釀酒前后黑莓籽油提取工藝優(yōu)化及差異分析

馮曉慧，關(guān) 鑫，畢海丹，呂 慧，張立華，金 婷*

（棗莊學(xué)院 食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院，山東 棗莊 277160）

黑莓酒是以黑莓為原料經(jīng)過微生物發(fā)酵而成的低度飲料酒，其最大限度地保留了黑莓果實(shí)中的營養(yǎng)成分和保健功能因子，長期飲用具有美容養(yǎng)顏、降血壓、降血脂、保護(hù)血管、減緩衰老等功效[1]。黑莓渣是黑莓酒加工的主要副產(chǎn)物，常被作為廢物丟棄造成浪費(fèi)。黑莓渣中含有花色苷[2]、多糖[3]、抗氧化物質(zhì)[4]、原花青素[5]、黃酮與多酚類[6]及黑莓籽油[7]等成分。其中黑莓籽約占黑莓渣的80%左右，而油脂含量占其干質(zhì)量的15%～23%。黑莓籽油中富含亞油酸，油酸和棕櫚酸等不飽和脂肪酸[8]，具有較高的藥用價(jià)值及保健作用。目前對(duì)新鮮的黑莓籽油成分檢測較多，對(duì)于酒渣黑莓籽油檢測研究較少。

提取黑莓籽油常用的方法有壓榨法[9]、溶劑浸提法[10]、超聲波輔助溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法等[11]。壓榨溶劑浸提等傳統(tǒng)方法物耗高、時(shí)間長、收率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大；超聲波輔助提取所需時(shí)間較長，而超臨界流體萃取由于設(shè)備復(fù)雜、運(yùn)行成本高、提取范圍有限等缺點(diǎn)使其應(yīng)用受到限制。微波萃取利用微波快速加熱的特性[12]，并結(jié)合傳統(tǒng)溶劑提取法而形成的一種針對(duì)固體樣品成分提取的新萃取技術(shù)，具有快速、節(jié)省溶劑、加熱均勻，能量利用率高等優(yōu)點(diǎn)[13]。

本試驗(yàn)采用微波輔助提取法提取黑莓渣中的油脂，運(yùn)用主成分分析（principal component analysis，PCA）與響應(yīng)面試驗(yàn)相結(jié)合，對(duì)黑莓籽油提取工藝條件進(jìn)行綜合研究，并利用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）對(duì)所提取的黑莓籽油中脂肪酸的種類和含量進(jìn)行測定，分析酒渣黑莓籽中所提取的油脂與跟新鮮黑莓籽油的差別，為黑莓酒釀造副產(chǎn)物再利用的研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒渣黑莓籽：釀造黑莓酒剩余酒渣中的黑莓籽；新鮮黑莓籽：新鮮黑莓用原汁機(jī)去除果汁，取果渣中的黑莓籽；

石油醚（30～60 ℃）、甲醇、氫氧化鉀、苯（均為分析純），無水硫酸鈉（分析純）：德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XH-200A微波萃取儀：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；V82原汁機(jī)：九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑莓籽油的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

黑莓籽清洗→干燥→粉碎→稱取→與有機(jī)溶劑混合→微波萃取→離心取濾液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→干燥→黑莓籽油

操作要點(diǎn)：將黑莓籽洗凈，放入40～45 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定后粉碎、過篩，稱取5 g黑莓籽粉于錐形瓶中，加入一定比例的石油醚，于微波萃取儀中進(jìn)行微波輔助萃取。萃取后以4 000 r/min離心分離上清與殘?jiān)?，洗滌殘?jiān)?～3次，合并上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸餾，100 ℃干燥至質(zhì)量恒定，得到黑莓籽油，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 黑莓籽油提取率的計(jì)算

黑莓籽油提取率計(jì)算公式如下：

式中：m1為圓底燒瓶和黑莓籽油的質(zhì)量，g；m2為圓底燒瓶的質(zhì)量，g；m為干燥黑莓籽粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 微波輔助提取單黑莓籽油因素試驗(yàn)

