響應(yīng)曲面法優(yōu)化葉子花紅色素提取工藝

莫大美，吳榮書，彭 毅

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

加工貯藏·農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量

響應(yīng)曲面法優(yōu)化葉子花紅色素提取工藝

莫大美，吳榮書＊，彭 毅

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

為保障食品質(zhì)量安全，獲得較多的天然植物色素應(yīng)用于食品加工中，以紫紅葉子花為試驗(yàn)材料，利用乙醇為提取劑提取葉子花紅色素，探討提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度對葉子花紅色素提取的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立葉子花紅色素提取量與各影響因子的回歸方程，并得到以葉子花紅色素提取量為響應(yīng)值的響應(yīng)面圖和等高線圖。結(jié)果表明：葉子花紅色素的最佳提取工藝為提取溫度21.68℃、提取時(shí)間67.68min、料液比1∶73.16（g∶mL）、乙醇濃度42.64%，此條件下葉子花紅色素提取量為0.160 3mg／mL，與Design－Expert.V8.0.6分析預(yù)測最大提取濃度（0.161 53mg／mL）相差較小。

葉子花；紅色素；響應(yīng)面法；提取工藝

葉子花（Bougainvillea spectabilis）俗稱九重葛、三葉梅和南美紫茉莉等［1］。葉子花是紫茉莉科中一種常綠攀援狀灌木，原產(chǎn)于南美洲熱帶、亞熱帶地區(qū)，20世紀(jì)50年代我國大量引種栽培［2］。據(jù)1997年《中藥大辭典》記載，其味苦澀、性溫，具有調(diào)和氣血，治婦女赤白帶下，月經(jīng)不調(diào)等功效［3－4］。葉子花終年開花不斷，形成一樹多花色現(xiàn)象，觀賞價(jià)值高。色素是一種食品添加劑，包括天然色素與合成色素兩類，合成色素是人工化學(xué)合成，其色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定且價(jià)格便宜，因多屬于苯胺類化合物，有致癌和誘導(dǎo)染色體變異的作用，對人體健康造成嚴(yán)重威脅，致其使用受到嚴(yán)格的限制。天然色素安全性高、種類多、無毒副作用，并具有生物活性和藥理功能，如今已成為食品添加劑發(fā)展的大趨勢［5］，而葉子花呈紫色或紫紅色含大量天然、健康色素，廣泛用于食品、化妝品行業(yè)，在食品中不僅有著色作用，而且對保證食品的質(zhì)量和安全具有重要意義。響應(yīng)面法包含試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建模、數(shù)據(jù)分析及條件優(yōu)化，不僅能對試驗(yàn)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，反應(yīng)出各因素對試驗(yàn)結(jié)果的交互影響。目前，對葉子花的研究主要集中在提取和穩(wěn)定性方面，而提取方法單一、傳統(tǒng)，只考察單因素對結(jié)果的影響，沒有反應(yīng)出各因素對試驗(yàn)結(jié)果的交互影響［6］。為此，筆者在溶劑法提取葉子花紅色素的基礎(chǔ)上［7－9］，采用響應(yīng)面法優(yōu)化葉子花紅色素提取工藝條件，以期為葉子花的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料：紫紅葉子花（采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)校本部）。

儀器：紫外分光光度計(jì)A360（上海柏欣儀器設(shè)備廠），RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、小型粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司），真空冷凍干燥機(jī)（寧波市雙嘉儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋HH－Z（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），震蕩儀（上海左樂儀器有限公司）。

1.2 最大吸收波長的確定

稱取0.100 0g處理好的碎葉子花苞片，以50%乙醇為提取劑，在室溫、料液比1∶40（g∶mL，下同）下浸提1h，再過濾，定容至100mL，在400～650nm波長掃描光譜得到最大可見吸收波長及吸光度，重復(fù)3次取平均值。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取葉子花紅色素1.0mg，用無水乙醇溶解，定容至100mL，配成質(zhì)量濃度為0.01mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別精確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL、3mL、5mL、7mL和9mL加入10mL具塞試管中，以蒸餾水做空白參比，在547nm波長下測吸光度，以吸光度A547為縱坐標(biāo)，以葉子花紅色素濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線公式為y＝6.87x－0.103，R2＝0.999 8。

