抗重金屬銅離子單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性

孫　勇,付世杰,秦保亮,王亞楠,姜金慶,王自良

(河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng)453003)

抗重金屬銅離子單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性

孫勇,付世杰,秦保亮,王亞楠,姜金慶,王自良

(河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng)453003)

摘要為制備抗Cu2+的高效價(jià)、敏感、特異的單克隆抗體，采用已合成的銅離子人工抗原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，通過間接ELISA和阻斷ELISA篩選備用小鼠，用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗Cu2+的單克隆抗體。結(jié)果篩選到4株特異性強(qiáng)、靈敏度高的雜交瘤細(xì)胞，其中雜交瘤細(xì)胞株2B8培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)采用間接ELISA檢測為1∶(1.28×103)，用其制備的腹水中抗體效價(jià)為1∶(5.12×105)，該單克隆抗體為IgG1/κ型，對(duì)Cu2+-EDTA的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為29.78 μg/L，與Zn2+-EDTA的交叉反應(yīng)率(CR)為26.0%，與其他金屬螯合物沒有交叉反應(yīng)，表明獲得特異性較好的抗Cu2+的單克隆抗體，可用于銅離子的免疫學(xué)檢測。

關(guān)鍵詞銅離子；單克隆抗體；免疫學(xué)特性

重金屬銅通常以二價(jià)離子形式(Cu2+)存在，通過食物鏈的富集對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生危害，過量的銅會(huì)令動(dòng)物出現(xiàn)惡心、嘔吐、上腹疼痛、急性溶血和腎小管變形等中毒現(xiàn)象，嚴(yán)重者還可導(dǎo)致急性腎衰竭等[1]。由于硫酸銅能促進(jìn)蛋氨酸吸收，對(duì)仔豬生長有促進(jìn)作用，因此飼料中往往添加高銅添加劑，采食高銅飼料的豬糞便中所殘留的銅排入環(huán)境會(huì)對(duì)土壤水源造成污染，因此，對(duì)于銅離子的檢測尤為重要[2]。

檢測銅離子的傳統(tǒng)方法多為物理化學(xué)儀器檢測法，如原子吸收光譜分析法(AAS)、電感耦合等離子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、原子熒光法(AFS)、陽極溶出伏安法(ASV)和X射線熒光光譜法(XRF)等[3]，這些檢測方法雖然靈敏度高、精確性好，但所需儀器價(jià)格昂貴，并且需要專業(yè)培訓(xùn)，往往僅限于實(shí)驗(yàn)室人員操作而不適合大范圍普及。為滿足靈敏度高、特異性強(qiáng)而且簡單快速的檢測需求，免疫分析測定技術(shù)就成為人們檢測重金屬離子的一種重要方法。本研究旨在制備高效價(jià)、敏感、特異的抗Cu2+-EDTA 單克隆抗體，為免疫檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試 劑

CuSO4·5H2O，Alfa Aesar產(chǎn)品，純度98.0%～102.0%；異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)，上海同仁化學(xué)研究所；BSA和OVA，單克隆抗體同種型鑒定試劑盒，Pierce產(chǎn)品；ELISA所用洗液(PBST)為0.01 mol/L、pH 7.4φ(Tween-20)=0.05%的磷酸鹽緩沖液(PBS)；包被液為0.1 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)；封閉液、稀釋液為φ(豬血清)=5%的PBST；酶底物為含TMB的磷酸檸檬酸緩沖液；終止液為2 mol/L的硫酸溶液；試驗(yàn)用水為重蒸去離子水。其他試劑均為AR級(jí)。

RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，HAT、HT培養(yǎng)基，均為Gibco產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)，臺(tái)盼藍(lán)，均為Sigma公司產(chǎn)品；PEG-1500，Roche公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；酚紅，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

免疫抗原Cu2+-ITCBE-BSA和包被抗原Cu2+-ITCBE-OVA由河南科技學(xué)院殘留物檢測實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2儀 器

