擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析

杜亞琳

（農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030）

擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析

杜亞琳

（農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030）

為進(jìn)一步探明植物缺銅響應(yīng)機(jī)制，利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變、體視顯微形態(tài)觀察和ICP－MS技術(shù)對(duì)擬南芥（Col）缺銅敏感突變體cds－1進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果表明：在缺銅條件下，cds－1的根伸長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，而高濃度銅處理則可使得cds－1根長(zhǎng)部分恢復(fù)至野生型。除根伸長(zhǎng)發(fā)育受到抑制外，cds－1根部形態(tài)（根毛長(zhǎng)度和根直徑）與野生型相比也有較大差異。cds－1與野生型植株體內(nèi)銅含量無顯著差異。遺傳分析該突變體性狀由2對(duì)隱性等位基因控制。

突變體；擬南芥；銅；EMS

銅是植物生長(zhǎng)和發(fā)育必需的微量元素，諸多代謝過程，如光合作用、線粒體電子傳遞、呼吸作用、活性氧代謝、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變及乙烯反應(yīng)等，均需要銅作為輔助因子［1－2］。由于其在發(fā)育過程中的重要意義，銅動(dòng)態(tài)平衡在植物體內(nèi)處于精細(xì)調(diào)控狀態(tài)。植物體內(nèi)銅濃度在不同物種及不同外源銅環(huán)境條件下存在差異［3］。植物體內(nèi)，銅濃度一般為2～50μg／g，而6μg／g銅濃度足以保證植物正常的生長(zhǎng)和發(fā)育。然而當(dāng)銅濃度低于5μg／g或高于20μg／g時(shí)，植物體表現(xiàn)缺銅或銅毒害癥狀［2］。缺銅癥狀在不同土壤類型和作物中表現(xiàn)有所差異，但在有機(jī)質(zhì)土壤生長(zhǎng)的植物易表現(xiàn)缺銅癥狀，如生長(zhǎng)速率減緩、葉片顏色變淡、花粉活力減弱、結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量降低等。

缺銅脅迫條件下，植物通過調(diào)控銅吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)演化獲得1個(gè)精細(xì)調(diào)控體內(nèi)銅動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制［45］。如擬南芥通過提高銅的吸收和獲取應(yīng)對(duì)缺銅脅迫。缺銅脅迫上調(diào)擬南芥銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，如ZIP2、ZIP4和FRO3等［6－7］。此外，缺銅脅迫時(shí)，在轉(zhuǎn)銅伴侶CCH作用下，在衰老過程中銅在各組織間重新分配［8］。植物的另一個(gè)缺銅響應(yīng)機(jī)制為改變銅在體內(nèi)的分配，此機(jī)制在萊茵衣藻中研究較深入［9］，然而擬南芥分配機(jī)制與萊茵衣藻不同。在缺銅條件下，擬南芥銅鋅超氧物歧化酶CSD1和CSD2，及轉(zhuǎn)銅伴侶CCS均下調(diào)表達(dá)，且呈共表達(dá)模式［6，10］。隨著CSD1和CSD2在缺銅脅迫下的下調(diào)表達(dá)，鐵超氧物歧化酶基因FSD1表達(dá)增加，進(jìn)而取代Cu／ZnSOD的功能，節(jié)余的銅將用于缺銅脅迫條件下植物最必須的功能代謝過程［3，10］。銅相關(guān)microRNA的鑒定有利于進(jìn)一步理解植物的缺銅響應(yīng)機(jī)制。Cu－miroRNA受到低銅誘導(dǎo)表達(dá)和高銅抑制表達(dá)，而Cu－miroRNA下調(diào)表達(dá)介導(dǎo)的銅動(dòng)態(tài)平衡，主要受關(guān)鍵作用因子miR398的調(diào)控，而miR398只在低銅環(huán)境中表達(dá)。在缺銅脅迫下，miR398能夠直接調(diào)控CSD1mRNA的降解，同時(shí)，其還調(diào)控CSD2和COX5b－1的表達(dá)［11］。此外，另外3個(gè)低銅上調(diào)表達(dá)microRNA家族，miR397、miR408和miR857，同樣可調(diào)控銅蛋白基因的表達(dá)［12］。