設(shè)定料液比1∶10（g∶mL）、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間5 min、微波功率500 W、提取次數(shù)3次、粉碎粒度60目為微波提取條件，分別考察提取溶劑（石油醚、乙醇、乙醚、正己烷）、料液比（1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12）（g∶mL）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、提取時(shí)間（4 min、5 min、6 min、7min、8min）、微波功率（300W、400W、500W、600W、700W）、提取次數(shù)（1次、2次、3次、4次、5次）、過篩目數(shù)（30目、40目、50目、60目、70目）對(duì)黑莓籽油提取率的影響，并通過主成分分析選出3個(gè)主要成分進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化黑莓籽油提取條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合主成分分析所得結(jié)果，選擇提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）3個(gè)因素為自變量，以提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)各因素編碼取值見表1。

表1 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis for blackberryseed oil extraction conditions optimziation

1.3.5 脂肪酸成分分析

（1）脂肪酸的甲基化

取黑莓籽油30 μL置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入石油醚與苯體積比為1∶1的混合液，振搖使油脂溶解后，再加入1 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻后在室溫條件下靜置30 min[14]，加入蒸餾水，靜置取上清液，加少量無水硫酸鈉干燥，取干燥后的上層清液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液進(jìn)行GC-MS分析。

（2）氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱。升溫程序：由室溫升至100 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量0.2 μL；載氣：氦氣（He），流速：1 mL/min。分流比：20∶1；溶劑延遲3 min。

（3）質(zhì)譜條件

離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源掃描溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；倍增器電壓：1 376 V；電子能量：70 eV，發(fā)射電流：34.6 μA；接口溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：50～550 m/z。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行主成分分析。利用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，從而優(yōu)化得到超聲波輔助提取黑莓籽油的最佳工藝條件。脂肪酸組成分析采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards andtechnology，NIST）14數(shù)據(jù)庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、比較，確認(rèn)黑莓籽油的化學(xué)成分，并按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 溶劑對(duì)黑莓籽油提取率的影響

本試驗(yàn)分別以石油醚、乙醇、乙醚、正己烷為萃取劑，考察不同溶劑萃取對(duì)黑莓籽油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，石油醚和正己烷提取率相對(duì)較高，無水乙醇和乙醚相對(duì)較低。由于正己烷的市場價(jià)格相對(duì)于石油醚偏高，在允許條件下，本試驗(yàn)采用石油醚為萃取劑。

圖1 溶劑對(duì)黑莓籽油提取率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction rate of blackberry seed oil

2.1.2 工藝條件對(duì)黑莓籽油提取率的影響

不同工藝條件對(duì)新鮮黑莓籽油提取率的影響見圖2。由圖2A可知，當(dāng)料液比為1∶4～1∶8（g∶mL）時(shí)，隨著萃取劑用量的增加，料液接觸面的濃度差增大，油脂易于浸出，提取率顯著增加，料液比在1∶10（g∶mL）時(shí)達(dá)到16.90%，此后原料大部分油脂已經(jīng)提出，提取率趨于穩(wěn)定。由圖2B可知，溫度的升高會(huì)降低提取劑的表面張力和黏性，提高對(duì)樣品的溶解力，故提取溫度在30～60 ℃之間時(shí)，黑莓籽油提取率顯著增加，在60 ℃時(shí)提取率最高達(dá)到17.14%，但溫度過高會(huì)引起溶劑揮發(fā)，降低提取率。由圖2C可知，隨著時(shí)間的增加，微波輻射能加快油脂向溶劑中擴(kuò)散，提取率顯著增加，提取時(shí)間為5 min時(shí)達(dá)到17.23%，當(dāng)溶解度達(dá)到飽和后，溶劑的揮發(fā)導(dǎo)致提取率降低。由圖2D可知，微波功率的增加會(huì)加快油脂分子運(yùn)動(dòng)速率，使得提取率增加，功率到達(dá)500 W時(shí)提取率最高為16.92%，但微波功率過高，可能導(dǎo)致部分油脂氧化分解發(fā)生副作用，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致提取率降低[15]。由圖2E可知，提取率在提取次數(shù)為3次時(shí)提取率最高為16.84%，提取次數(shù)的增加可以使物料中的油脂更好更全面的被提取出來，但隨著提取次數(shù)的增加，溶劑揮發(fā)現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致提取率下降。由圖2F可知，通常物料粉碎粒徑越小，料液接觸的面積越大，提取率越高，在過篩目數(shù)為30～60目時(shí)，提取率隨著目數(shù)增加達(dá)到17.25%，但隨著物料粒徑不斷減小，液體表面張力作用又抑制溶劑浸入，降低油脂浸出量，因此出油率增幅減緩[16]。因此選擇最佳工藝條件為料液比1∶10（g∶mL），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間5 min，微波功率500 W，提取次數(shù)3次，過篩目數(shù)60目。