LDZX-30KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TS100型倒置生物顯微鏡，Nikon公司；Galaxy S型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Biotech公司；725型Thermo Forma超低溫冰箱，Multiskan MK3酶標(biāo)儀，Thermo公司。

1.3動(dòng)物與細(xì)胞

Balb/C小鼠購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院；小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS0由河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物疫病與殘留防控中心實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1 Cu2+-EDTA mAb雜交瘤細(xì)胞株的建立細(xì)胞融合備用小鼠的免疫與選擇：采用背部皮下4點(diǎn)注射法，用Cu2+-ITCBE-BSA免疫6周齡的雌性Balb/C小鼠，根據(jù)免疫蛋白的質(zhì)量濃度，分為低劑量組每只20 μg(0.2 mL)、中劑量組每只60 μg(0.2 mL)和高劑量組每只 100 μg(0.2 mL)，每組5只小鼠。首免間隔4周進(jìn)行第2次免疫，共免5次，最后1次免疫后第10天斷尾采血，間接ELISA檢測血清抗體效價(jià)，阻斷ELISA檢測其抑制效價(jià)。根據(jù)耳標(biāo)號(hào)選擇抗體效價(jià)高、抑制效價(jià)好的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。

細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選：細(xì)胞融合參見文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選。選擇強(qiáng)陽性、抑制效果好、細(xì)胞生長旺盛的孔，用有限稀釋法亞克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并鑒定。

雜交瘤細(xì)胞核型鑒定：雜交瘤細(xì)胞核型鑒定采用秋水仙素阻斷法[5]，取對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞株傳代培養(yǎng)48 h，用終質(zhì)量濃度為0.05～0.1 mg/L 的秋水仙素處理4～6 h，收集細(xì)胞后用低滲KCl處理30 min，固定液固定，滴加細(xì)胞懸液到4 ℃預(yù)冷的載玻片上，室溫自然干燥，用φ=10% 的Giemsa染色，去離子水洗脫，光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。每株計(jì)數(shù)5個(gè)細(xì)胞，記錄染色體數(shù)目并計(jì)算平均值。

雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性檢測：分別將凍存15、30和60 d的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)后取上清液，間接ELISA和阻斷ELISA測定抗體效價(jià)與敏感度，考察雜交瘤細(xì)胞分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性[6]。

1.4.2Cu2+-EDTA mAb的制備及免疫學(xué)特性鑒定Cu2+-EDTA mAb的制備：采用體外培養(yǎng)法[7]和體內(nèi)誘生腹水法[8]獲得抗體，用飽和硫酸銨鹽析法[9]純化后測定IgG的效價(jià)、敏感性、特異性。

同種型鑒定：按試劑盒說明操作。

效價(jià)測定：用間接ELISA測定效價(jià)。

敏感性鑒定：用阻斷ELISA測定Cu2+-EDTA mAb對(duì)不同質(zhì)量濃度Cu2+-EDTA的抑制率，以抑制率B/B0為縱坐標(biāo)，以Cu2+-EDTA質(zhì)量濃度的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，計(jì)算Cu2+-EDTA mAb對(duì)Cu2+-EDTA的IC50。

特異性鑒定：采用交叉反應(yīng)試驗(yàn)，選擇鋅、鉻、鉛、鎘、鈷、鉬、鈣等金屬離子與EDTA的螯合物為抑制劑，用阻斷ELISA測定Cu2+-EDTA mAb對(duì)各抑制物的IC50，以Cu2+-EDTA mAb對(duì)Cu2+-EDTA的IC50和Cu2+-EDTA mAb對(duì)各抑制劑的IC50之比的百分?jǐn)?shù)為其交叉反應(yīng)率(CR)。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞融合備用小鼠的血清效價(jià)和血清敏感性測定結(jié)果

