市場推廣和應(yīng)用。

A.干旱處理前；B.干旱處理后；C.復(fù)水后圖8　干旱處理前后擬南芥的表型觀察A. Before the drought treatment；B. After the drought treatment；C. RehydrationFig. 8　Observation phenotype of Arabidopsis before and after drought stress treatments

在植物體內(nèi)除了目前普遍使用的抗逆正調(diào)控基因外，還存在一些負(fù)調(diào)控基因，這些基因突變，功能喪失后，植物的抗旱性也大大增強，如ERA1[3]、ABH1[21]、SAD1[22]、GGB[1]和DST[23]等，其中ERA1和GGB是參與蛋白質(zhì)異戊二烯化修飾的兩個重要基因。這種共價修飾促進了蛋白質(zhì)與膜以及蛋白與蛋白之間的互作[24]。研究發(fā)現(xiàn)era1的突變體在氣孔關(guān)閉上對ABA更加敏感，其抗旱性明顯增強[3-4]。此外在油菜和小麥上ERA1的突變都表現(xiàn)出良好的抗旱性[25-26]。另外在豌豆[27-28]和番茄[24,29]中也鑒定出上述3種參與了蛋白異戊二烯化的蛋白復(fù)合體。這表明蛋白異戊二烯化修飾可能在植物中高度保守。與era1突變體相比，ggb突變體抗旱性也明顯增強，但在生長發(fā)育上與野生型相比并沒有明顯差異[1]，因此GGB可能是作物抗逆分子育種的一種理想基因靶標(biāo)。

為了方便快捷地驗證棉花、番茄、馬鈴薯、葡萄、水稻、玉米等作物中與擬南芥GGB高度同源基因的功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，進行了靶向敲除擬南芥GGB基因的研究。結(jié)果顯示，在45株轉(zhuǎn)基因陽性植株中，出現(xiàn)GGB基因序列改變的有38株，T1代的突變效率高達(dá)84.8%，顯示出該基因編輯技術(shù)的高效性。從38株T1代中篩選獲得了2種有效的GGB基因敲除突變體，一種缺失4個堿基，另一種是增加1個T堿基，其結(jié)果都是產(chǎn)生基因移碼突變，最終導(dǎo)致功能完全喪失。功能缺失的基因，其mRNA的轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性會存在嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致mRNA水平極低。對新獲得的ggb突變體進行的半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，突變體材料中也幾乎檢測不到GGB基因的表達(dá)，結(jié)果表明新獲得的擬南芥突變體是GGB基因敲除突變體。進一步的失水率和抗旱性的測定也與GGB基因T-DNA插入突變體的檢測結(jié)果一致。GGB作為一個抗旱負(fù)調(diào)控基因要想用于農(nóng)作物分子育種，就要求它的后代相關(guān)性狀能穩(wěn)定遺傳，生長發(fā)育不會受到抑制，產(chǎn)量不減少。擬南芥ggb突變體植株單株種子量測定結(jié)果顯示，ggb突變體生長發(fā)育基本與野生型一致，收獲的種子量也與野生型材料無顯著差異。因此，GGB基因用于作物分子育種，可能也不會影響農(nóng)作物的生長發(fā)育，導(dǎo)致產(chǎn)量減少。另外正如CRISPR/Cas9技術(shù)原理所述，利用該技術(shù)系統(tǒng)可以方便地獲得任何靶基因突變的植物材料，然后通過僅僅一代雜交或自交就可以快速把轉(zhuǎn)基因成分與突變靶基因分離開，從而獲得無轉(zhuǎn)基因成分的突變新材料，而且突變基因及其相應(yīng)性狀也能夠像突變體一樣穩(wěn)定遺傳[30]。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)獲得擬南芥ggb突變體，進一步驗證了GGB可能是一種理想的作物分子育種的靶基因，為分析其它作物GGB同源基因的功能提供了理想的互補轉(zhuǎn)基因受體材料。

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(編輯:宋亞珍)

Identification ofGGBMutant Caused by CRISPR/Cas9 inArabidopsis

LEI Jianfeng1, XU Xinxia2, LI Yue1, DAI Peihong1, LIU Chao1, LIU Xiaodong1*

(1 College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Laboratory of Agricultural Biotechnology of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052，China；2 Center of Bazhou Agricultural Technology Promotion, Korla, Xinjiang 841000，China)

Abstract:GGB is a negative regulator of drought resistance. In order to obtain the Arabidopsis ggb mutant, we used AtU6 promoter to drive the expression of AtGGB sgRNA and coresponding CRISPR/Cas9 genome edting vector was constructed and was transferred into Arabidopsis by Agrobacterium-mediated floral dip. After sequencing of GGB in T2 generation, two kinds of mutants with a deletion of 4 bases and an addition of 1 base (T) were found at the target site, respectively. Semi-quantitative RT-PCR analysis results showed that the expression of GGB gene was almost not detected in the ggb mutant, which indicated that the mutants were GGB knockout lines. Through measuring the water loss rate, drought resistant and seed yield per plant, ggb mutant exhibited decreased water loss rate, improved drought resistance, but unchanged seed yield per plant compared to wild-type. Taken together, the above results indicated that GGB is an ideal candidate target gene for crop molecular breeding and ggb mutant is useful for functional complemention of GGB homologous genes cloned from crops.

Key words:Arabidopsis; CRISPR/Cas9; GGB; gene knockout; water loss rate

文章編號:1000-4025(2016)05-0857-08

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0857

收稿日期:2016-01-17;修改稿收到日期:2016-04-18

基金項目:國家自然科學(xué)基金(31470289)；新疆維吾爾自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目(XJGRI2015084)

作者簡介:雷建峰(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事棉花分子生物學(xué)研究。E-mail：15299175640@163.com *通信作者:劉曉東，博士(后)，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail：xiaodongliu75@aliyun.com

中圖分類號:Q781;Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A