氣質(zhì)聯(lián)用法和MALDI-TOF-MS測(cè)定羥丙基-β-環(huán)糊精平均取代度

張　璟，高保衛(wèi)，蔡崇林，唐光輝，王智輝，吳興元

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/ 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌　712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西楊凌　712100)

氣質(zhì)聯(lián)用法和MALDI-TOF-MS測(cè)定羥丙基-β-環(huán)糊精平均取代度

張璟1，高保衛(wèi)1，蔡崇林1，唐光輝2，王智輝1，吳興元1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心/ 陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西楊凌712100)

摘要為建立氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和基質(zhì)輔助激光電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)測(cè)定羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)平均取代度的方法。對(duì)HP-β-CD先進(jìn)行甲基化反應(yīng)，后將其酸水解為單環(huán)葡萄糖單元，通過(guò)硼氫化鈉還原成鏈狀葡萄糖單元，經(jīng)羥基乙?；?，進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析，計(jì)算平均取代度(DS)，并與MALDI-TOF-MS測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明：利用GC-MS分析測(cè)得的DS為7.0，略高于使用MALDI-TOF-MS測(cè)得結(jié)果(DS=6.6)。GC-MS分析方法靈敏度較高，但是前處理步驟較為繁雜，MALDI-TOF-MS法能夠快速檢測(cè)樣品，2種方法均可提供相關(guān)分析方法依據(jù)。

關(guān)鍵詞羥丙基-β-環(huán)糊精；平均取代度；氣質(zhì)聯(lián)用；MALDI-TOF-MS

羥丙基-β-環(huán)糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HP-β-CD)是β-環(huán)糊精(β-CD) 與1, 2-環(huán)氧丙烷縮合而成的親水性衍生物(圖1)。該分子不具有還原性，在堿性介質(zhì)中很穩(wěn)定，能被強(qiáng)酸分解，與β-CD一樣具有分子包合作用，對(duì)人體無(wú)毒。與β-CD不同的是，HP-β-CD在常溫下水溶性高，在生物體內(nèi)可促使包含物質(zhì)迅速釋放，表面活性、溶血活性低，使用更安全，是目前研究及應(yīng)用最為廣泛的β-CD衍生物。β-CD 的R2、R3和R6上的羥基被羥丙基隨機(jī)取代,生成2-HP-β-CD、2, 3-DiHP-β-CD、2, 6-DiHP-β-CD 及2, 3, 6-TriHP-β-CD 等同系物。取代基數(shù)目對(duì)HP-β-CD物系的物性有重要影響，如溶血性、吸濕性和增溶能力均隨取代度的增大而降低[1-6]。

關(guān)于HP-β-CD平均取代度的測(cè)定方法，目前尚無(wú)可靠和統(tǒng)一的規(guī)范。Schneide等[7]采用核磁共振氫譜和碳譜對(duì) α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精及γ -環(huán)糊精進(jìn)行分析研究；宋元德等[8]建立測(cè)定無(wú)對(duì)照品或者指示劑的HP-β-CD平均取代度的核磁共振氫譜方法；Pitha等[9]和Pitha[10]對(duì)HP-β-CD利用不同方法測(cè)定平均取代度(DS)，用核磁法測(cè)得DS=7，而質(zhì)譜法測(cè)得DS=8.02；郝愛(ài)友等[11]報(bào)道化學(xué)滴定方法測(cè)定HP-β-CD取代度，無(wú)需大型儀器，在一般實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)現(xiàn)平均取代度的測(cè)定；張毅民等[12]用紫外光譜法測(cè)定HP-β-CD平均取代度；張敏等[13]利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)β-CD與環(huán)氧丙烷的反應(yīng)，合成出低取代(取代度< 8)的HP-β-CD。

目前，國(guó)內(nèi)尚無(wú)氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定 HP-β-CD 平均取代度的相關(guān)報(bào)道，本研究采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和MALDI-TOF-MS分析法測(cè)定HP-β-CD的平均取代度，為相關(guān)研究提供一定的方法借鑒。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司)；二甲亞砜，氫氧化鈉，碘甲烷，氯仿，三氟乙酸，氨水，硼氫化鈉，乙酸，甲醇，吡啶，乙酸酐，氯仿，無(wú)水硫酸鈉等均為化學(xué)純；POLARIS QGC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo fisher公司)；AXIMA-CFR plus MALDI-TOF MS基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(日本島津公司)。

圖1　羥丙基-β-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)

1.2HP-β-CD前處理方法

1.2.1HP-β-CD的甲基化參照文獻(xiàn)[9]的方法。稱取100 mg HP-β-CD放入圓底燒瓶中，加入20 mL干燥的二甲亞砜，0.5 g氫氧化鈉粉末，5 mL碘甲烷，用橡皮塞封緊瓶口，在室溫下攪拌反應(yīng)過(guò)夜。然后加入25 mL水，搖勻，再用20 mL×5氯仿提取，合并有機(jī)相，用20 mL水洗滌2次，減壓蒸餾除去溶劑，得淡黃色甲基化產(chǎn)物。

