酶法制備馬里蘭煙浸膏的工藝優(yōu)化及其香味成分分析

許春平，曾 穎，申屠洪釬，鄭 凱

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.四川中煙工業(yè)有限責任公司技術研發(fā)中心，四川成都610060；3.河南中煙工業(yè)有限責任公司許昌卷煙廠，河南許昌461000）

酶法制備馬里蘭煙浸膏的工藝優(yōu)化及其香味成分分析

許春平1，曾 穎1，申屠洪釬2，鄭 凱3＊

（1.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2.四川中煙工業(yè)有限責任公司技術研發(fā)中心，四川成都610060；3.河南中煙工業(yè)有限責任公司許昌卷煙廠，河南許昌461000）

為獲得優(yōu)質馬里蘭煙浸膏，采用酶法制備浸膏，并對制備工藝進行優(yōu)化得到最佳提取條件，最后對最優(yōu)條件下制備的浸膏進行香味成分分析，并與非酶解浸膏進行對比。結果表明：馬里蘭煙浸膏的最優(yōu)制備工藝為果膠酶∶纖維素酶＝1∶1，pH為5，溫度為48℃，液料比為9∶1，該條件下，浸膏得率為31.03%。與非酶方法相比，采用酶解的方法浸膏得率提高13.53%；酶解方法與非酶方法相比，馬里蘭煙浸膏的揮發(fā)性香味物質種類從16種增加到23種；香味成分中如苯甲醇、苯乙酸、β－大馬烯酮含量增加，分別提高27.64%，69.68%和97.35%；且浸膏中不再檢出煙堿。

馬里蘭煙；浸膏；酶法；香味成分；GC／MS

馬里蘭煙是一種淡色晾煙，填充能力強，陰燃性好，具有特征香氣的煙草類型［1－2］。其焦油和煙堿含量較低，香氣濃郁，吸味純正，既是混合型卷煙的原料之一，也是多種煙制品的調味型原料［3］。近年來，隨著馬里蘭煙的種植增加，相應廢次煙葉的量也有所上升，如何利用廢次馬里蘭煙煙葉已經成為一個急待解決的問題。

植物細胞壁主要由纖維素和果膠質組成，其在植物浸膏制備過程中阻礙其中香味物質等向細胞外擴散，如用相應的酶將其水解，能夠提高浸膏得率，且由于酶具有專一性，不會破壞浸膏中原有的成分［4］。酶解提取天然組分的方法在植物中應用較多，劉曉光等［5］運用酶解法提取山楂果黃酮，而且保證了黃酮類化合物的活性。龐登紅等［6］應用蛋白酶處理制備出特色浸膏，其蛋白質含量較低，小分子香味成分增加。目前，針對香料煙和烤煙浸膏的研究較多，且大都采用物理制備的方法［6－7］。馬里蘭煙浸膏以及酶解制備的研究較少，應用生物技術從廢次馬里蘭煙煙葉制備馬里蘭煙浸膏，作為一種煙用香料，既可以豐富卷煙香氣類型，也可以變廢為寶。試驗以馬里蘭煙煙葉為原料，酶解輔助浸膏的制備，增加浸膏的得率，對其工藝進行優(yōu)化，并對未酶解和酶解制備浸膏的揮發(fā)性成分進行GC／MS對比分析，進一步說明酶解對浸膏制備的作用，以及其在卷煙加香中的可行性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙葉：廢次馬里蘭煙煙葉（Md609，產地：湖北宜昌）。

試劑：果膠酶200 000U／g（江蘇瑞陽生物科技有限公司），纖維素酶500 000U／g（江蘇瑞陽生物科技有限公司），半纖維素酶200 000U／g（江蘇瑞陽生物科技有限公司），二氯甲烷（天津市富宇精細化工有限公司），分析純。

儀器：Q－100A3高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司），BS200S型電子分析天平（德國賽多利斯公司），RE－52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），6890／5973氣相色譜／質譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 原料預處理

