豬肉組織及尿液中萊克多巴胺的快速檢測

黨 娟，李 平，牛治存，王大敏，何國書，2，馮才偉

（1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州貴陽550009；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京100012）

畜牧·獸醫(yī)·水產(chǎn)

豬肉組織及尿液中萊克多巴胺的快速檢測

黨 娟1，李 平1，牛治存1，王大敏1，何國書1，2，馮才偉1

（1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司，貴州貴陽550009；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京100012）

為實(shí)現(xiàn)豬肉組織中萊克多巴胺殘留大量樣本的快速檢測，選用萊克多巴胺酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫（CMIA）檢測試劑盒對豬肉、豬肝和尿液3種樣品中萊克多巴胺殘留量進(jìn)行檢測，并與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）進(jìn)行比較。結(jié)果表明：ELISA、CMIA這2種試劑盒對豬肉、豬肝、尿液樣品在萊克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2個水平的平均回收率達(dá)90.4%～103.4%，變異系數(shù)均小于10%；對豬肉、豬肝和尿液3種樣品的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；2種試劑盒與GC－MS檢測實(shí)際樣品的判斷結(jié)果一致，且檢測時間短，僅需少量儀器，檢測準(zhǔn)確度高，適合大批量樣品檢測。

萊克多巴胺；酶聯(lián)免疫吸附法；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；氣相色譜－質(zhì)譜法

β－興奮劑是營養(yǎng)重分配劑的一種，是一類結(jié)構(gòu)及功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）屬于β－興奮劑，可以加快畜禽生長速度，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率［1－3］。β2－腎上腺素受體激動劑的結(jié)構(gòu)、作用與腎上腺素和去甲腎上腺素相似，由芳香環(huán)、β－羚基和脂肪氨基3個活性基團(tuán)組成。這些基團(tuán)形成的特異性結(jié)構(gòu)構(gòu)成了與β－AR的結(jié)合位點(diǎn)。這些藥物的作用機(jī)理是與組織細(xì)胞如血管平滑肌、細(xì)支氣管平滑肌的β2受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜上的腺昔酸環(huán)化酶，引起細(xì)胞產(chǎn)生一系列變化，導(dǎo)致氣管、支氣管平滑肌松弛，骨骼肌收縮，血管平滑肌松弛，過敏介質(zhì)釋放減少，并增加呼吸道纖毛運(yùn)動，促進(jìn)痰液排出，最初用來治療呼吸系統(tǒng)疾?。?－8］。但過量使用萊克多巴胺會殘留在畜禽肌肉組織中，對人體健康產(chǎn)生毒副作用，如心跳加快和呼吸困難等癥狀［9－10］；對鼠的毒性屬于低毒級［11］。

在歐盟，β－興奮劑已被禁止作為家禽的生長促進(jìn)劑［12］，我國也禁止在飼料和飲用水中使用，如：萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西嗎特羅和硫酸特布他林等［13］。但由于萊克多巴胺屬于非處方藥，且價格遠(yuǎn)低于克侖特羅，因此其非法應(yīng)用者不斷增多。目前，應(yīng)用于β－興奮劑的檢測方法主要是經(jīng)典的色譜法和免疫分析法。為檢驗(yàn)北京勤邦生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫（CMIA）試劑盒的檢測效果，分別采用ELISA和CMIA 2種方法對豬肉組織、尿液中萊克多巴胺進(jìn)行檢測，并與氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）法比較，以期實(shí)現(xiàn)豬肉組織中萊克多巴胺殘留大量樣本的快速檢測以及該試劑盒的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：豬肉、豬肝臟和豬尿液，采自貴陽某屠宰場。

試劑：萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒，萊克多巴胺CMIA檢測試劑盒（北京勤邦生物技術(shù)有限公司），萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司），甲醇（色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司），丙酮、異丙醇、甲苯、乙酸乙酯、濃硫酸、濃鹽酸、高氯酸和濃氨水等（均為分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 儀器

磁免疫全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀（北京勤邦生物技術(shù)有限公司），酶標(biāo)分析儀（Multiskan MK3，美國Thermo公司），高速電動勻漿機(jī)（FSH－Ⅱ型，江蘇中大儀器廠），恒溫振蕩器（CHZ－82A，上海百典儀器設(shè)備有限公司），高速離心機(jī)（GT16－3A，北京時代北利離心機(jī)有限公司），渦旋儀（QL－901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），天平（ESJ200－4，沈陽龍騰電子有限公司），微量移液器（單道20～200μL、100～1 000μL，多道250μL，美國Thermo公司），GC－MS氣質(zhì)聯(lián)用儀〔ISQ，賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕。

1.3 樣品前處理

1.3.1 ELISA樣品

1）尿液。取20μL清亮尿樣直接測定（如尿樣渾濁必須通過過濾，或在20～25℃、3 000r／min以上離心10min，直至清亮）。

2）豬肉／豬肝。用均質(zhì)器均質(zhì)豬肉或肝臟樣本，稱?。?.0±0.05）g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入2%NaCl－0.2mol／L HCl－甲醇混合液4mL，3 000r／min以上振蕩30s，取0.5mL上清液，加入0.5mol／L氫氧化鈉溶液30mL，再加入復(fù)溶液0.5mL，20～25℃、3 000r／min離心10min；取20μL上層溶液用于分析。