由圖1可知，免疫小鼠血清抗體效價(jià)均達(dá)到1∶104，說明獲得較好的免疫效果，其中3號(hào)小鼠血清抑制效果最好，3號(hào)小鼠血清的抑制曲線回歸方程為y=-37.08x+106.71，R2為0.963 5，IC50為33.8 ng/mL。

圖1　3號(hào)小鼠多抗血清對(duì)Cu2+-EDTA

2.2Cu2+-EDTA mAb雜交瘤細(xì)胞株的建立

雜交瘤細(xì)胞株的篩選：細(xì)胞融合10 d后觀察融合效果，4塊細(xì)胞培養(yǎng)板384孔中，有雜交瘤細(xì)胞克隆形成的有352孔，融合率為91.7%；采用間接ELISA和阻斷ELISA檢測，陽性52孔，陽性率為14.8%；3次亞克隆后篩選出4株雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1F7、2B8、3G5、3D10。

雜交瘤細(xì)胞核型鑒定結(jié)果：小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目為40，NS0染色體數(shù)目為62～68，獲得的4株雜交瘤染色體數(shù)目平均分別為97.2、98.5、98.8和101，平均為98.8。

單克隆抗體同種型鑒定結(jié)果：用mAb同種型試劑盒鑒定，1F7、2B8、3G5、3D10同種型分別為IgG1/κ、IgG1/κ、IgG1/λ、IgG2a/κ。

雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性測定結(jié)果：4株雜交瘤細(xì)胞凍存前細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)與凍存15、30和60 d復(fù)蘇培養(yǎng)后上清效價(jià)基本一致，說明4株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性良好。

2.3Cu2+-EDTA mAb的免疫學(xué)特性鑒定

2.3.1效價(jià)測定由表1可知，雜交瘤細(xì)胞分泌的Cu2+-EDTA mAb具有較高的效價(jià)，2B8株的最高，其細(xì)胞培養(yǎng)液上清和腹水中抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶(1.28×103)和1∶(5.12×105)。

表1　Cu2+-EDTA mAb的抗體效價(jià)檢測結(jié)果

2.3.2敏感性測定由表2可知，4株單抗均有較好的敏感性。由圖2可知，2B8株的敏感性最好，曲線回歸方程為y=-36.916x+104.43，IC50為29.78 μg/L。

表2　Cu2+-EDTA mAb阻斷ELISA抑制曲線的

2.3.3特異性鑒定由表3可知，2B8株mAb對(duì)Cu2+-EDTA的IC50為29.78 μg/L，對(duì)Zn2+-EDTA的IC50為114.56 μg/L，交叉反應(yīng)率為26.0%，與EDTA及其他金屬離子螯合物無交叉反應(yīng)。

圖2　Cu2+-EDTA mAb對(duì)Cu2+-EDTA

化合物CompoundIC50/(μg/L)交叉反應(yīng)率/%Cross-reactivityCu2+-EDTA29.78100EDTA>6.40×103<0.5Zn2+-EDTA114.5626.0Cr2+-EDTA>3.20×103<0.9Pb2+-EDTA>6.40×103<0.5Cd2+-EDTA>3.20×103<0.9Co2+-EDTA>3.20×103<0.9Mo2+-EDTA>6.40×103<0.5Ca2+-EDTA>6.40×103<0.5

3討 論

3.1細(xì)胞融合備用小鼠的選擇

對(duì)于抗銅離子的人工抗原，不同的免疫劑量對(duì)小鼠的免疫效果有不同的影響，劑量過小無法刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，劑量過大會(huì)引起小鼠的應(yīng)激反應(yīng)，甚至產(chǎn)生腫瘤。本試驗(yàn)分別選擇低劑量每只20 μg、中劑量每只60 μg、高劑量每只100 μg免疫小鼠，結(jié)果表明，低劑量免疫組的免疫效果最好，而高劑量免疫組中，5只小鼠有2只出現(xiàn)腫瘤。李俊鎖等[10]和Cooper等[11]的研究也表明，小劑量、長間隔是免疫首選方案。本試驗(yàn)選擇每只20 μg的免疫劑量、4周的免疫間隔，得到很好的免疫效果。

