產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及應(yīng)用

李偉杰，于建慧，魏財(cái)文，蔣桃珍

(1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京　100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，北京　100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及應(yīng)用

李偉杰1，于建慧2，魏財(cái)文1，蔣桃珍1

(1．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，北京100081)

摘要根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA設(shè)計(jì)并合成4對特異性引物，建立快速鑒定產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型的多重PCR方法。結(jié)果顯示:產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D和E型參考菌株均擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，而肉毒梭菌、氣腫疽梭菌、腐敗梭菌、諾維梭菌的擴(kuò)增均為陰性；將產(chǎn)氣莢膜菌株單個菌落稀釋100倍，仍能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。利用此多重PCR方法對16株不同動物來源的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分型鑒定，并與毒素中和試驗(yàn)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示2種方法具有較高的符合率。該方法可有效進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測和分型，對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染與食品安全問題的研究具有參考價值。

關(guān)鍵詞產(chǎn)氣莢膜梭菌；菌落多重PCR；毒素分型

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)廣泛存在于土壤、人和動物的腸道中，在一定條件下可引起人和動物的多種嚴(yán)重疾病。截止目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素至少已發(fā)現(xiàn)19種，其中α、β、ε和ι為主要致死毒素，傳統(tǒng)上以這4種毒素的產(chǎn)生情況將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A(α)、B(α、β、ε)、C(α、β)、D(α、ε)和E(α、ι)5個類型[1-3]。A型菌株主要引起人食物中毒，禽壞死性腸炎，人和動物氣性壞疽，駒、犢牛、羊、新生羊駝、野山羊、馴鹿、仔豬、犬、家兔腸炎和腸毒血癥；B型菌株主要引起羔羊痢疾，駒、犢牛、羔羊、綿羊和山羊的腸毒血癥或壞死性腸炎；C型菌株主要引起人、禽壞死性腸炎，駒、仔豬、羔羊、犢牛、綿羊、山羊壞死性腸毒血癥，綿羊猝狙，仔豬血?。籇型菌株引起羔羊、綿羊、山羊、牛、馬以及灰鼠的腸毒血癥，山羊小腸結(jié)腸炎；E型菌株可致犢牛、羔羊腸毒血癥[4]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌分型是該菌鑒定的一個重要方面，在利用已建立的多重PCR方法[5]進(jìn)行分型中發(fā)現(xiàn)，部分菌株α毒素不能有效擴(kuò)增，從而影響鑒定結(jié)果。因此，本研究設(shè)計(jì)合成1對針對α毒素的特異性引物，與其他3種毒素特異性引物建立產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分型的多重PCR檢測方法，并對16株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證，以期達(dá)到對產(chǎn)氣莢膜梭菌快速分型的目的。

1材料與方法

1.1菌 株

產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D和E型5株參考菌株，產(chǎn)氣莢膜梭菌16株國內(nèi)分離株，均由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供，具體信息見表1。肉毒梭菌(CVCC60352)、氣腫疽梭菌(CVCC60001)、腐敗梭菌(CVCC60021)和諾維梭菌(CVCC60281)分別分離自肉毒中毒山羊、氣腫疽羊、快疫羊和黑疫湖羊，由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2菌株的培養(yǎng)

將凍干保存的產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、氣腫疽梭菌、腐敗梭菌、諾維梭菌用適量的厭氣肉肝湯復(fù)原溶解，接種厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜。吸取適量培養(yǎng)物滴加到含2 g/L葡萄糖的TSA平皿上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已公布的α毒素基因序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成。參照文獻(xiàn)[7]，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成3對針對β、ε和ι毒素編碼的特異性引物。將各引物濃度稀釋至10 μmol/L，置-20 ℃保存，備用。引物見表2。

表1　產(chǎn)氣莢膜梭菌信息[6]

注：1表示中和試驗(yàn)結(jié)果；2表示產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株。

Note:1 means the results of the neutralization test;2 means the reference strains ofC.perfringens.

