鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的工藝優(yōu)化

張強(qiáng)，薄 惠，邢建華，王高峰

（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河南鄭州450063）

鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的工藝優(yōu)化

張強(qiáng)，薄 惠，邢建華，王高峰

（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，河南鄭州450063）

為提高鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的產(chǎn)量，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖16g／100mL、蛋白胨0.25g／100mL、酵母粉1.0g／100mL、乙酸鈉0.3g／100mL、K2HPO40.1g／100mL、吐溫－80 0.1g／100mL、MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最適發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間72h，接種量10%，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。以該培養(yǎng)基為最適L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，在搖瓶水平上的L－乳酸產(chǎn)量為120g／L。進(jìn)行5L發(fā)酵罐上罐發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸，產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)－乳酸的轉(zhuǎn)化率為85.56%，L－乳酸的光學(xué)純度為95.39%。

鼠李糖乳桿菌；發(fā)酵；L－乳酸；優(yōu)化

乳酸按其旋光性可分為D－乳酸、L－乳酸和DL－乳酸，是一種重要的有機(jī)酸［1－2］。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和環(huán)保等行業(yè)［3］。L－乳酸（L－lactic acid）是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于生產(chǎn)紅霉素林格氏液用于輸液。其中，L乳酸鈣、L乳酸鈉、L乳酸鋅和L乳酸亞鐵等藥物是補(bǔ)充金屬元素的良好藥品［4］。同時(shí)，L－乳酸還可用作手術(shù)室、病房和實(shí)驗(yàn)室等殺菌消毒［4］。由于人體只能利用L－乳酸，且我國(guó)在L－乳酸的產(chǎn)量和質(zhì)量上不能滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的需求，產(chǎn)品多為消旋的DL－乳酸，因此研究生產(chǎn)L－乳酸替代D－乳酸和DL－乳酸有著現(xiàn)實(shí)的意義和應(yīng)用前景［5－7］。

張為巍等［8］對(duì)篩選得到的野生型鼠李糖乳桿菌CLRID10通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的L－乳酸產(chǎn)量達(dá)104.40g／L，吳暉等［9］通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的L－乳酸產(chǎn)量達(dá)143.6g／L，但其研究均是在搖瓶水平上進(jìn)行，沒有通過(guò)發(fā)酵罐放大進(jìn)行L－乳酸發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)化，也沒有對(duì)L－乳酸的光學(xué)純度進(jìn)行分析。為此，筆者對(duì)野生型的鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵罐放大和L－乳酸光學(xué)純度進(jìn)行分析，以期為L(zhǎng)－乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）ZQ－55由黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心篩選、選育并保藏。

1.1.2 試劑 葡萄糖、碳酸鈣、吐溫－80、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)），蛋白胨、酵母粉（英國(guó)OXOID公司），MRS肉湯（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），L－乳酸（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）。

1.1.3 儀器DU730型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Beckman公司），ZHWY－1102C雙層小容量恒溫?fù)u床（上海智誠(chéng)公司），SW－CJ－1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司），SBA－40D生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所），BLBIO－5SJA型5L自動(dòng)發(fā)酵罐（上海百倫科技），GSP－9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 菌種培養(yǎng)

將甘油管內(nèi)的菌種溶解后接入100mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)活化后，接種至100mL裝液量的L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150r／min恒溫震蕩培養(yǎng)。

1.3 單因素試驗(yàn)考察

單因素試驗(yàn)時(shí)，依次改變K2HPO4的添加量（0.1g／L、0.2g／L、0.3g／L、0.4g／L和0.5g／L）、不同的初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同的接種量（2.5mL／100mL、5.0mL／100mL、7.5mL／100mL、10.0mL／100mL、12.5mL／100mL、15.0mL／100mL、17.5mL／100mL和20.0mL／100mL）、不同的發(fā)酵時(shí)間（1d、2d、3d、4d、5d、6d 和7d）以及不同的中和劑（氫氧化鈣、碳酸鈣、氨水和碳酸氫鈉），以L－乳酸產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，所有的梯度都設(shè)置3個(gè)平行的搖瓶試驗(yàn)，然后取其平均值作為試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。

1.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)4因素3水平的正交試驗(yàn)［10－11］，考察L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、乙酸鈉、蛋白胨和酵母粉確定各組分的最佳用量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平見表1。以優(yōu)化后的最佳L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的過(guò)程中，每隔2h取樣1次，分別測(cè)定殘?zhí)橇?、L－乳酸產(chǎn)量和菌體OD600值，發(fā)酵72h結(jié)束。

表1 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal test of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid g／100mL

1.5 菌體OD值的測(cè)定

移取100μL發(fā)酵液稀釋至500倍，通過(guò)利用紫外分光光度計(jì)在600nm處測(cè)定菌體吸光度值。菌體的OD600值為OD600×稀釋倍數(shù)。