1.3.2 CMIA樣品

1）尿液。其處理方法同ELISA樣品尿液前處理。

2）豬肉。用均質(zhì)器均質(zhì)豬肉樣本，稱?。?.0± 0.05）g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入提取工作液（試劑1：量取濃鹽酸4.15mL，加入去離子水定容至500mL；試劑2：稱取十二水合磷酸氫二鈉0.44g、二水合磷酸二氫鈉1.37g，加入500mL去離子水溶解混勻；試劑3：量取4mL試劑1、40mL試劑2和16mL甲醇混勻），然后再加入6mL試劑3，用渦旋儀渦動2min，然后20～25℃、3 000r／min以上離心5min；取500μL上清液加入750μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動20s，用于分析。

3）豬肝。用均質(zhì)器均質(zhì)肝臟樣本，稱?。?.0± 0.05）g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入0.25mol／L硫酸1mL和甲醇2mL，渦動2min，在20～25℃、3 000r／min以上離心5min；取200μL上清液加入600μL復(fù)溶液（用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1∶1體積進(jìn)行稀釋），渦動20s，用于分析。

1.4 樣品檢測

1.4.1 ELISA將所需試劑放于20～25℃平衡30min以上，使用前搖勻。加標(biāo)準(zhǔn)品／樣本20μL到對應(yīng)的微孔中，每孔加入酶標(biāo)二抗?jié)饪s液與抗體工作液（10∶1）的混合液80μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。然后小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250μL／孔充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干，加底物液A液50μL／孔，再加底物液B液50μL／孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應(yīng)10min，加入終止液50μL／孔，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀于450nm處測定。

1.4.2 CMIA將所有試劑回升至20～25℃，酶標(biāo)抗原濃縮液與酶標(biāo)抗原稀釋液按1∶10體積進(jìn)行稀釋，磁標(biāo)抗體濃縮液與磁標(biāo)抗體稀釋液按1∶10體積進(jìn)行稀釋，將稀釋好的磁標(biāo)抗體與酶標(biāo)抗體工作液裝入試劑盒標(biāo)示區(qū)，再把樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別放入樣品管和標(biāo)準(zhǔn)品管，并放于磁免疫全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀設(shè)定區(qū)域進(jìn)行檢測。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及萊克多巴胺濃度的計算

測定0μg／L、0.05μg／L、0.15μg／L、0.45μg／L、1.35μg／L和4.05μg／L 6個濃度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值（A）和發(fā)光度值（RLU），計算百分吸光率。

百分吸光率＝B／B0×100%

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值，B0為標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

以萊克多巴胺濃度對數(shù)值（Log）為橫坐標(biāo)，各對應(yīng)濃度的百分吸光率為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)（Log）為橫坐標(biāo)，ln百分吸光率為縱坐標(biāo)建立雙對數(shù)直線擬合曲線，數(shù)學(xué)模型：

將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對應(yīng)濃度（C），乘以其對應(yīng)稀釋倍數(shù)即為樣品中萊克多巴胺的實(shí)際濃度。

1.6 試劑盒性能檢測

分別對試劑盒的特異性、檢測限、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行試驗(yàn)，并將其精密度和準(zhǔn)確度與HPLC檢測的精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對比。

1.6.1 特異性 用交叉反應(yīng)率來表示，即抗體與結(jié)構(gòu)不同抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。選擇與萊克多巴胺類似結(jié)構(gòu)和功能的藥物，將不同濃度的萊克多巴胺類似物替代萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率＝引起50%抑制的萊克多巴胺濃度／引起50%抑制的萊克多巴胺類似物濃度× 100%

1.6.2 檢測限 分別對空白豬肉、豬肝和尿液樣品進(jìn)行20次檢測，計算萊克多巴胺的濃度。檢測限（LOD，即試劑盒檢測實(shí)際樣品的最低檢測限）公式：

式中，X為萊克多巴胺的濃度平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6.3 精密度和準(zhǔn)確度 精密度又稱可重復(fù)性，反映測定方法對某一特定樣品多次測定所得結(jié)果的重復(fù)程度，是評定化學(xué)發(fā)光試劑盒質(zhì)量最基本的參數(shù)。準(zhǔn)確度是指測定值與真實(shí)值間的符合程度，試劑盒的準(zhǔn)確度用回收率表示。在檢測為陰性的豬肉、豬肝和尿液樣本中添加萊克多巴胺，每種樣品、每個濃度各6個平行，參照試劑盒說明書測定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測定同一份樣品2次，分別計算測定樣品的回收率。