植物缺銅響應(yīng)機(jī)制的相關(guān)研究已取得較大進(jìn)展，但目前銅脅迫條件下植物調(diào)控銅動(dòng)態(tài)平衡的生理與分子機(jī)制仍不能清晰闡述，而突變體材料則是研究植物缺銅適應(yīng)機(jī)制的理想材料。van Vliet等［13］獲得1個(gè)銅富集敏感突變體cup1－1，該突變體體內(nèi)植物螯合態(tài)的生物合成及功能未受到影響，可能是體內(nèi)積累了過量銅而使其擁有銅富集敏感表型。Murphy和Taiz［14］利用VMT技術(shù)快速鑒定獲得1個(gè)擬南芥銅富集敏感突變體cus。在EMS誘變基礎(chǔ)上，Wu等［15］獲得了1個(gè)缺銅敏感突變體tpst－2，酪氨酸硫化轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)含子保守可變剪切位點(diǎn)的突變導(dǎo)致該突變性狀的產(chǎn)生，生理生化及蛋白質(zhì)水平試驗(yàn)證據(jù)表明，該基因可能參與銅介導(dǎo)的乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑。筆者從甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的擬南芥（哥倫比亞型，Col）M2代群體中篩選擬南芥缺銅敏感突變體，以期為后續(xù)利用基因工程技術(shù)研究該基因的功能及探索植物缺銅響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis）生態(tài)型為哥倫比亞型（野生型，WT）。EMS誘變的擬南芥WT型M2種子購自于美國Lehle種子中心。種子經(jīng)0.1%HgCl2消毒5min后，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%的瓊脂懸浮于MGRL培養(yǎng)基［15］，于4℃條件下黑暗處理2d后轉(zhuǎn)至光照為100μmol／（m2·s）、光照／黑暗為16h／8h光周期、溫度為22℃的光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用MGRL配方：1.512mmol／L NaH2PO4·2H2O，0.257mmol／L Na2HPO4· 12H2O，1.5mmol／L MgSO4·7H2O，2mmol／L Ca （NO3）4·4H2O，3mmol／L KNO3，67μmol／L Na2EDTA·2H2O，8.6μmol／L FeSO4·7H2O，10.3μmol／L MnSO4，1μmol／L ZnSO4·7H2O，30μmol／L H3BO3，24nmol／L（NH4）6Mo7O24· 4H2O，130nmol／L CoCl2·6H2O，分別在培養(yǎng)基中添加不同濃度的CuSO4，0和50μmol／L分別為缺銅（－Cu）和高銅（50Cu）。

1.2 突變體的篩選

以野生型種子作為對(duì)照，將由EMS誘變的擬南芥WT型2 000粒M2代種子播種于缺銅培養(yǎng)基上，處理5d后將根伸長(zhǎng)發(fā)育受到抑制的單株轉(zhuǎn)移至高銅培養(yǎng)基生長(zhǎng)，5d后將根伸長(zhǎng)發(fā)育部分或完全恢復(fù)至野生型單株再次轉(zhuǎn)移至缺銅培養(yǎng)基，根伸長(zhǎng)發(fā)育再次受到缺銅抑制的單株作為潛在的擬南芥缺銅敏感突變體并自交繁種。將M3種子再次在缺銅和高銅培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，最終鑒定具有顯著缺銅敏感的突變體（命名為csd－1）。

1.3 擬南芥植株根長(zhǎng)測(cè)定

將野生型和突變體種子消毒后置于4℃黑暗培養(yǎng)2d，然后分別播種于缺銅和高銅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10d（光照為100μmol／（m2·s）、16（光照）／8（黑暗）h光周期、溫度為22℃），利用軟件ImageJ（http：／／rsb.info.nih.gov／ij／）測(cè)定植株根長(zhǎng)，每個(gè)處理不少于30個(gè)單株，統(tǒng)計(jì)分析采用Turkey法進(jìn)行（P＜0.05）。

1.4 銅含量測(cè)定

將野生型和突變體種子消毒后置于4℃黑暗培養(yǎng)2d，然后植株分別播種于缺銅和高銅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10d（光照為100μmol／（m2·s）、光照／黑暗為16h／8h光周期、溫度為22℃），分地上部和根分別取材，用蒸餾水將樣品沖洗3次后置于65℃烘干，并用硝酸硝解。樣品銅含量采用ICP－MS （SPQ9700；SII，Chiba，Japan）測(cè)定［16］。

1.5 突變體的體視顯微形態(tài)學(xué)觀察

將突變體和野生型種子分別播種2個(gè)處理（缺銅和高銅培養(yǎng)基）生長(zhǎng)7d，取其根部，利用體視顯微鏡（SteREO Discovery.V12）進(jìn)行體視顯微形態(tài)學(xué)觀察，每個(gè)處理不少于10株植株。