1.6 L－乳酸的測(cè)定與分析

取100μL的發(fā)酵液稀釋至400倍，8 000r／min離心1min，利用生物傳感分析儀測(cè)定L－乳酸的產(chǎn)量。乳酸的光學(xué)純度采用手性分離色譜柱，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定。首先移取150μL的L－乳酸發(fā)酵液稀釋至100倍，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾，L－乳酸光學(xué)純度的分析測(cè)定條件設(shè)定：Chiralpak AD型手性異構(gòu)分離柱，流動(dòng)相為2mmol／L CuSO45%異丙醇，流速為1mL／min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm，柱溫為30℃［12］。

1.7 5L發(fā)酵罐試驗(yàn)

以優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配置5L發(fā)酵罐的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始裝液量為2.5L。初始葡萄糖濃度為160g／L，發(fā)酵到50h時(shí)添加140g質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的葡萄糖溶液，pH用50%的NaOH溶液調(diào)節(jié)，pH調(diào)節(jié)采用發(fā)酵罐自動(dòng)控制，低于4.5時(shí)自動(dòng)添加堿以調(diào)節(jié)pH，吐溫－80作為緩沖劑時(shí)，要添加消泡劑，發(fā)酵過(guò)程中通高純氮?dú)猓员ＷC嚴(yán)格厭氧發(fā)酵。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)都進(jìn)行3次重復(fù)，然后取其平均值作為測(cè)定結(jié)果值，平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差分析用Microsoft Excel 2007軟件處理。圖形的繪制由Origin 7.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)后完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素下L－乳酸的產(chǎn)量

從圖1可知，不同發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH、中和劑及K2HPO4添加量的L－乳酸產(chǎn)量變化。

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間 發(fā)酵時(shí)間低于3d時(shí)，L－乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)3d時(shí)，L－乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低?？赡苁前l(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，菌體死亡率加大，導(dǎo)致微生物代謝能力降低，也可能是發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已接近消耗殆盡［13］，這時(shí)菌體利用代謝產(chǎn)物L(fēng)－乳酸來(lái)維持基本生命的活動(dòng)，最終導(dǎo)致L－乳酸產(chǎn)量降低。

2.1.2 接種量L－乳酸產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，當(dāng)達(dá)到10mL時(shí)L－乳酸產(chǎn)量最大，為136g／L，而后隨著接種量的增加L－乳酸產(chǎn)量反而降低。當(dāng)接種量在5～10mL時(shí)對(duì)L－乳酸產(chǎn)量影響較小，當(dāng)大于10mL時(shí)，隨著接種量的增加L－乳酸產(chǎn)量降低，原因可能是接種量太大時(shí)，會(huì)使發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)成分不夠菌體生長(zhǎng)與發(fā)酵，導(dǎo)致菌體死亡率增加，最終使L－乳酸產(chǎn)量降低［14］。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH、中和劑和K2HPO4添加量的L－乳酸產(chǎn)量Fig.1 L－Lactic acid production of different fermentation time，inoculum size，initial pH，neutralization agent and K2HPO4

2.1.3 不同初始pH pH是影響發(fā)酵的重要因素之一，控制好pH使其處在適合菌體生長(zhǎng)代謝的最佳pH范圍［12］。當(dāng)起始pH低于7.0或高于7.0時(shí)，L－乳酸產(chǎn)量都較低，當(dāng)起始pH控制在7.0時(shí)L－乳酸產(chǎn)量最高。這可能是當(dāng)起始pH較低或較高時(shí)都會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響，可能會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)代謝生產(chǎn)L－乳酸［12，16］。由此得出發(fā)酵的起始pH 為7時(shí)最佳。

2.1.4 不同中和劑 由于乳酸發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了大量的酸，使得發(fā)酵液的pH不斷降低，當(dāng)發(fā)酵液的pH降到一定程度時(shí)不利于菌體的生長(zhǎng)和代謝生產(chǎn)L－乳酸。所以，需在發(fā)酵液中加入中和劑，以此來(lái)中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸［15］，使乳酸形成乳酸鹽溶解于發(fā)酵液中，這樣能夠不斷地緩沖發(fā)酵液pH的降低，從而有利于發(fā)酵液維持在適合菌體生長(zhǎng)代謝的pH環(huán)境中。當(dāng)中和劑選擇碳酸鈣時(shí)，L－乳酸的產(chǎn)量最高，而其他中和劑雖然能中和掉發(fā)酵液中的乳酸，但是這些中和劑溶解后都具有堿性，都會(huì)使溶液的pH大于7.0，而堿性環(huán)境不利于菌體的生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致菌體大量死亡，所以其他的中和劑不適合在搖瓶水平上作為中和劑來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵的pH并中和乳酸。

