奶牛生乳中洛菲不動(dòng)桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

林　杰，王旭榮，王　磊，王海瑞，朱永剛，楊志強(qiáng)，李建喜，張景艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州　730050)

奶牛生乳中洛菲不動(dòng)桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

林杰，王旭榮，王磊，王海瑞，朱永剛，楊志強(qiáng)，李建喜，張景艷

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州730050)

摘要對(duì)29份外觀正常的奶牛生乳乳樣進(jìn)行乳品質(zhì)分析和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，利用16S rDNA序列分析鑒定乳樣中分離的菌株，并進(jìn)行14種藥物的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，10份乳樣有細(xì)菌檢出，其中4份乳樣中分離得到洛菲不動(dòng)桿菌；藥物敏感性結(jié)果表明，洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)復(fù)方新諾明具有較強(qiáng)的耐藥性；乳品質(zhì)分析結(jié)果表明，該4份乳樣體細(xì)胞數(shù)(SCC)偏高，乳成分和部分理化性質(zhì)與其他正常乳無(wú)明顯區(qū)別。

關(guān)鍵詞洛菲不動(dòng)桿菌；鑒定；耐藥性；乳品質(zhì)

洛菲不動(dòng)桿菌屬于不動(dòng)桿菌屬，在自然界廣泛分布，是重要的機(jī)會(huì)致病菌，且致病性較強(qiáng)，其致病的報(bào)道[1]多見(jiàn)于人醫(yī)，如急性腸炎、呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、肺炎、肺膿腫、心內(nèi)膜炎、生殖泌尿道感染、傷口及皮膚感染等。在人醫(yī)領(lǐng)域，院內(nèi)不動(dòng)桿菌感染已經(jīng)得到一定重視，并有相關(guān)的跟蹤研究。在養(yǎng)殖業(yè)中，盡管已有洛菲不動(dòng)桿菌引發(fā)畜禽感染的報(bào)道[2-3]，但并未引起相關(guān)人員的關(guān)注與重視。鑒于洛菲不動(dòng)桿菌引起的感染一般較為嚴(yán)重，且容易獲得耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)該對(duì)洛菲不動(dòng)桿菌給予一定關(guān)注。

該研究從西安某奶牛場(chǎng)的29份生乳乳樣中分離得到4株洛菲不動(dòng)桿菌，考慮到其分離率偏高，對(duì)該4株菌進(jìn)行藥物敏感性分析，并對(duì)該4份乳樣的乳品質(zhì)及部分理化性質(zhì)與其他25份乳樣進(jìn)行分析比較。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣品采集2015年4月于西安某奶牛場(chǎng)選擇健康奶牛29頭，乳房外觀正常，棄去頭3把奶后，乳頭用碘伏和φ=75%酒精消毒，觀察乳汁外觀正常后，無(wú)菌收集4個(gè)乳區(qū)的混合乳樣，密封并做好標(biāo)記，于冷藏箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑營(yíng)養(yǎng)肉湯、血瓊脂平板購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭氏染液購(gòu)自南京建成科技有限公司；Bacterial DNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA BIO-TEK公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3主要儀器體細(xì)胞分析儀(FossomaticTMMinor )，乳成分分析儀(MikoScanTMFT 120)。

1.1.4藥敏紙片種類(lèi)及抗生素劑量美洛西林(75 μg)、哌拉西林(100 μg)、替卡西林(75 μg)、頭孢吡肟(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢曲松(30 μg)、亞胺培南(10 μg)、美羅培南(10 μg)、慶大霉素(10 μg)、阿米卡星(30 μg)、四環(huán)素(30 μg)、復(fù)方新諾明(1.25/23.75)、環(huán)丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)均購(gòu)自O(shè)XOID。

1.2方 法

1.2.1細(xì)菌分離與純化將待檢乳樣搖勻，無(wú)菌操作，吸取10 μL乳汁均勻涂布于血瓊脂平板上，分別在有氧、37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)培養(yǎng)18～24 h無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的血瓊脂平板延長(zhǎng)至48 h。挑取細(xì)菌單菌落進(jìn)行涂片固定，革蘭氏染色，鏡檢。根據(jù)染色結(jié)果，挑取典型單菌落純化培養(yǎng)，細(xì)菌純凈后保存，備用。