3.2雜交瘤細(xì)胞株的篩選

可靠的雜交瘤細(xì)胞篩選體系一般有3個(gè)要求，一是能準(zhǔn)確測定上清效價(jià)，二是避免橋抗體的影響，三是能確定mAb的敏感性[12]。本試驗(yàn)采用間接ELISA和阻斷ELISA同時(shí)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，以Cu2+-ITCBE-OVA作為包被原，間接ELISA測定上清效價(jià)，以Cu2+-EDTA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用阻斷ELISA確定陽性雜交瘤，可以簡便地篩選出效價(jià)高、無橋抗體、敏感性強(qiáng)的目的雜交瘤細(xì)胞株。

3.3交叉反應(yīng)

Love等[13]認(rèn)為，螯合劑通過化學(xué)鍵與金屬離子螯合，不同的金屬離子使螯合劑構(gòu)型發(fā)生不同的改變，這是決定抗原抗體識(shí)別的重要因素。Jones等[14]采用距離矩陣法發(fā)現(xiàn)Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA的三維結(jié)構(gòu)差異最小，認(rèn)為這是產(chǎn)生交叉反應(yīng)的主要原因。郭常偉等[15]制備的抗Cu2+單克隆抗體，也與Zn2+出現(xiàn)較強(qiáng)的交叉反應(yīng)。本試驗(yàn)中Cu2+-EDTA mAb與Zn2+-EDTA交叉反應(yīng)率為26.0%，可能是因?yàn)殂~與鋅分子質(zhì)量接近，離子半徑接近，價(jià)態(tài)一樣所致。

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Received 2016-01-15Returned2016-03-07

First authorSUN Yong, male, master student. Research area: the food safety of animal biotechnology.E-mail:412061790@qq.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Preparation and Immunology Character of Monoclonal Antibody of Heavy Metal Ion Copper

SUN Yong, FU Shijie, QIN Baoliang, WANG Yanan,JIANG Jinqing and WANG Ziliang

(College of Animal Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang Henan453003, China)

AbstractTo produce efficient, sensitive and specific monoclonal antibody, the experimental mouse was selected from the composited Cu2+-ITCBE-BSA to immunize Balb/C mouse by the means of indirect ELISA and blocking ELISA, and monoclonal antibody was prepared by cell fusion technology. The results showed that four hybridoma cell lines characterized as powerful specificity and high sensitivity were obtained. The indirect ELISA titers of 2B8 were 1∶(1.28×103) in supernatant and 1∶(5.12×105) in ascites. The isotype of the 2B8 mAb was IgG1/κ. The Cu2+-EDTA-mAb showed that the IC50of mAb to Cu2+-EDTA was 29.78 μg/L, 26.0% cross-reactivity to Zn2+-EDTA and little or no cross-reactivity with other compounds. The prepared monoclonal antibody of Cu2+-EDTA can be used for immunoassay of Cu2+.

Key wordsCopper ion；Monoclonal antibody；Immunological properties

收稿日期：2016-01-15修回日期：2016-03-07

基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃(2011BAK10B01)。

通信作者：王自良,男,教授,研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品安全生物技術(shù)。E-mail:wangziliang1966@163.com

中圖分類號(hào)TS2071.3;S859.84

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0836-05

Foundation itemThe “12th Five-year Plan” National Science and Technology Support Program(No.2011BAK10B01). WANG Ziliang, male, professor. Research area: the food safety of animal biotechnology. E-mail:wangziliang1966@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.014.html

第一作者：孫勇,男,碩士研究生,研究方向?yàn)閯?dòng)物性食品安全生物技術(shù)。E-mail:412061790@qq.com