表2　產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因檢測引物

1.4多重PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

挑取參考菌株的單菌落為模板，設(shè)置引物濃度梯度，分別對產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D和E型的參考菌株進(jìn)行毒素?cái)U(kuò)增；將產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株B型和E型菌落混合后，設(shè)置溫度梯度，分別對產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)電泳檢測結(jié)果，優(yōu)化建立多重PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序。

1.5敏感性檢測

分別隨機(jī)挑取產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和E型參考菌株的單菌落混合溶于10 μL滅菌雙蒸水后，進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個稀釋度分別取1 μL稀釋液作為模板，采用優(yōu)化后的多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增。

1.6特異性檢測

利用建立的多重PCR方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌各型參考菌株、肉毒梭菌、氣腫疽梭菌、腐敗梭菌、諾維梭菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測其特異性。

1.7多重PCR的應(yīng)用

取16株產(chǎn)氣莢膜梭菌國內(nèi)分離株，利用建立的多重PCR方法進(jìn)行毒素分型，并與毒素中和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

2結(jié)果與分析

2.1多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的確定

根據(jù)引物濃度梯度和退火溫度梯度的結(jié)果，以條帶較亮、試劑用量較少為原則，確定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，得多重PCR反應(yīng)體系為10 ×ExTaqBuffer(含Mg2+25 mmol/L)5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，引物(10 μmol/L)各2 μL，ExTaq酶(5 U/μL)0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。多重PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2多重PCR敏感性檢測結(jié)果

將B型和E型2菌株隨機(jī)挑取的單菌落混合后10倍系列稀釋作為模板，按照“2.1”中的多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，由圖1可知，該方法對B型和E型菌株單菌落各稀釋100倍后仍能觀察到目的條帶。

M.DL2000 DNA Maker; 1～4.10～103倍稀釋10～103times dilution; CK.陰性對照Negative control

圖1多重PCR敏感性檢測結(jié)果

Fig.1Sensitivity results of multiplex PCR

2.3多重PCR特異性檢測結(jié)果

利用建立的多重PCR方法對產(chǎn)氣莢膜梭菌各型參考菌株、肉毒梭菌、氣腫疽梭菌、腐敗梭菌、諾維梭菌進(jìn)行毒素PCR擴(kuò)增。由圖2可知，5株產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌株均能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，其中CVCC37擴(kuò)增片段約為400 bp，CVCC53擴(kuò)增片段約為200、400和660 bp，CVCC57擴(kuò)增片段約為200 bp和400 bp，CVCC82擴(kuò)增片段約為400 bp和660 bp，CVCC90擴(kuò)增片段約為400 bp和450 bp，而肉毒梭菌、氣腫疽梭菌、腐敗梭菌、諾維梭菌均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。

M.DL2000 DNA Maker; 1.CVCC37; 2.CVCC53; 3.CVCC57; 4.CVCC82; 5.CVCC90; 6.CVCC60352;7.CVCC60001; 8.CVCC60021; 9.CVCC60281; CK.陰性對照Negative control

圖2多重PCR特異性檢測結(jié)果

Fig.2Specificity results of multiplex PCR

2.3多重PCR檢測方法的應(yīng)用

利用所建立的多重PCR檢測方法對中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保藏的16株不同來源、不同毒素型的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行鑒定(圖3)，結(jié)果表明：CVCC38、CVCC39、CVCC40、CVCC41、CVCC42和CVCC43為毒素A型；CVCC54為毒素B型；CVCC58、CVCC59、CVCC62、CVCC64和CVCC1159為毒素C型；CVCC81、CVCC84和CVCC1168為毒素D型。PCR檢測方法與中和試驗(yàn)結(jié)果相比有很高的符合率，16株菌株2種方法的符合率為100%。