1.6.4 試劑盒與GC－MS檢測結(jié)果比較 隨機(jī)抽取屠宰場的豬肉、豬肝和尿液樣本各20份，分別用試劑盒方法和GC－MS法進(jìn)行檢測，GC－MS法參考農(nóng)業(yè)部958號公告－4－2007動物組織及尿液中萊克多巴胺殘留檢測方法。GC－MS法中豬肉和豬肝（5μg／kg）、尿液（2μg／kg）的檢測限為陽性判定線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖示可知，ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝－1.782 8x＋4.224 9，R2＝0.996 2，說明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒線性關(guān)系良好。CMIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝－1.725 4x＋4.149 4，R2＝0.997 5，說明萊克多巴胺CMIA檢測試劑盒線性關(guān)系良好。

2.2 試劑盒性能

2.2.1 特異性 從表1可知，萊克多巴胺類似代謝物的交叉反應(yīng)率均較低，抗體特異性較高，對萊克多巴胺具有較好的特異性。

圖示ELISA（上）和CMIA（下）的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其方程Fig. The standard curve and equation of ELISA（up）and CMIA（down）

表1 萊克多巴胺類似物的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross reactivity of ractopamine analogues%

表2 萊克多巴胺試劑盒的最低檢測限Table 2 Minimum detection limit of ractopamine kits

2.2.2 檢測限 從表2看出，ELISA和CMIA試劑盒對豬肉、豬肝和尿液3種樣品的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg，均低于目前歐盟對萊克多巴胺檢測方法的靈敏度（1μg／kg）［11］，說明這2種試劑盒檢測限較低，試劑盒靈敏度較高。

表3 萊克多巴胺試劑盒的準(zhǔn)確度與精密度Table 3 Precision and accuracy of ractopamine kits

表4 不同方法檢測的萊克多巴胺含量Table 4 Ractopamine contents detected with different methodsμg／kg

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 從表3可知，3種樣品的回收率在90.4%～103.4%，變異系數(shù)均小于10%，符合“農(nóng)業(yè)部文件”農(nóng)醫(yī)發(fā)［2005］17號附件2中試劑盒備案的參考標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.4 試劑盒與GC－MS法檢測比較 對隨機(jī)抽取屠宰場的豬肉、豬肝和尿液樣本各20份進(jìn)行檢測，其中7號、12號樣本的萊克多巴胺（表4）高于檢出線，其他樣本無檢出。ELISA、CMIA試劑盒檢測結(jié)果與GC－MS法檢測結(jié)果相當(dāng)，表明這2種試劑盒檢測的準(zhǔn)確度達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)檢測水平。

3 結(jié)論

測定結(jié)果表明，ELISA和CMIA檢測試劑盒對萊克多巴胺類似物的交叉反應(yīng)率很低，對萊克多巴胺的特異性很高。ELISA和CMIA試劑盒對豬肉、豬肝和尿液樣品中萊克多巴胺的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；在萊克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2個水平的平均回收率為90.4%～103.4%，變異系數(shù)均小于10%；且2種試劑盒所需的檢測時間短，僅需少量儀器，檢測準(zhǔn)確度達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)檢測水平，適合大批量樣品檢測。

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（責(zé)任編輯：馮 衛(wèi)）

Rapid Detection of Ractopamine in Pork Tissues and Urine

DAND Juan1，LI Ping1，NIU Zhicun1，WANG Damin1，HE Guoshu1，2，F(xiàn)ENG Caiwei1
（1.Guizhou Kwinbon Food Safety Science－Technology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou550009；2.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.，Ltd，Beijing100012，China）

To realize the rapid detection of large－quantity samples of ractopamine residue in pork tissues，the methods of ELISA and CMIA were used to detect the residues of ractopamine in three kinds of samples including pork，liver and urine，which were compared with that of Gas Chromatography－Mass Spectrometer（GC－MS）.Results：The average recovery rate of ELISA and CMIA for detecting ractopamine in pork，liver and urine at levels of 0.5μg／kg and 1.0μg／kg reached 90.4%～103.4%with variation coefficient less than 10%；The minimum detection limits of pork，liver and urine were respectively 0.28μg／kg，0.33μg／kg and 0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg and 0.20μg／kg；The judgments of ELISA and CMIA were the same as GC－MS.This method was efficient，reliable and sensitive，and could can meet the on－site rapid detection of animal tissue and urine ractopamine residues needs.

ractopamine；melamine enzyme－linked immune sorbent assay（ELISA）；chemiluminescent microparticle immunoassay（CMIA）；gas chromatography－mass spectrometer（GC－MS）

S859.84

A

1001－3601（2016）08－0340－0061－04

2016－02－16；2016－07－07修回

2015貴州省科技廳農(nóng)業(yè)公關(guān)項(xiàng)目“農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)集成研究與應(yīng)用示范”［黔科合NY（2015）3016－1］；2014貴州省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)基金計劃項(xiàng)目“動物源性食品中獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化及推廣應(yīng)用”［黔科合成轉(zhuǎn)字（2014）5104］

黨 娟（1989－），女，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測技術(shù)的研究與開發(fā)工作。E－mail：853625823＠qq.com