1.4 單因素試驗(yàn)考察

考察不同提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度及溶劑pH對葉子花紅色素提取情況的影響。稱取1g處理好的碎葉子花新鮮苞片，在各考察因素下浸提，過濾，以相應(yīng)提取劑定容至100mL，測定吸光值，平行測樣，取平均值，選擇最優(yōu)提取條件。

1.4.1 提取溶劑 在料液比1∶40，常溫，pH6.7（以蒸餾水pH為準(zhǔn)，下同）條件下以無水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、三氯甲烷、蒸餾水、丙二酮和氯仿為溶劑浸提1h，測定吸光度（下同）。

1.4.2 提取溫度 在50%乙醇料液比1∶40，pH 6.7，溫度分別為4℃（冰箱冷藏）、18℃（室溫）、30℃、50℃、65℃和75℃條件下浸提1h。

1.4.3 提取時(shí)間 在50%乙醇，料液比1∶40，pH 6.7及室溫條件下分別浸提20min、40min、60min、80min、100min和120min。

1.4.4 料液比 在50%乙醇，pH 6.7，室溫，料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80條件下浸提60min。

1.4.5 乙醇濃度 在料液比1∶40，室溫，pH6.7，乙醇濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%條件下浸提1h。

1.4.6 提取溶劑pH在乙醇濃度40%，料液比1∶40，室溫，pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9和10（用NaOH和HCl調(diào)整浸提液pH）的條件下浸提1h。

1.5 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C）、乙醇濃度（D）為變量，以葉子花紅色素提取液的濃度為響應(yīng)值，確定最佳提取工藝條件，利用響應(yīng)曲面法中Box－Behnken設(shè)計(jì)4因素3水平共27組試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 葉子花紅色素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of the response surface experiment for extracting red pigment fromB.spectabilis

1.6 回歸方程的建立

利用Design Expert軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)中的響應(yīng)值進(jìn)行二元回歸擬合分析與方差分析，建立回歸方程。

1.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程繪出等高線圖、3D響應(yīng)面圖，從響應(yīng)面圖觀察各獨(dú)立變量之間的交互作用對響應(yīng)值的影響，分析提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度及料液比4個(gè)因素對葉子花紅色素提取的交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長

由圖1可知，葉子花紅色素在波長400～650nm，有2個(gè)吸收波峰，可能原因?yàn)槿~子花色素對可見光紅光和綠光都存在吸收峰，其中最大吸收波峰波長547nm為綠光最大吸收峰。

2.2 不同因素提取葉子花紅色素的效果

2.2.1 提取溶劑 由表2可知，選用的9種溶劑中，50%的乙醇吸光度最大，蒸餾水次之。三氯甲烷和石油醚提取后基本無色，說明葉子花紅色素為水溶性色素，溶于極性溶劑。乙醇濃度為50%時(shí)，色素溶解量極少，這進(jìn)一步說明葉子花紅色素溶解于強(qiáng)極性的溶劑。因此，試驗(yàn)選用乙醇為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑的葉子花紅色素吸光度及提取液顏色Table 2 Absorbance and color of red pigment extracted fromB.spectabilis with different extraction solvent

圖2 不同因素提取葉子花紅色素的濃度Fig.2 Red pigment concentration extracted fromB.spectabilis with different factors

2.2.2 提取溫度 提取溫度在4～21℃（室溫）時(shí)，葉子花紅色素濃度呈上升趨勢，說明溫度升高，溶劑的滲透力大，對葉子花紅色素的溶解率變大。當(dāng)溫度達(dá)21℃時(shí)，葉子花紅色素濃度達(dá)最高點(diǎn)。但溫度從21℃增加到30℃時(shí)，葉子花紅色素濃度逐漸降低。可能是隨著溫度的升高，色素開始破壞分解。且采用乙醇為提取溶劑，溫度上升，乙醇更易達(dá)到沸點(diǎn)，乙醇易揮發(fā)，導(dǎo)致提取的色素降低（圖2）。