3討 論

1892年，產(chǎn)氣莢膜梭菌首先報道[7]，1964年，中國首次從患紅痢仔豬中分離出該菌[8]。近年來，由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羔羊痢疾、仔豬紅痢、家禽的壞死性腸炎、犢牛和羊腸毒血癥等疾病的流行面積不斷擴(kuò)大，給畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。要做到有效的預(yù)防，注射針對不同毒素型合適疫苗是十分必要的，因此，對疫區(qū)流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素分型的調(diào)查研究是非常必要。通常采用的定型主要是通過毒素中和試驗(yàn)來確定，中和試驗(yàn)前需要進(jìn)行菌株所產(chǎn)毒素的滴定，而產(chǎn)氣莢膜梭菌不同的毒素其產(chǎn)毒條件不盡相同，對培養(yǎng)基的要求也不同，只有在最佳產(chǎn)毒條件下所產(chǎn)生的毒素進(jìn)行中和試驗(yàn)才可能準(zhǔn)確[9]。因此，利用動物體內(nèi)毒素中和試驗(yàn)對未知菌株進(jìn)行定型是非常費(fèi)力、費(fèi)時的。隨著PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疾病的診斷，快速、敏感、特異的檢測方法不斷產(chǎn)生[10-11]。本試驗(yàn)中建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落多重PCR方法不需要提取細(xì)菌DNA或制備細(xì)菌的裂解液，直接以菌落為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，省去增菌和提取DNA的步驟；另外本方法不涉及毒素產(chǎn)生條件的控制，極大地縮短了試驗(yàn)時間，且與中和試驗(yàn)結(jié)果相比具有很高的符合率，與傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)相比，具有高效、便捷及成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。

M.DL2 000 DNA Maker; CK.陰性對照Negative control ; 1.CVCC81; 2.CVCC84; 3.CVCC1168;4.CVCC58; 5.CVCC59; 6.CVCC62; 7.CVCC64; 8.CVCC1159; 9.CVCC3831; 10.CVCC54;11.CVCC38; 12.CVCC39; 13.CVCC40; 14.CVCC41; 15.CVCC42; 16.CVCC43

圖316株產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR擴(kuò)增

Fig.3Multiplex PCR amplification of 16C.perfringens

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Received 2015-04-09Returned2015-05-10

First authorLI Weijie,male,associate research fellow.Research area:veterinary microbiology and biological product.E-mail: weijielee@163.com

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Establishment and Application of Colony Multiplex PCR Assay for ToxinotypingClostridiumperfringens

LI Weijie1，YU Jianhui2，WEI Caiwen1and JIANG Taozhen1

(1.China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing100081,China;2.China Agricultural Science and Technology Press,Beijing100081,China)

AbstractAccording to the genes(cpa,cpb,etx,and iA) encoding four major toxins(α,β,ε,ι) of C.perfringens,four primers were designed and the colony multiplex PCR were established.The expected sequences were obtained successfully from C.perfringens reference strains including A,B,C,D and E by the multiplex PCR assay.However,the sequences were not amplified from C.botulinum,C.chauvoei,C.septicum and C.novyi.The expected sequences were obtained from C.perfringens single colony when diluted to 100 times.Sixteen C.perfringens strains isolated from different animals were toxinotyped by the multiplex PCR assay,and the results were compared with the results of toxins neutranization test in mice.The two assays showed good accordance.The established colony multiplex PCR can rapidly detect and toxinnotype C.perfringens effectively,which can be referred for the future study on C.perfringens infection in animal and food safety issue.

Key wordsClostridium perfringens;Colony multiplex PCR; Toxinotype

收稿日期：2015-04-09修回日期：2015-05-10

基金項(xiàng)目：國家微生物資源平臺項(xiàng)目(NIMR-5)。

通信作者：蔣桃珍，女，研究員，主要從事禽病研究。E-mail：jiangtaozhen@ivdc.org.cn

中圖分類號S855.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)06-0823-05

Foundation itemNational Science and Technology Infrastructure(No.NIMR-5). JIANG Taozhen,female,research fellow.Research area: poultry disease.E-mail: jiangtaozhen@ivdc.org.cn

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.010.html

第一作者：李偉杰，男，副研究員，主要從事獸醫(yī)微生物及生物制品研究。E-mail：weijielee@163.com