圖2 工藝條件對(duì)黑莓籽油提取率的影響Fig.2 Effect of technological conditions on the extraction rate of blackberry seed oil

2.2 黑莓籽油提取單因素試驗(yàn)結(jié)果主成分分析

主成分分析對(duì)多個(gè)單因素的綜合考量有幫助，可以確定各因素在某一試驗(yàn)結(jié)果中所占比例的大小[17]。根據(jù)影響黑莓籽油提取的6個(gè)單因素指標(biāo)，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析，相關(guān)矩陣的主成分分析結(jié)果見表2、表3。

表2 主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 2 Eigenvalue,variance contribution rate and cumulative variance contribution rate of principal components

表3 主要質(zhì)地參數(shù)相關(guān)矩陣的規(guī)格化特征向量Table 3 Normalized eigenvectors of the correlation matrix of major texture parameters

經(jīng)分析，共抽取了4個(gè)主成分，第一成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到80.637%。綜合影響黑莓籽油提取率指標(biāo)的大部分信息，選用第一成分中前3個(gè)主成分（物料比、提取時(shí)間、提取溫度）對(duì)黑莓籽油提取率進(jìn)行分析。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取黑莓籽油工藝

2.3.1 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合主成分分析的結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）原理，選擇提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）3個(gè)因素為自變量，以提取率為響應(yīng)值，按照Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 黑莓籽油提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface experiments for blackberry oil extraction condition optimization

2.3.2 響應(yīng)面模型的建立及顯著性分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，以黑莓籽油的提取率（Y）為因變量，提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）為自變量，建立回歸方程如下：

采用Design-Expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments results

由表5可知，一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB對(duì)Y值的影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)A、B、二次項(xiàng)A2、B2對(duì)Y值的影響極顯著（P＜0.01）；由各因素F值的大小得出對(duì)提取率影響最大的因素為提取時(shí)間（A）和溫度（B），其次是料液比（C）。響應(yīng)面優(yōu)化擬合出的方程回歸項(xiàng)極顯著（P＜0.000 1），且失擬項(xiàng)P值0.744 2＞0.05，說明本試驗(yàn)所得二次回歸方程高度顯著，能夠很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)表5分析結(jié)果，作出提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)于響應(yīng)值影響的響應(yīng)面及等高線見圖3。

圖3 提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)黑莓籽油提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface plot and contour line of effects of interaction between extraction temperature and time on extraction efficiency of blackberry seed oil

由圖3可知，提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

2.3.3 最優(yōu)條件的求證及驗(yàn)證

最后通過軟件Design-Expert 8.0.6求解，得優(yōu)化的黑莓籽油提取條件為料液比1∶11.56（g∶mL）、提取溫度65.55 ℃、提取時(shí)間5.54 min，在此條件下黑莓籽油的理論提取率17.40%。為了方便試驗(yàn)操作，將提取條件改為料液比1∶11（g∶mL）、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間5 min，微波功率500 W，過篩目數(shù)60目，提取次數(shù)為3次。在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，提取率實(shí)際值為17.32%，與理論值相差0.08%。最后，使用優(yōu)化后的試驗(yàn)方案重新制備黑莓籽油。