1.6 突變體的遺傳分析

將csd－1突變體與Ler野生生態(tài)類型進(jìn)行雜交，以獲得F1代種子，進(jìn)而將F1自交收獲F2種子。將F1種子和F2種子播種于缺銅培養(yǎng)基上觀察F1及F2植株的缺銅敏感性及分離比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥銅缺失敏感突變體cds－1的篩選及表型

經(jīng)鑒定得1株擬南芥銅敏感突變體，命名為cds－1（圖1A）。在缺Cu條件下生長(zhǎng)10d，野生型根長(zhǎng)為（8.1±0.25）cm，cds－1根長(zhǎng)為（3.2±0.27）cm；而在高銅條件下，野生型根長(zhǎng)為（7±0.31）cm，cds－1根長(zhǎng)為（5.3±0.1）cm（圖1B）。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察得，cds－1突變體在缺銅條件下主根變粗，側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度均有所增加；高銅處理對(duì)野生型的根部形態(tài)無影響，但卻能部分恢復(fù)cds－1突變體的根部形態(tài)（圖2），表明，cds－1是擬南芥銅缺失敏感突變體。在缺銅和高銅條件下，野生型和cds－1突變體的地上部和根銅含量均無顯著性差異（圖3）。

圖1 擬南芥缺銅敏感突變體cds－1及其野生型植株的根長(zhǎng)Fig.1 The root length of Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

圖2 擬南芥缺銅敏感突變體cds－1及其野生型植株的根組織形態(tài)Fig.2 Stereo microscope morphological observation of root tissue of Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

圖3 擬南芥銅敏感突變體cds－1及其野生型的銅含量Fig.3 Cu content of the Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

2.2 擬南芥銅缺失敏感突變體cds－1的遺傳特征

經(jīng)遺傳分析，30株F1植株全部為野生型表型，在F2植株中有670株表現(xiàn)為野生型表型，46株植株表現(xiàn)為突變表型，野生型∶突變體＝15∶1，表明該突變性狀由2對(duì)隱性等位基因控制。

3 結(jié)論與討論

突變體是功能基因組學(xué)研究的重要材料。隨著各種植物全基因組測(cè)序工作的陸續(xù)完成，植物突變體已廣泛應(yīng)用于鑒定調(diào)控植物形態(tài)和生理性狀與基因的連鎖分析及其相關(guān)基因的克隆和功能研究。目前，應(yīng)用于突變體獲得的方法有多種，EMS誘變是其中效率較高的技術(shù)［17］。此外，針對(duì)EMS誘變特點(diǎn)，結(jié)合基因組重測(cè)序技術(shù)，開發(fā)了各種新型的用于鑒定EMS誘變突變體目標(biāo)基因的技術(shù)，如結(jié)合重測(cè)序和圖位克隆進(jìn)行基因的鑒定、利用F2分離群體進(jìn)行基因鑒定的MutMap技術(shù)和利用M3分離群體進(jìn)行基因鑒定的MutMap＋技術(shù)等［17－19］，為下一步克隆控制擬南芥缺銅敏感突變體目標(biāo)基因提供了技術(shù)支持。

鑒于cds－1突變體是經(jīng)EMS誘變產(chǎn)生的擬南芥銅缺失敏感突變體。據(jù)植物銅吸收和銅調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)途徑［4－5］，突變體對(duì)缺銅生長(zhǎng)條件產(chǎn)生敏感性，可能是由于其某個(gè)負(fù)責(zé)銅吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因發(fā)生了突變，或因其某個(gè)負(fù)責(zé)銅生理功能發(fā)揮的信號(hào)傳導(dǎo)基因發(fā)生突變。為闡明此問題，測(cè)定野生型及cds－1突變體的銅含量結(jié)果顯示，在缺銅和高銅條件下野生型和cds－1突變體的地上部和根銅含量均無顯著性差異，表明，cds－1突變基因不是負(fù)責(zé)銅吸收相關(guān)基因，可能是負(fù)責(zé)突變體內(nèi)銅的利用或銅歸宿性轉(zhuǎn)運(yùn)得相關(guān)基因。目前，cds－1基因的圖位克隆工作正在進(jìn)行中，該基因的克隆可為進(jìn)一步闡明植物缺銅敏感的分子調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)。

［1］Pilon M，Abdel－Ghany S E，Cohu C M，et al.Copper cofactor delivery in plant cells［J］.Curr Opin Plant Biol，2006，9（3）：256－263.

［2］Burkhead J L，Reynolds K A，Abdel－Ghany S E，et al.Copper homeostasis［J］.New Phytol，2009，182 （4）：799－816.

［3］Cohu C M，Pilon M.Regulation of superoxide dismutase expression by copper availability［J］.Physiol Plantarum，2007，129（4）：747－755.