將馬里蘭煙于50℃烘箱中烘干水分，將干燥后的煙葉打粉，放置于干燥器中備用。

1.3 馬里蘭煙煙葉浸膏制備及得率計算

馬里蘭煙煙葉浸膏制備工藝根據(jù)趙銘欽等［7］的方法進行改進。具體流程：取50g馬里蘭煙煙葉末，按比例加入水，攪拌均勻，調pH后再加入酶，水浴處理4h，然后3 000r／min離心10min，取上清液用1mol／L H2SO4將pH值調到3.0，酸化90min，離心取上清，旋轉蒸發(fā)濃縮，再加入3倍體積乙醇進行沉淀過濾，最后回收乙醇，得到浸膏，將浸膏放入40℃烘箱中烘干其中溶劑，3次稱量結果不變，則為浸膏干重（圖1）。

浸膏得率＝浸膏干重／煙末質量×100%

圖1 馬里蘭煙浸膏制備工藝流程Fig.1 Process flow diagram of Maryland tobacco concrete preparation

1.4 酶法制備馬里蘭煙浸膏的單因素試驗

試驗對酶種類、加酶量、液料比、pH、提取溫度、提取時間以浸膏得率為試驗指標進行單因素試驗。

酶的初篩：試驗因素中酶種類取空白（非酶方法）、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶∶纖維素酶＝1∶1、果膠酶∶纖維素酶∶半纖維素酶＝1∶1∶1共6個加酶條件，按加酶量4%，液料比10∶1（mL∶g，下同），pH 5.5，提取4h進行試驗，得出得率最高的酶種類。

液料比、pH、提取溫度、提取時間和加酶量5個因素進行試驗時，以果膠酶∶纖維素酶＝1∶1，根據(jù)預試驗結果設計各因素水平分別為液料比6∶1、8∶1、10∶1和12∶1，pH為4.0、5.0、6.0和7.0，提取溫度為30℃、40℃、50℃和60℃，提取時間為1h、2h、4h和8h，加酶量為3%、4%、5%和6%，其他試驗條件同上，從而確定最優(yōu)條件。

1.5 酶法制備馬里蘭煙浸膏的響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選取pH、溫度和液料比3個對浸膏得率有顯著影響的因素，利用Design Expert軟件根據(jù)響應面Box－Behnken Design （BBD）方法設計3因素3水平試驗（表1），優(yōu)化試驗條件。

表1 酶法制備馬里蘭煙煙葉浸膏的響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology of preparation process of Maryland tobacco concrete by enzyme method

1.6 回歸方程的建立

利用Design Expert軟件對響應面試驗中的響應值進行二元回歸擬合分析與方差分析，建立回歸方程。

1.7 馬里蘭煙煙葉粉及制備浸膏的GC－MS分析

取未酶解的馬里蘭煙煙葉浸膏8.57g（含水率29%）放入同時蒸餾萃取樣品燒瓶中，用100mL水溶解，加入10g氯化鈉，取50mL二氯甲烷為溶劑到另一小瓶進行同時蒸餾萃取，萃取時間為2.5h，萃取結束后，將裝有二氯甲烷的小瓶中加入3～5g無水硫酸鈉靜置12h，過濾，加入1mL的內標物（0.821 1mg／mL乙酸苯乙酯），將溶液濃縮至1～2mL，過膜（0.22μm），轉移到色譜瓶中，記為浸膏1；取酶解的（果膠酶∶纖維素酶＝1∶1）馬里蘭煙浸膏樣品10.29g（含水率為28%），方法同上，記為浸膏2，用GC－MS對其進行檢測分析。將其中匹配度大于80%的化合物列于表中，并計算各成分含量。對其中所含揮發(fā)性香味物質進行比較［9］。

