條葉百合的離體多倍體誘導(dǎo)

吳雪娟，楊利平，陳 敏

（長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100）

條葉百合的離體多倍體誘導(dǎo)

吳雪娟，楊利平＊，陳 敏

（長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶408100）

為增強(qiáng)條葉百合的抗性，對(duì)其進(jìn)行多倍體改良，利用不同濃度的秋水仙素附加2.00%二甲亞砜誘變離體培養(yǎng)條葉百合小鱗莖。結(jié)果表明：0.10%的秋水仙素溶液誘導(dǎo)效果好，直徑1.4cm鱗莖變異率達(dá)100%，直徑0.7cm鱗莖變異率達(dá)92%。經(jīng)對(duì)4株疑似多倍體誘變株系的染色體檢測(cè)，僅有1個(gè)變異株系中含有48條染色體，4倍體細(xì)胞占63%，對(duì)其切割分離和純化培養(yǎng)，最終獲得1個(gè)四倍體株系（2n＝4x＝48）。除觀察到正常的染色體外，株系1、株系3和株系4約30%左右的細(xì)胞中含有數(shù)目不等的B染色體。

條葉百合；多倍體；秋水仙素；染色體；B染色體

條葉百合（Lilium callosum）為百合科多年生球根植物，其分布較廣，從我國的東北到臺(tái)灣都有標(biāo)本采集記載，但因自然選擇、生態(tài)環(huán)境破壞及掠奪性采挖等因素，在其原產(chǎn)地已很難查詢［1］。至今，條葉百合在某些原產(chǎn)地仍處于天然野生狀態(tài)。條葉百合具有耐寒、耐旱、稍耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)和病蟲害少等優(yōu)點(diǎn)，可作為親本用于百合的抗性育種。此外，條葉百合花小，是理想的花境材料和“迷你型”花卉素材，主要可以應(yīng)用于花境栽培或庭院栽培［2］。但條葉百合的莖稈纖細(xì)，易倒伏，故迫切需要對(duì)其進(jìn)行育種改良。關(guān)于條葉百合的種子萌發(fā)，高效快速組織培養(yǎng)繁殖體系建立和以條葉百合為親本的雜交育種等已有研究報(bào)道［3－6］，但未見條葉百合的多倍體誘變育種的研究報(bào)道。

通常認(rèn)為，多倍體植株具有粗大性外，適應(yīng)性增強(qiáng)，觀賞性提高，對(duì)新品種選育有重要意義。野生百合資源的化學(xué)誘變已有報(bào)道，其中多用秋水仙素為誘變劑并取得較好結(jié)果。如用秋水仙素采用浸泡法和混培法對(duì)我國特有的青島百合（L.tsingtauense）進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，誘導(dǎo)頻率高達(dá)53.3%［7］；用秋水仙素浸泡細(xì)葉百合（L.pumilum）種子，變異率達(dá)30%［8］；用0.15%秋水仙素附加2.00%二甲亞砜誘變離體培養(yǎng)的卷丹（L.lancifolium）小鱗莖，變異率達(dá)54.29%［9］。筆者以條葉百合鱗莖為試驗(yàn)材料，利用秋水仙素為誘變劑進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，以獲得條葉百合多倍體的幼苗，為其開發(fā)利用提供新的種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

以條葉百合的鱗莖為試驗(yàn)材料，采自黑龍江省齊齊哈爾市。

1.2 無菌苗的獲得

無菌苗參照文獻(xiàn)［9］方法獲得。

1.3 秋水仙素誘導(dǎo)

以2%的二甲基亞砜（DMSO）作溶劑配制成濃度為0.05%、0.08%和0.10%的秋水仙素溶液，24℃條件下，搖床轉(zhuǎn)速100r／min和室內(nèi)避光分別處理無菌條葉百合鱗莖48h和72h。其中，濃度為0.05%和0.08%的秋水仙素處理直徑較小的鱗莖（平均值0.7cm），濃度為0.10%的秋水仙素分別處理直徑較?。ㄆ骄?.7cm）和直徑較大（平均值1.4cm）的2種鱗莖（表）。每隔3d觀察并記錄條葉百合的變異情況，并拍下具有變異特征的組織或幼苗的照片。