［4］Puig S，Thiele D J.Molecular mechanisms of copper uptake and distribution［J］.Curr Opin Chem Biol，2002，6（2）：171－180.

［5］De Freitas J，Wintz H，Kim J H，et al.Yeast，a model organism for iron and copper metabolism studies［J］.Biometals，2003，16（1）：185－197.

［6］Wintz H，F(xiàn)ox T，Wu Y Y，et al.Expression profiles of A.thaliana in mineral deficiencies reveal novel transporters involved in metal homeostasis［J］.J Biol Chem，2003，278（48）：47644－47653.

［7］Mukherjee I，Campbell N H，Ash J S，et al.Expression profiling of the Arabidopsis ferric chelate reductase（FRO）gene family reveals differential regulation by iron and copper［J］.Planta，2006，223（6）：1178－1190.

［8］Mira H，Mart nez N，Pe arrubia L，et al.Expression of a vegetative－storage－protein gene from Arabidopsis is regulated by copper，senescence and ozone［J］.Planta，2002，214（6）：939－946.

［9］Merchant S S，Allen M D，Kropat J，et al.Between a rock and a hard place：trace element nutrition in Chlamydomonas［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1763（7）：578－594.

［10］Abdel－Ghany S E，M ller－Moul P，Niyogi K K，et al.Two P－type ATPases are required for copper delivery in Arabidopsis thaliana chloroplasts［J］.Plant Cell，2005，17（4）：1233－1251.

［11］Yamasaki H，Abdel－Ghany S E，Cohu C M，et al.Regulation of copper homeostasis by micro－RNA in Arabidopsis［J］.J Biol Chem，2007，282（22）：16369－16378.

［12］Abdel－Ghany SE，Pilon M.MicroRNA－mediated systemic down－regulation of copper protein expression in response to low copper availability in Arabidopsis［J］.J Biol Chem，2008，283（23）：15932－15945.

［13］van Vliet C，Anderson C R，Cobbett C S.Coppersensitive mutant of Arabidopsis thaliana.Plant Physiol，1995，109（3）：871－878.

［14］Murphy A，Taiz L.A new vertical mesh transfer technique for metal－tolerance studies in Arabidopsis （ecotypic variation and copper－sensitive Mutants）［J］.Plant Physiol，1995，108（1）：29－38.

［15］Wu T，Kamiya T，Yumoto H，et al.An Arabidopsis thaliana copper－sensitive mutant suggests a role of phytosulfokine in ethylene production［J］.J Exp Bot，2015，66（13）：3657－3667.

［16］Takano J，Wada M，Ludewig U，et al.The Arabidopsis major intrinsic protein NIP5；1is essential for efficient boron uptake and plant development under boron limitation［J］.Plant Cell，2006，18（6）：1498－1509.

［17］Tabata R，Kamiya T，Shigenobu S，et al.Identification of an EMS－induced causal mutation in a gene required for boron－mediated root development by lowcoverage genome re－sequencing in Arabidopsis［J］.Plant Signal Behav，2013，8（1）：e22534.

［18］Abe A，Kosugi S，Yoshida K，et al.Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap［J］.Nat Biotechnol，2012，30（2）：174－178.

［19］Fekih R，Takagi H，Tamiru M，et al.MutMap＋：Genetic Mapping and Mutant Identification without Crossing in Rice［J］.PLoS One，2013，8（7）：e68529.

（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Identification and Analysis of Copper Deficiency Sensitive Mutant in Arabidopsis

DU Yalin

（Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（Northeast Region），Ministry of Agriculture，College of Horticultural，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang150030，China）

To understand the Cu deficiency response mechanism in plants further，a Arabidopsis（Col）copper deficiency（－Cu）sensitive mutant named cds－1was screened and identified by using ethyl methane sulfonate（EMS）mutagenesis，cytology and ICP－MS technique.Results：The root length elongation of cds－1was inhibited under－Cu condition，while it could be partially restored to the wild type phenotype under high Cu conditions.The length of root hair and root diameter of cds－1mutant were also different from the wild type phenotype under－Cu condition.Cu assay results showed that the cds－1mutant and Col plants had similar root and shoot Cu content.Genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by two recessive genes.

mutant；arabidopsis；copper；EMS

Q944.1

A

1001－3601（2016）08－0345－0080－04

2016－01－11；2016－07－21修回

黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目“黃瓜耐低氮相關(guān)基因表達(dá)譜分析及重要基因克隆”（QC2010089）

杜亞琳（1980－），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事園藝作物生物技術(shù)研究。E－mail：duyalin123＠163.com