GC－MS分析條件［8］：色譜柱，HP－5MS毛細管柱（30m×0.25mm×1μm）；進樣口溫度：280℃，程序升溫：初始溫度50℃維持2min，然后以2℃／min的速度升至280℃，在280℃保持117min；載氣：He，1mL／min；分流比3∶1；MS分析條件：電離方式EI源，傳輸線溫度280℃，電離能量70eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度160℃，質量掃描范圍45～500aum；檢索譜庫：NIST05庫。用乙酸苯乙酯作為內標對各種物質進行定量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

組間差異比較采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件的S－N－K檢驗完成，顯著性水平為P＜0.05，相同字母之間表示差異不顯著，不同字母之間表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同因素對馬里蘭煙煙葉浸膏得率的影響

2.1.1 酶種類 從表2可知，添加酶能提高馬里蘭煙煙葉浸膏的得率。而不同酶對浸膏得率的影響也不同，其中單獨使用半纖維素酶對浸膏的得率最小，果膠酶∶纖維素酶為1∶1的浸膏得率最高。原因可能是半纖維素酶對于細胞壁的降解效果不如果膠酶和纖維素酶，故最后得到的浸膏較少。

2.1.2 加酶量 從圖2a可知，當果膠酶∶纖維素酶＝1∶1加入時，加酶量的增加能提高浸膏得率，但并不是一直呈上升趨勢，加酶量達4%后，再增加加酶量對浸膏得率的增加不顯著，選取4%的加酶量既能獲得更大的得率也能節(jié)約成本。

表2 不同酶種類的馬里蘭煙煙葉浸膏得率Table 2 Maryland tobacco concrete yield made by different enzyme types

2.1.3 液料比 從圖2b可知，隨著液料比的增大，浸膏得率顯著增大，但是液料比過大反而不利于浸膏的制備，在液料比為10∶1左右時得率更高，液料比為12∶1時可能由于稀釋作用，導致得率有所降低。

2.1.4 pH從圖2c可知，pH過高或過低都對浸膏的制備有不利影響，在pH＝5左右時，浸膏的得率最高。結合酶解過程分析，原因可能是因為pH對酶活產生較大影響，從而間接影響浸膏的制備。

2.1.5 提取溫度 從圖2d可知，提取溫度對浸膏得率的影響與pH相似，呈現(xiàn)出拋物線形，在50℃左右達最佳，原因是受到酶活性的影響，在50℃時，酶活較高，有利于煙葉細胞內物質的溶出；此外，溫度的增加能增大物質的擴散速度，達到一定的溫度時，再增加溫度對擴散速度的影響較小。

圖2 不同加酶量、液料比、pH、提取溫度和提取時間的馬里蘭煙煙葉浸膏得率Fig.2 Yield of Maryland tobacco concrete with different enzyme concentration，liquid－solid ratio，pH，extraction temperature and time

2.1.6 提取時間 從圖2e可知，隨著時間的延長，能夠得到的浸膏越多，但達到一定的時間后，再增加溫度浸膏得率的增加不大。原因可能是時間的延長有利于物料在溶液中充分的溶出、擴散，以及酶解反應的充分進行，從而使浸膏得率增加。

2.2 酶法制備馬里蘭煙煙葉浸膏的工藝優(yōu)化

由表3可知，經響應面試驗得到馬里蘭煙浸膏得率的回歸方程：

y＝30.85＋3.31A－1.22B－0.65C－0.045AB－ 0.095AC＋0.16BC－5.52A2－3.53B2－2.19C2，對該模型進行方差分析，該模型P＜0.001，為極顯著。而失擬項為不顯著（P＞0.05），也就是不確定因素對模型的干擾小，而該模型的擬合效果好，可以利用模型對試驗結果進行分析及預測。同時，一次項中A、B、C和二次項A2、B2、C2對于浸膏得率的影響極顯著，而AB、AC、BC間的交互作用對于得率的影響不顯著。

表3 酶法制備馬里蘭煙煙葉浸膏的響應面試驗結果Table 3 Result of response surface mythology of preparation process of Maryland tobacco concrete by enzymatic