1.2.216S rDNA序列分析將細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h。按照試劑盒操作說(shuō)明提取被檢細(xì)菌的DNA，并以此DNA為模板，用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit中的Forward Primer 和Reverse Primer 擴(kuò)增16S rDNA片段。擴(kuò)增片段送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，通過(guò)NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/)在線BLAST軟件對(duì)獲取的序列進(jìn)行搜索比對(duì)，并確定細(xì)菌種屬。

1.2.3乳成分與理化性質(zhì)分析應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件 SAS V8分析比較含有洛菲不動(dòng)桿菌的4份乳樣和其他25份乳樣中體細(xì)胞數(shù)、乳成分和部分理化性質(zhì)的差異。

1.2.4藥物敏感性分析參考《CLSI的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)2013》，采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法測(cè)定分離菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。每株菌3個(gè)重復(fù)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取3個(gè)重復(fù)的平均值。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI，2013)推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，按抑菌圈直徑大小將細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性分為：耐藥(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離結(jié)果

被檢乳樣29份中有10份檢出細(xì)菌，其中4份分離得到4株洛菲不動(dòng)桿菌，在血平板上的菌落形態(tài)是：黃白色，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊，染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性球桿菌(圖1)。

圖1　革蘭氏染色鏡檢(×100)

2.216S rDNA序列分析結(jié)果

以提取的細(xì)菌DNA為模板，用16S rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒擴(kuò)增16S rDNA片段，片段長(zhǎng)度略大于500 bp(圖2)。序列比對(duì)結(jié)果表明，與洛菲不動(dòng)桿菌(KR054982.1)相似度為99%，確定分離菌株為洛菲不動(dòng)桿菌。

M. DL2000 DNA maker;L1～L4.菌株編號(hào)Strain number

圖2分離菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增

Fig.2Products of 16S rDNA of isolates

2.3乳成分與理化性質(zhì)分析結(jié)果

29份乳樣體細(xì)胞數(shù)分布見(jiàn)圖3，體細(xì)胞數(shù)小于2×105mL-1的乳樣占樣本量的58.62%；小于3×105mL-1的乳樣占樣本量的65.52%。含有洛菲不動(dòng)桿菌的乳樣中，1份體細(xì)胞數(shù)為2.62×105mL-1，其余3份乳樣體細(xì)胞數(shù)變幅為3×105～4×105mL-1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(表1)，分離出洛菲不動(dòng)桿菌的乳樣的體細(xì)胞數(shù)明顯高于其他乳樣的平均水平；乳成分分析結(jié)果表明，總固形物、乳脂率偏低，但差異較?。焕砘再|(zhì)分析結(jié)果差異不明顯。

圖3　體細(xì)胞數(shù)分布

2.4藥敏試驗(yàn)結(jié)果

健康牛牛乳中分離得到的洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)抗生素的耐藥性較低，僅對(duì)復(fù)方新諾明具有較強(qiáng)耐藥性(圖4)。

表1　乳成分與理化性質(zhì)統(tǒng)計(jì)±s)

S.敏感　Sensitive; I.中度敏感　Intermediate; R.耐藥　Resistant

3討論與結(jié)論

不動(dòng)桿菌是非發(fā)酵糖類(lèi)、專性需氧、氧化酶陰性、無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞、不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌，其中鮑曼不動(dòng)桿菌和洛菲不動(dòng)桿菌是代表菌種，是重要的機(jī)會(huì)致病菌。洛菲不動(dòng)桿菌不僅能引起多種院內(nèi)感染，同樣能夠?qū)е聞?dòng)物的不同感染。引起動(dòng)物感染的報(bào)道涉及奶牛子宮內(nèi)膜炎[2]、仔豬肺部感染、新生駒敗血癥[3]、馬流產(chǎn)[4]、兔急性感染[5]、大鼠的胃炎、高位泌素血癥[6]、蛙的傳染性抽搐癥[7]、鸚鵡的呼吸道感染[8]以及鴿子的關(guān)節(jié)炎[9]等，說(shuō)明洛菲不動(dòng)桿菌感染涉及大型家畜、嚙齒類(lèi)、兩棲類(lèi)以及禽類(lèi)，其種屬分布范圍廣，且引起的感染均較嚴(yán)重。本試驗(yàn)共29份乳樣，有4份乳樣分離得到洛菲不動(dòng)桿菌，而奶牛乳房炎主要病原菌——大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的分離率為0，表明乳樣中洛菲不動(dòng)桿菌的分離率較高，且引起體細(xì)胞數(shù)的升高，故可以推測(cè)，該菌有引起奶牛乳房炎的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)給予一定的關(guān)注。