2.2.3 提取時(shí)間 在提取時(shí)間為20～60min時(shí)，色素提取濃度隨時(shí)間延長明顯增加，在60min時(shí)達(dá)最大，為0.167 3mg／mL；隨時(shí)間延長，色素濃度明顯下降，原因可能是時(shí)間延長，溶液中色素濃度達(dá)到平衡或鄰近平衡，色素?cái)U(kuò)散速度減慢，而雜質(zhì)溶解反而加快，致提取量降低（圖2）。故提取時(shí)間以60min左右為宜。

2.2.4 料液比 隨料液比的增加，提取劑用量的加大，葉子花提取液中的色素濃度逐漸增加，色素浸出率相應(yīng)提高，料液比為1∶70時(shí)，色素濃度達(dá)最大，為0.138 1mg／mL；當(dāng)溶劑量繼續(xù)加大，色素濃度下降，說明色素浸出達(dá)到飽和，而溶劑的加入稀釋了溶液濃度（圖2）。故料液比以1∶70左右為宜。2.2.5乙醇濃度 提取液濃度隨乙醇濃度升高而增大，乙醇濃度為40%時(shí)，提取效果最好，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大，提取液濃度明顯降低?？赡苁且掖紳舛燃哟?，溶液極性變小，色素溶解量下降，致濃度下降。故乙醇濃度以40%左右為宜。

2.2.6 pH色素濃度在酸性條件下逐漸加大，色澤呈紫紅色，說明酸對葉子花紅色素有增色作用。而隨著pH的升高，色素濃度呈下降趨勢。說明，pH越高，花色苷降解速度越快，色素在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定。所以浸提溶液為酸性能取得較好的提取效果。當(dāng)pH為4時(shí)，提取液濃度最高。

2.3 葉子花紅色素提取條件的優(yōu)化

2.3.1 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 由表3可知響應(yīng)面試驗(yàn)提取葉子花紅色素各處理的提取液濃度。通過分析，預(yù)測模型為y＝0.16＋2.833×10－3A＋7.0×103B－8.333×10－5C＋4.750×10－3D＋2.750×10－3AB－5.000×10－4AC＋2.500×10－4AD＋6.250×10－3BC＋3.000×10－3BD＋1.500× 10－3CD－0.011A2－0.013B2－4.167×10－3C2－0.012D2

對此回歸模型進(jìn)行方差分析可知，試驗(yàn)所選模型F值為10.05，P＜0.000 1，說明該模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；該回歸模型的決定系數(shù)R2＝0.9214，表明模型具有較高的可信度；葉子花紅色素提取濃度的失擬項(xiàng)P＝0.709 6＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，可見，該模型能夠較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可利用該回歸方程確定最佳提取工藝；該回歸模型的校正系數(shù)Radj＝0.829 8，表明在葉子花紅色素提取濃度總的變異中，有82.98%是由獨(dú)立變量引起；模型擬合程度良好，預(yù)測值與試驗(yàn)值之間有較好的的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小，說明應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化葉子花紅色素的提取模型條件是可行的。

表3 葉子花紅色素提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface test results for extracting red pigment fromB.spectabilis

此外，通過對建立模型進(jìn)行方差分析，因素A、B、C、D的P值分別為0.045 1、0.000 1、0.948 7和0.002 8，B因素極顯著，A和D因素顯著，因此，A、B、C和D 4個(gè)因素對葉子花紅色素提取的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但影響的大小不同，依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度＞料液比。

2.3.2 響應(yīng)曲面交互作用 由圖3可知，三維響應(yīng)面曲線圖較平緩，說明條件增加對葉子花紅色素的提取濃度影響效果不明顯；三維響應(yīng)面曲線圖呈上坡狀，說明隨著條件變化對葉子花紅色素提取濃度影響效果明顯。在交互項(xiàng)對提取濃度的影響中，等高線圖呈橢圓形兩因素交互作用明顯，等高線圖呈圓形，兩因素交互作用不明顯，即提取溫度與提取時(shí)間，提取溫度和料液比，提取溫度和乙醇濃度，提取時(shí)間和乙醇濃度，料液比和乙醇濃度及提取時(shí)間和料液比之間交互作用明顯，與方差分析結(jié)果相一致。