1.2.2甲基化HP-β-CD的水解與還原向HP-β-CD甲基化產(chǎn)物里加入15 mL(2 mol/L)的三氟乙酸，在120 ℃下攪拌回流1 h，然后在50 ℃下用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀蒸干溶劑，再加入10 mL(2 mol/L)的氨水，搖勻以便中和殘存的痕量三氟乙酸。然后加入0.5 g硼氫化鈉和15 mL(2 mol/L)的氨水配成的溶液，在60 ℃下反應(yīng)60 min，降至室溫，加入10 mL乙酸，使混合物通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂以除去其中的NH4+和Na+，通過(guò)離子交換樹(shù)脂的混合物在60 ℃下旋蒸至干，得到的殘余物用適量干燥甲醇溶解，再在60 ℃下旋蒸至干，如此反復(fù)3次以除去殘余的硼，得到的油狀物為水解還原后的鏈狀D-葡萄糖衍生物。

1.2.3乙酰化參照文獻(xiàn)[14-15]的方法。將上述反應(yīng)產(chǎn)物用20 mL吡啶溶解，在0 ℃下加入新蒸的10 mL乙酸酐，加完后用橡皮塞封口，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完畢后在50 ℃下除去溶劑，殘余物用60 mL氯仿溶解，用10 mL飽和食鹽水洗滌3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸干溶劑，得淡黃色油狀物，待測(cè)。

1.3GC-MS分析條件

非極性毛細(xì)管柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：始溫160 ℃，以3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min，載氣為氦氣；離子源溫度：200 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：20∶1；溶劑延遲時(shí)間：3 min；EI源：離子化電勢(shì)70 eV。

1.4MALDI-TOF MS分析條件

采用氮激光儀，激發(fā)波長(zhǎng)337 nm，激光脈沖寬度為3 nm，信號(hào)為激光器單次掃描50次累計(jì)結(jié)果。以α-氰苯-4-羥基肉桂酸(α-CHCA)為基體，將基體與樣品按1 000∶1 摩爾比混合均勻，取1 μL滴于樣品臺(tái)上室溫干燥，送入離子源中。

1.5平均取代度的計(jì)算

GC-MS通過(guò)分子離子峰的峰高和質(zhì)量來(lái)計(jì)算HP-β-CD的DS，具體公式為：

(1)

式中，Hi和Mi分別為每個(gè)分子離子峰的峰高和質(zhì)量，1 135為β-CD分子量。

MALDT-TOF-MS的DS計(jì)算具體公式為：

(2)

2結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

由于待測(cè)物組分比較復(fù)雜，通過(guò)毛細(xì)管色譜柱將單取代、多取代及混合取代等不同取代的β-CD完全分離具有一定難度，對(duì)于這些復(fù)雜成分，適當(dāng)?shù)卣{(diào)整程序升溫速度，可使分離結(jié)果得到改善，但同時(shí)會(huì)使保留時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致峰型變寬，靈敏度降低，分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低實(shí)際檢驗(yàn)的工作效率。為達(dá)到理想分離結(jié)果，本研究通過(guò)調(diào)整程序升溫速度、更換不同極性色譜柱(TR-1MS，TR-5MS，HP-5MS)、改變載氣流速等方法，最終確定色譜分離條件為色譜柱TR-1MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初始溫度160 ℃， 3 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min?？傠x子流色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2GC-MS分析

圖3為HP-β-CD經(jīng)水解、還原和乙?；蟮漠a(chǎn)物，其中的R2、R3和R6分別為和C2、C3、C6通過(guò)醚鍵相連的羥丙基(羥丙基上的羥基在樣品處理的第1步被甲基化)或甲基(未被羥丙基取代的羥基在樣品處理的第1步被甲基化)。

因此，對(duì)上述HP-β-CD經(jīng)水解、還原和乙酰化后的產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析，參考Pitha等[9]和Pitha[10]分析方法并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行一定的修改，對(duì)HP-β-CD分子上羥丙基的取代度以及羥丙基取代在β-CD的葡萄糖單元的C2、C3、C6上的分布情況進(jìn)行分析。

經(jīng)GC-MS分析表明(表1)，無(wú)取代的葡萄糖單元含量為24.4%，單取代的葡萄糖單元含量為53.4%，雙取代的葡萄糖單元含量為20.0%，三取代的葡萄糖單元含量為2.2%，取代位置以2位為主，6位次之，3位最少，同時(shí)還有部分2,3-和2,6-雙取代和少量的2,3,6-三取代，根據(jù)公式(1)計(jì)算得HP-β-CD的DS為7.00。

圖2　總離子流色譜圖

圖3　乙酰化D-葡萄糖醚

2.3MALDI-TOF MS基質(zhì)選擇

為得到更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，減少基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，本研究分別用α-CHCA、芥子酸(SA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)這3種基質(zhì)與HP-β-CD混溶進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)，經(jīng)過(guò)對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)α-CHCA檢測(cè)的效果最好，DHB次之。試驗(yàn)結(jié)果表明：采用不同的基質(zhì)對(duì)HP-β-CD的檢出結(jié)構(gòu)有明顯影響，適當(dāng)?shù)負(fù)Q用不同基質(zhì)進(jìn)行分析，才能確定最佳分析條件。