生乳是從符合國(guó)家有關(guān)要求的奶畜乳房中擠出的無(wú)任何成分改變的常乳。中華人民共和國(guó)發(fā)布的“GB19301-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)生乳中體細(xì)胞數(shù)未作出明確限定，通過(guò)咨詢了解到，目前西北地區(qū)不同生乳收購(gòu)站對(duì)生乳體細(xì)胞數(shù)要求不同，一般要求低于3×105mL-1或4×105mL-1，臨床認(rèn)為體細(xì)胞數(shù)大于4×105mL-1或5×105mL-1時(shí)，多判定為患有隱性乳房炎。本試驗(yàn)可以看出，若排除4份體細(xì)胞數(shù)大于4×105mL-1的乳樣后，含有洛菲不動(dòng)桿菌的乳樣體細(xì)胞數(shù)明顯高于試驗(yàn)中其他正常乳樣體細(xì)胞數(shù)的平均值。所以，洛菲不動(dòng)桿菌引起生乳體細(xì)胞數(shù)增高會(huì)影響生乳的質(zhì)量，甚至影響其銷(xiāo)售。

本次乳品質(zhì)檢測(cè)過(guò)程中分離的洛菲不動(dòng)桿菌耐藥性不高，對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，與已有多數(shù)報(bào)道結(jié)果一致[10-11]。部分醫(yī)院內(nèi)洛菲不動(dòng)桿菌對(duì)青霉素、頭孢類(lèi)以及復(fù)方新諾明的耐藥性基本達(dá)到50%以上，存在多重耐藥現(xiàn)象，且耐藥率上升較快，某醫(yī)院報(bào)道[12]其多重耐藥菌分離率經(jīng)過(guò)2 a時(shí)間就從9.5%上升至23.2%。洛菲不動(dòng)桿菌現(xiàn)已成為“超級(jí)耐藥菌的潛在菌群”[13-14]。由于部分奶牛場(chǎng)存在抗生素濫用問(wèn)題，國(guó)內(nèi)需要對(duì)牛場(chǎng)內(nèi)的洛菲不動(dòng)桿菌進(jìn)行必要的監(jiān)測(cè)，并對(duì)其藥物敏感性進(jìn)行跟蹤。

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Received 2015-12-18Returned2016-01-08

First authorLIN Jie,female,master student. Research area:prevention and control of animal disease. E-mail qielinjie2009@163.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Identification and Drug-resistance Analysis ofAcinetobacterlwoffiiIsolated from Dairy Raw Milk

LIN Jie,WANG Xurong,WANG Lei,WANG Hairui,ZHU Yonggang,YANG Zhiqiang,LI Jianxi and ZHANG Jingyan

(Engineering&Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province,Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730050,China)

AbstractIn this study,29 samples of dairy raw milk milk with normal appearance were tested for the milk quality and the bacteriology inspection. The bacteria was isolated from the normal milk sample and identificated by the 16S rDNA sequence analysis,and then,the sensitivity test of 14 kinds of antibiotics was performed. The results showed that among 29 milk samples,10 milk samples contained bacteria,and Acinetobacter lwoffii was isolated from 4 milk samples. The sensitive of antibiotics test indicated that Acinetobacter lwoffii was resistant to cotrimoxazole. The milk composition showed that these 4 milk samples had higher somatic cell count(SCC)than the other samples,while the other composition and the physical and chemical properties were similar to other milk samples.

Key wordsAcinetobacter lwoffii; Identification; Drug-resistance; Milk quality

收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-01-08

基金項(xiàng)目：“948”項(xiàng)目(2014-Z9)；國(guó)家奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-37-06)；公益性行業(yè)專項(xiàng)(20130304)。

通信作者：張景艷，女，助理研究員，研究方向?yàn)橹蝎F醫(yī)藥學(xué)與免疫學(xué)。E-mail:ZWZh1223@126.com

中圖分類(lèi)號(hào)S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)06-0811-05

Foundation item“948” Project(No.2014-Z9); Dairy Industry Technology and Systems Projects (No.CARS-37-06); Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (No.20130304). ZHANG Jingyan,female,assistant research fellow. Research area:Chinese veterinarian medicine and immunology.E-mail：ZWZh1223@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160601.0914.006.html

第一作者：林杰，女，碩士研究生，從事動(dòng)物疾病預(yù)防與控制相關(guān)研究。E-mail：qielinjie2009@163.com