2.3.3 最佳提取工藝的確定 通過Design－Expert.V 8.0對葉子花紅色素提取模型求最大值得到最佳提取工藝條件和葉子花紅色素理論最大提取濃度，其中最佳提取溫度21.68℃、提取時(shí)間67.68min、料液比1∶73.16、乙醇濃度42.64%，在該條件下，理論最大提取濃度為0.161 53mg／mL。為驗(yàn)證葉子花紅色素提取模型方程的適用性，根據(jù)最佳提取工藝條件結(jié)合實(shí)際，對葉子花紅色素最大提取濃度理論值進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)在提取溫度21.5℃、提取時(shí)間67.5min、料液比1∶73、乙醇濃度42.5%條件下重復(fù)試驗(yàn)5次，得到實(shí)際提取液濃度為0.160 3mg／mL。從實(shí)測值看出，接近理論提取率0.161 53mg／mL，說明響應(yīng)面法建立的葉子花紅色素提取數(shù)學(xué)模型對葉子花紅色素提取穩(wěn)定可靠。

圖3 葉子花紅色素提取因素間的等高線圖（左）和響應(yīng)面圖（右）Fig.3 The contour map（left）and response surface figure（right）of various factors

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過對葉子花紅色素提取溶劑的優(yōu)選，確定用50%乙醇提取出的葉子花紅色素的最大可見吸收波長為547nm。并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化溶劑提取葉子花紅色素工藝，經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后提取葉子花紅色素的最佳工藝條件為提取溫度21.9℃，提取時(shí)間67.69min，料液比1∶73.17，乙醇濃度42.64%，在此條件下葉子花提取濃度為0.160 3mg／mL，理論最大提取率為0.161 53mg／mL，與Design－Expert.V8.0分析預(yù)測值相差較小，說明響應(yīng)面法建立的葉子花提取數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠，對實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

［1］邵志芳，楊義標(biāo)，邱少松，等.葉子花花期調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，22（5）：326－328.

［2］葉頂英，張 健.三角梅組織培養(yǎng)外植體再生體系建立研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，22（2）：142－145.

［3］吳淑梅.三角梅的養(yǎng)護(hù)技術(shù)及應(yīng)用初探［J］.廈門科技，2002（4）：60－62.

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（責(zé)任編輯：孫小嵐）

Extraction Process Optimization of Bougainvillea spectabilis Red Pigment by Response Surface Methodology

MO Damei，WU Rongshu＊，PENG Yi
（College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Yunnan，Kunming 650201，China）

To guard the safety of food quality，and gain more natural plant pigment and thus apply in food processing，taking purple B.spectabilis as experimental material，from which red pigment was extracted with ethanol，the effects of extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol concentration on red pigment extraction from B.spectabilis were studied.On the basis of single factor experiment，a response surface experiment was conducted with four factors，including extraction time，extraction temperature，solid－liquid ratio and ethanol concentration at three levels.Then the regression equation of red pigment was established with various influencing factors，and the response surface map and contour map were obtained with red pigment extraction as the response value.Results：The optimum extraction process included extraction temperature 21.68℃，extraction time 67.68min，solid－liquid ratio 1∶73.16（g∶mL）and ethanol concentration 42.64%.Under these conditions the extraction amount of reg pigment reached 0.160 3mg／mL，which was close to the predicted maximum extraction concentration（0.161 53mg／mL）analyzed by Design－Expert.V8.0.6.

Bougainvillea spectabilis；red pigment；response surface methodology；extraction process

S38；TS201.1

A

1001－3601（2016）07－0311－0108－05

2015－11－09；2016－06－21修回

莫大美（1988－），女，在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品深加工。E－mail：18313854180＠163.com

＊通訊作者：吳榮書（1960－），女，教授，從事園藝產(chǎn)品深加工研究。E－mail：283256929＠qq.com