1.4 多倍體材料的穩(wěn)定性與鑒定

參照文獻(xiàn)［9］等方法進(jìn)行。將疑似變異器官從外植體上切割后接種到MS＋6－BA 2.0mg／L＋NAA 0.2mg／L培養(yǎng)基上，待疑似變異器官重新脫分化、再分化出芽，將其繼代增殖成1個(gè)株系，并標(biāo)記該疑似變異株系。將正常對(duì)照植株和四倍體變異植株無菌苗接種到生根培養(yǎng)基（1／2MS＋6－BA 0.5mg／L＋NAA 0.2mg／L），25℃恒溫，培養(yǎng)4周。煉苗后移栽到草炭與蛭石混配（V草炭∶V蛭石＝1∶1）的培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)，觀察兩者區(qū)別。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理對(duì)條葉百合的誘導(dǎo)效果

由表中可見，0.05%秋水仙素有誘導(dǎo)效果，但誘導(dǎo)率較低；0.10%的秋水仙素溶液處理變異率最高。可見，在一定時(shí)間內(nèi)，秋水仙素濃度越高，變異率越高，相同濃度下，不同處理時(shí)間誘導(dǎo)效果差異較小。0.10%的秋水仙素溶液處理大小鱗莖時(shí)，較大鱗莖的誘導(dǎo)效果稍好。

表 秋水仙素處理?xiàng)l葉百合的誘導(dǎo)情況Table Induction of L.callosumtreated by colchicine

2.2 多倍體的穩(wěn)定性

將秋水仙素誘導(dǎo)處理的材料經(jīng)過40d左右的培養(yǎng)，有些器官發(fā)生明顯的形態(tài)變異現(xiàn)象，如葉片變寬、變厚、變短，葉片肉質(zhì)化，葉片表面粗糙；葉色加深；葉緣兩叉開裂等。這些表型變異，疑似多倍體變異株（圖1）。幼苗這些疑似變異株并不是每株具有所有的形態(tài)變異特征，可能具有其中的1個(gè)或幾個(gè)特征。

2.3 四倍體植株的鑒定及純化培養(yǎng)

經(jīng)對(duì)4株疑似多倍體誘變株系的染色體檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），變異株系1、株系2、株系3中染色體24條的細(xì)胞占56%～63%，未見48條染色體，屬假誘變株系。變異株系4體細(xì)胞由31條到48條5個(gè)數(shù)目的染色體構(gòu)成，其中48條染色體細(xì)胞占63%。從4個(gè)疑似多倍體誘變株系的染色體數(shù)目組成看，其體細(xì)胞均由不同比例染色體數(shù)目混合構(gòu)成，但變異株系4已比較接近四倍體。將變異株系4切割分離和純化培養(yǎng)，最終得1個(gè)四倍體株系（2n＝4x＝48）。經(jīng)細(xì)胞檢測(cè)誘變材料，除正常的染色體外，約30%細(xì)胞中能觀察到1至幾條的數(shù)目不定的B染色體。

圖1 條葉百合多倍體誘變過程的植株形態(tài)Fig.1 The morphology of L.callosumpolyploid during the induction

圖2 條葉百合根尖的染色體數(shù)目Fig.2 Chromosome quantity of root tip cells in L.callosum

2.4 四倍體植株的形態(tài)特征和移栽成活率

經(jīng)培養(yǎng)，對(duì)照植株和四倍體變異植株生根率達(dá)100%。觀察誘變?yōu)樗谋扼w植株的形態(tài)特征，剛純化出的四倍體植株生長相當(dāng)緩慢，但葉色深綠，葉片變得粗大且表面不光滑，小鱗莖增大，根系變粗短。6周后，四倍體植株生長速度漸漸加快，植株整體表現(xiàn)粗大，顏色加深。其中，四倍體植株葉片寬度是二倍體植株的1.12倍，變異植株小鱗莖直徑是對(duì)照的1.41倍。出瓶煉苗后成活率達(dá)91%。