2.1.5 K2HPO4添加量 當(dāng)K2HPO4添加量為1g／L時(shí)，L－乳酸的產(chǎn)量最高，當(dāng)K2HPO4添加量超過(guò)2g／L時(shí)，L－乳酸產(chǎn)量不斷降低，可能是菌體在培養(yǎng)的過(guò)程中，一定范圍內(nèi)添加量的K2HPO4有助于菌體代謝生產(chǎn)乳酸，K2HPO4添加過(guò)量時(shí)不利于菌體進(jìn)行乳酸發(fā)酵［16－17］。

2.2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的最佳發(fā)酵工藝

由表2可知，正交試驗(yàn)各處理L－乳酸產(chǎn)量。對(duì)其進(jìn)行極差分析，4因素對(duì)L－乳酸含量的影響依次為D＞C＞A＞B，即酵母粉＞蛋白胨＞葡萄糖＞乙酸鈉，酵母粉對(duì)乳酸產(chǎn)量影響最大。培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B2C1D2，即葡萄糖16g，乙酸鈉0.3g，蛋白胨0.25g，酵母粉1.0g。

通過(guò)單因素和正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳的L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸鈉0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐溫－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。發(fā)酵時(shí)間72h，接種量10%，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。以該培養(yǎng)基為最適L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，L－乳酸產(chǎn)量為120g／L，是優(yōu)化前的1.85倍，表明確定的培養(yǎng)基組分和各組分添加量較為合適。

2.3 發(fā)酵罐上罐試驗(yàn)結(jié)果

從圖2可知，發(fā)酵結(jié)束后L－乳酸產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)－乳酸的轉(zhuǎn)化率為85.56%。對(duì)5L發(fā)酵罐放大發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行L－乳酸的光學(xué)純度分析發(fā)現(xiàn)（圖3），L－乳酸出峰時(shí)間為7.579min，峰面積為7922 239，D－乳酸的出峰時(shí)間為9.714，峰面積為382 704。經(jīng)計(jì)算，L－乳酸的光學(xué)純度為95.39%，比優(yōu)化前提高5.01%，同時(shí)優(yōu)化后的L－乳酸光學(xué)純度接近于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的L－乳酸的光學(xué)純度96%［12］。

表2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium optimization of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid

圖2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55在5L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中的物質(zhì)變化Fig.2 Material change of L.rhamnosus ZQ－55in the fermentation process in the 5Ltank

圖3 乳酸的光學(xué)純度色譜圖Fig.3 Chromatogram of the optical purity of lactic acid

3 結(jié)論與討論

采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)野生型鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基為葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸鈉0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐溫－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間72h，接種量10%，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行L－乳酸的發(fā)酵條件放大試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后L－乳酸產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)－乳酸的轉(zhuǎn)化率為85.56%，L－乳酸的光學(xué)純度為95.39%。

試驗(yàn)的突破性在于利用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，在搖瓶水平上，L－乳酸產(chǎn)量達(dá)到120g／L，是優(yōu)化前的1.84倍。同時(shí)，通過(guò)5L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵試驗(yàn)，優(yōu)化出鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵罐放大發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的最適工藝參數(shù)，L－乳酸的光學(xué)純度達(dá)95.39%，接近于相關(guān)文獻(xiàn)［12］報(bào)道的L－乳酸的光學(xué)純度96%，該結(jié)果具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐指導(dǎo)意義，也說(shuō)明該菌株具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Optimization of L－lactic Acid Fermentation Conditions by Lactobacillus rhamnosus ZQ－55

ZHANG Qiang，BO Hui，XING Jianhua，WANG Gaofeng
（Experimental Center of Medical College，Huanghe University of Science and Technology，Zhengzhou，Henan450063，China）

To improve the L－lactic acid production by the L.rhamnosus ZQ－55，single factor experiments and orthogonal tests were used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of L.rhamnosus ZQ－55.The results showed that the optimum fermentation medium for L.rhamnosus ZQ－55was determined as follows：glucose 16g／100mL，peptone 0.25g／100mL，yeast extract 1.0g／100mL，sodium acetate 0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，Tween－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL.Optimal fermentation conditions were as follows：inoculum size 10%，rotation speed was 150r／min，the fermentation was performed at 37℃for 72h，the medium volume was 100mL，CaCO3（10g／100mL）was used to control the pH value.Under the optimized conditions in flask fermentation，the L－lactic acid production was improved to 120g／L.Finally，fed－batch lactate fermentation by L.rhamnosus ZQ－55 was tested in 5－L fermenter，after 72hfed－batch fermentation，L.rhamnosus ZQ－55produced up to 160.5g／L L－lactic acid，with the yield of 85.56%（g L－lactic acid／g glucose），the productivity of 2.23g／（L·h），the optical purity of L－lactic acid was improved to 95.39%.

Lactobacillus rhamnosus；fermentation；L－lactic acid；optimization

Q939.99

A

1001－3601（2016）08－0355－0122－05

2016－01－09；2016－07－05修回

張 強(qiáng)（1980－），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事微生物制藥工作。E－mail：2977331501＠qq.com