2.4MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析

從圖4可見(jiàn)，離子1 329.59，1 387.51，1 446.05，1 503.77，1 562.10，1 620.45，1 678.53，1 736.40分別為β-CD(1 135)+23+3×58(羥丙基)，β-CD+23+4×58，β-CD+23+5×58，β-CD+23+6×58，β-CD+23+7×58，β-CD+23+8×58，β-CD+23+9×58，β-CD+23+10×58的離子，即β-環(huán)糊精與三取代、四取代、五取代、六取代、七取代、八取代、九取代、十取代羥丙基分別和鈉的加和離子，且基峰為含有7個(gè)羥丙基的β-環(huán)糊精與鈉的加合離子，根據(jù)公式(2)計(jì)算其HP-β-CD的DS為6.6。

表1　氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定HP-β-CD各取代成分比例

圖4　HP-β-CD的MALDI-TOF質(zhì)譜圖

3結(jié) 論

GC-MS分析方法測(cè)定HP-β-CD平均取代度，需要進(jìn)行樣品前處理。首先，通過(guò)酸水解將其分解為單環(huán)葡萄糖單元，然后通過(guò)硼氫化鈉還原成鏈狀葡萄糖單元，為防止在酸水解時(shí)未被羥丙基化的葡萄糖單元上的羥基和羥丙基上的羥基在酸水解過(guò)程發(fā)生脫羥基反應(yīng)、以及在硼氫化鈉還原時(shí)被還原，在水解之前先用過(guò)量的碘甲烷將HP-β-CD上所有的羥基都保護(hù)起來(lái)，然后進(jìn)行水解和還原。還原成鏈狀的單糖后，由于單糖分子上至少含有2個(gè)羥基，極性大，沸點(diǎn)高，無(wú)法用GC-MS準(zhǔn)確分析，需要用過(guò)量乙酸酐將所有羥基乙?；蟛拍苓M(jìn)行分析。

利用GC-MS分析法測(cè)得的平均取代度略高于MALDI-TOF-MS方法所得結(jié)果，可能是由于GC-MS分析方法通過(guò)分子離子峰的峰高和質(zhì)量計(jì)算HP-β-CD的平均取代度，而樣品中若含有雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致分子離子峰的峰高和質(zhì)量偏大，使得HP-β-CD的平均取代度值偏大。

GC-MS分析方法靈敏度較高，但是前處理步驟較為繁雜，MALDI-TOF-MS方法不需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，能夠快速分析，直接檢測(cè)樣品。2種方法各有優(yōu)勢(shì)，均可為今后相關(guān)研究工作提供分析方法方面的參考依據(jù)。

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Received 2015-05-13Returned2015-07-07

First authorZHANG Jing , female, experimentalist, Ph.D student. Research area:synthesis and analysis of pesticide. E-mail: zhjing008@126.com

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Determination of Average Degree of Substitution of Hydroxypropyl-β-cyclodextrin by Gas Chromatography Mass Spectrometry and MALDI-TOF-MS

ZHANG Jing1, GAO Baowei1, CAI Chonglin1,TANG Guanghui2,WANG Zhihui1and WU Xingyuan1

(1.Shaanxi Research Center of Biopesticide Technology and Engineering , Biorational Pesticide R&D Center Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China;2.College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractGC-MS and matrix-assisted laser desprption-ionization time of flight mass spectro (MALDI-TOF-MS) metry were established to measure degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin. Hydroxypropyl-β-cyclodextrin methylation reaction, then were decomposed into acid hydrolysis monocyclic glucose units by sodium borohydride reduction into chains of glucose units, after hydroxyl acetylation of GC-MS, we calculated the average degree of substitution. We compared it with those gained from the method of MALDI-TOF-MS.The average degree of substitution was 7.0 which was examined by GC-MS,slightly higher than MALDI-TOF-MS with measured results (DS=6.6).GC-MS analysis had high sensitivity, but the pre-treatment step was more complicated. MALDI-TOF-MS detected the sample rapidly, both methods were available to measure the degree of substitution of hydroxypropyl-β-cyclodextrin which can provide a basis for correlation analysis.

Key wordsHydroxypropyl-β-cyclodextrin; Degree of substitution; GC-MS; MALDI-TOF-MS

收稿日期：2015-05-13修回日期：2015-07-07

基金項(xiàng)目：西北農(nóng)林科技大學(xué)大型儀器設(shè)備新功能開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(dysb130307)。

通信作者：高保衛(wèi)，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事農(nóng)藥合成和分析的研究。E-mail:gaobaowei72@163.com

中圖分類號(hào)S482.92；O657.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0945-05

Foundation itemKey Scientific Instrument and Equipment Development Project of Northwest A&F University(No. dysb130307). GAO Baowei, male, experimentalist. Research area: synthesis and analysis of pesticide .E-mail: gaobaowei72@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0920.044.html

第一作者：張璟，女，實(shí)驗(yàn)師，在讀博士，從事農(nóng)藥合成和分析的研究。E-mail:zhjing008@126.com