由響應面優(yōu)化方程可以得到最優(yōu)的試驗條件為pH 5.3，溫度48.21℃，液料比9.28∶1，在此條件下得到響應值（y）浸膏得率的最大值，預測值為31.51%。為便于操作，設置pH 5，溫度為48℃，液料比為9∶1進行試驗，從而得到浸膏得率為31.03%，接近于預測值；與上述酶篩選試驗中，果膠酶∶纖維素酶＝1∶1、加酶量4%、液料比10∶1、pH5.5、提取4h組進行比較，差異不顯著；與酶篩選試驗中傳統(tǒng)的非酶處理方法相比差異顯著，并使浸膏得率增加了13.53%。由此，說明模型的預測可行。

2.3 馬里蘭煙煙葉浸膏的GC－MS分析

從表4可知，未酶解馬里蘭煙煙液浸膏（浸膏1）中有揮發(fā)性香味成分16種，酶解（浸膏2）的揮發(fā)性香味成分增加到23種。制備的未酶解和酶解的馬里蘭煙煙葉浸膏都含有多種特征揮發(fā)性香味成分［1012］，但未檢測到煙堿，說明浸膏作為香料進行添加并不會增加配方中煙堿的含量，從而保證卷煙的安全性。

表4 馬里蘭煙煙葉非酶解浸膏與酶解浸膏的揮發(fā)性香味成分Table 4 Volatile flavor components of Maryland tobacco concretes by non－enzymatic and enzymatic hydrolysis μg／g

酶解浸膏有13種揮發(fā)性香味成分的量高于未酶解浸膏，其中酶解浸膏中苯甲醇、苯乙酸和β－大馬烯酮含量增加，分別提高27.64%，69.68%和97.35%；酶解浸膏的揮發(fā)性香味成分中有7種在未酶解浸膏中未檢測到，分別是糠醇、丙二酸二乙酯、3－乙酰基吡啶、苯乙酸乙酯、丁位壬內酯、別香橙烯和石竹烯。其中，糠醇具有椰子與焦土豆的香氣［13］；丙二酸二乙酯可以作為一種食用香料用于配制梨、蘋果、葡萄、櫻桃等水果型香精［14］；3－乙?；拎こ驶ㄉ蛨怨葡銡?，似爆玉米花的香氣，有甜味［15］；苯乙酸乙酯有濃烈而甜的蜂蜜香氣［16］；丁位壬內酯具有的堅果、牛奶、奶油和椰子樣氣味［17］。從而使酶解浸膏的香氣更加豐富。也進一步說明酶解對于馬里蘭煙煙葉浸膏的制備有效，可以增加其香味物質的種類和含量。

3 結論

試驗采用酶解方法增加馬里蘭煙煙葉浸膏的得率，通過單因素試驗考察酶種類、加酶量、液料比、pH、提取溫度和提取時間6個因素對于浸膏得率的影響，從而得出大致規(guī)律。再設計響應面試驗優(yōu)化工藝條件，其最佳的制備條件為果膠酶∶纖維素酶＝1∶1，pH 5，溫度為48℃，液料比為9∶1，該條件下的馬里蘭煙煙葉浸膏得率為31.03%，比傳統(tǒng)的非酶方法提高13.53%。

對得到的未酶解和酶解（果膠酶∶纖維素酶＝1∶1）的馬里蘭煙煙葉浸膏分別進行GC－MS分析表明，揮發(fā)性香味成分在未酶解浸膏中有16種，酶解浸膏中有23種，酶解制備浸膏與非酶解方法相比揮發(fā)性香味成分增加了7種，13種成分的含量有所增加。說明酶解是一種比較好的制備煙草浸膏的方法。

［1］張國平，劉圣高，文光紅，等.不同收晾方式對馬里蘭煙品質的影響［J］.貴州農業(yè)科學，2015，42（1）：31－34.