3 結(jié)論與討論

用0.10%濃度秋水仙素處理的試驗(yàn)材料雖誘導(dǎo)效果顯著，誘變率超過90%，明顯高于前人在百合屬其他種類中的誘變效果［7－9］，可能是種間對(duì)秋水仙素反應(yīng)存在差異的表現(xiàn)。試驗(yàn)中出現(xiàn)誘導(dǎo)的鱗莖中心部分腐爛甚至完全死亡等爛心現(xiàn)象，中心部位腐爛一般出現(xiàn)在秋水仙素處理的第3天，及時(shí)將其腐爛部位切割掉，其余未腐爛的部位幾乎不會(huì)受到影響，會(huì)繼續(xù)分化，部分植株的葉片顏色加深或高度肉質(zhì)化。這是由于試驗(yàn)中秋水仙素濃度較高，誘變劑毒性嚴(yán)重干擾了組織的代謝和分化［10］。由于百合小鱗莖內(nèi)外層鱗片發(fā)育程度不同及小鱗莖個(gè)體間的不完全均一，導(dǎo)致誘變劑毒性使試驗(yàn)材料部分受害現(xiàn)象發(fā)生。鱗莖的直徑大小與誘變劑的處理效果有密切關(guān)系，直徑1.4cm與直徑0.7cm的鱗莖相比，大鱗莖比小鱗莖鱗片多，不同發(fā)育階段的內(nèi)外層鱗片對(duì)秋水仙素的反應(yīng)敏感性多樣化。當(dāng)秋水仙素處理時(shí)，大鱗莖更易發(fā)生一系列反應(yīng)以適應(yīng)環(huán)境，眾多鱗片中有發(fā)育后期對(duì)誘變劑反應(yīng)遲鈍的，有發(fā)育中前期對(duì)誘變劑較為敏感的可達(dá)到預(yù)期誘變效果，或有剛剛發(fā)育的鱗片對(duì)誘變劑過于敏感嚴(yán)重受害而死亡。可見，在誘變劑處理較大鱗莖時(shí)，其中總有一些鱗片能夠達(dá)到育種期望的誘變程度。

B染色體是區(qū)別于正常染色體，隨機(jī)獨(dú)立存在于整倍體中的特殊染色體，不同物種B染色體數(shù)目不同，同一物種不同個(gè)體間B染色體數(shù)目不同，同一個(gè)體不同細(xì)胞B染色體數(shù)目不同，甚至不同分裂期細(xì)胞B染色體數(shù)目不同。此外，也存在同一物種，有的植株有B染色體，而有的植株不存在B染色體［11］。如李懋學(xué)［12］等對(duì)岷江百合的染色體進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，岷江百合細(xì)胞中有B染色體，而劉華敏［13］等對(duì)岷江百合的研究過程中并未觀察到B染色體。有研究者在觀察產(chǎn)自我國黑龍江的條葉百合時(shí)，現(xiàn)頻率極低的1條B染色體［14］。本研究亦觀察到，部分條葉百合細(xì)胞中存在有B染色體。且不同株系B染色體出現(xiàn)的頻率不同，如株系4有33.33%，株系1有32%，株系3有26.67%，而株系2中并未觀察到B染色體。同一株系不同細(xì)胞含B染色體數(shù)目也不同，株系1的B染色體數(shù)目從1～5不等；株系4中B染色體數(shù)目有3條、4條、5條、6條、8條和9條共6種；株系3中B染色體數(shù)目多為2條或3條。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

In vitro Polyploid Induction of Lilium callosum

WU Xuejuan，YANG Liping＊，CHEN Min

（College of Life Science and Technology，Yangtze Noramal University，Chongqing408100，China）

L.callosummaterial used for experiment were polypoidized to improve the plant disease resistance of the species.Bulblets of L.callosumwere treated by colchicine of different concentration with 2.00%dimethyl sulfoxide for in vitro addition.The results indicated that 0.10%colchicine had the best induction，100%of the 1.4cm bulblets and 92%of the 0.7cm bulblets were inducted.By examining the chromosome for the four obtained mutative strains which were possibly the polyploids，only one strain showed 48chromosomes，and the proportion of tetraploid was 63%.After the separation and purification，finally one tetraploid strain（2n＝4x＝48）was obtained.Besides the normal chromosomes，B chromosomes with varying number were observed in some strains with the proportion of nearly 30%of the total cells.

Lilium callosum；polyploid；colchicine；chromosome；B chromosome

S682.2＋9

A

1001－3601（2016）08－0346－0084－03

2016－01－12；2016－07－09修回

重慶市涪陵區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目“西南地區(qū)特色百合資源收集與種質(zhì)創(chuàng)新”（FLKJ，2012ABB1086）

吳雪娟（1994－），女，本科，研究方向：花卉育種。E－mail：1164418577＠qq.com

＊通訊作者：楊利平（1962－），男，教授，博士，從事花卉育種工作。E－mail：836711655＠qq.com