［2］蔣予恩，戴培剛，趙傳良，等.開發(fā)馬里蘭煙促進低焦油卷煙發(fā)展［J］.中國煙草科學，2000（2）：53－54.

［3］程偉隆，江振聲，蔣德祥，等.馬里蘭煙葉提取物的制備與應用［J］.煙草科技，2003（1）：14－16.

［4］凌 軍，楊艷梅，王紹坤，等.酶法提取制備煙草浸膏工藝優(yōu)化［J］.河南農業(yè)科學，2015（1）：154－159.

［5］劉曉光，毛 波，胡立新.酶解法提取山楂黃酮的工藝［J］.食品研究與開發(fā)，2010（8）：56－59.

［6］龐登紅，李 丹，熊國璽，等.酶法處理煙葉碎片制備煙草浸膏［J］.江南大學學報：自然科學版，2009，（5）：607－612.

［7］趙銘欽，韓富根，董志堅，等.香料煙浸膏提取工藝條件研究［J］.煙草科技，1999（3）：11－13.

［8］謝劍平，趙明月，吳 鳴，等.白肋煙重要香味物質組成的研究［J］.煙草科技，2002（10）：3－16.

［9］趙銘欽，韓富根，邵惠芳，等.香料煙浸膏香氣物質成分研究［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2005（6）：23－26.

［10］謝劍平.煙草香原料［M］.北京：科學出版社，2009.

［11］趙銘欽.卷煙調香學［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2008.

［12］Schumacher J N.Flavor Composition of Maryland Tobacco［J］.Beitrage Zur Tabakforschung International，1984，12（5）：271－278.

［13］毛多斌.卷煙香味化學［M］.河南：河南科學技術出版社，1994.

［14］宋偉紅，姜玄珍.丙二酸二乙酯的合成進展［J］.精細化工中間體，2004（4）：15－17.

［15］劉曉君.炒籽對花生油風味和品質的影響［D］.無錫：江南大學，2011.

［16］柳 軍.口子窖和劍南春白酒香氣物質研究［D］.無錫：江南大學，2008.

［17］賀紅軍，鄒 慧，孫 寧，等.紫薯酸奶和普通酸奶揮發(fā)性風味物質差異性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2014 （8）：225－230.

（責任編輯：孫小嵐）

Enzymatic Preparation and Flavor Components Analysis of Maryland Tobacco Concrete

XU Chunping1，ZENG Ying1，SHENTU Hongqian2，ZHENG Kai3＊
（1.College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan450002；2.Technical Center of China Tobacco Sichuan Industrial Co.Ltd，Chengdu，Sichuan 610060；3.Xuchang Cigarette Factory，China Tobacco Henan Industrial Co.Ltd，Xuchang，Henan 461000，China）

To obtain the Maryland tobacco concrete with good quality，in this paper，the tobacco concrete was made by enzymatic method，and the extraction procedure was optimized and flavor components of tobacco concrete was analyzed.Results：The optimized conditions included pectinuse∶cellulase＝1∶1，pH 5，temperature 48℃，liquid－solid ratio 9∶1，and the concrete yield reached 31.03%.Compared with the non－enzymatic method，the yield of enzymolysis method was increased by 13.53%.Compared with the non－enzymatic method，the number of volatile flavor compounds prepared by enzymolysis method was increased from 16to 23.The contents of aroma components such as benzyl alcohol，benzeneacetic acid andβ－Damascenone were increased by 27.64%，69.68%and 97.35%，respectively，and no nicotine was detected in the concrete.

Maryland tobacco；concrete；enzymatic method；flavor components；GC／MS

TS49

A

1001－3601（2016）08－0354－0117－05

2015－12－25；2016－07－31修回

鄭州市科技局科技攻關項目“利用低次煙葉制備煙用香料的研究”（10PTGG339－2）

許春平（1977－），男，教授，從事煙草生物技術研究。E－mail：c.p，xu＠zzuli.edu.cn

＊通訊作者：E－mail：18822762＠qq.com