2.4 新鮮黑莓籽油與酒渣黑莓籽油成分分析結(jié)果

進(jìn)行微波提取后的黑莓籽油甲酯化后進(jìn)行GC-MS分析，其脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖見圖4。經(jīng)NIST14數(shù)據(jù)庫檢索，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照、比較，確認(rèn)黑莓籽油的化學(xué)成分，并按峰面積歸一化計(jì)算各峰面積的相對(duì)含量，結(jié)果見表6。

圖4 酒渣黑莓籽油（A）、新鮮黑莓籽油（B）GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of blackberry seed oil extracted from wine residue (A) and from fresh blackberry (B) by GC-MS analysis

表6 黑莓籽精油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 6 Analysis results of chemical components of blackberry seed oil

由表6可見，新鮮黑莓籽油中脂肪酸含量及種類（92.91%，11種）均高于酒渣黑莓籽油（83.47%，7種），朱紅葉等[18]檢測出酒渣黑莓籽油中含有4種脂肪酸。葉華[19]分析黑莓酒中香氣成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中含有21種酯類成分，嚴(yán)蕊等[20]在黑莓酒中檢測出了9種酯類成分。因此，酒渣黑莓籽油中的一些小含量脂肪酸很可能已經(jīng)融入黑莓酒中。

本實(shí)驗(yàn)所檢出的脂肪酸，除了甲酯化產(chǎn)物外還有一部分乙酯化產(chǎn)物，酒渣黑莓籽油中亞油酸乙酯（14.95%）和油酸乙酯（9.44%）的含量遠(yuǎn)大于新鮮黑莓籽油（1.99%和1.12%）?？赡芤?yàn)樵诤谳频纳a(chǎn)過程中，黑莓籽與發(fā)酵產(chǎn)物乙醇接觸，部分發(fā)生酯化反應(yīng)[21]。劉麗娜等[22]在對(duì)新鮮紅樹莓籽油的研究中也發(fā)現(xiàn)部分乙酯的存在，但脂肪酸乙酯的含量比甲酯的含量低，可能是一些其他反應(yīng)造成的。亞油酸乙酯主要用作防治動(dòng)脈粥樣硬化癥的藥物原料，油酸乙酯、硬脂酸乙酯和棕櫚酸乙酯都有特殊的香氣，可以為黑莓酒提供香氣來源[23]。因此，乙酯的存在不僅不會(huì)對(duì)酒渣黑莓籽油的營養(yǎng)成分造成影響，反而會(huì)增加籽油的香味[24]。

新鮮黑莓籽油與酒渣黑莓籽油中脂肪酸均以不飽和脂肪酸為主，分別占總脂肪酸的73.13%和85.36%；其中亞油酸含量最高，其次為α-亞麻酸，二者在釀酒前后黑莓籽油中占總脂肪酸比例分別為67.70%和72.00%。雖然酒渣黑莓籽油中總脂肪酸含量相對(duì)減少了，但是不飽和脂肪酸總相對(duì)含量及亞油酸和α-亞麻酸含量卻有所增加，且釀酒前后亞油酸與α-亞麻酸比值相近（2.76∶1和2.42∶1），均低于4∶1[25]，符合國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)規(guī)定，具有很好的食用價(jià)值及保健作用。綜上所述，酒渣黑莓籽油雖脂肪酸種類及含量低于新鮮黑莓籽油，但亞油酸和α-亞麻酸的相對(duì)含量都有所增加，且乙酯含量明顯大于新鮮黑莓籽油。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法確定黑莓籽油的最佳提取工藝為料液比1∶11（g∶mL）、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間5 min，此條件下黑莓籽油提油率為17.32%。采用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測出酒渣黑莓籽油中脂肪酸的總含量及種類均低于新鮮黑莓籽油，但其不飽和脂肪酸總相對(duì)含量及亞油酸和α-亞麻酸的相對(duì)含量都有所增加。此外，酒渣黑莓籽油中亞油酸乙酯（14.95%）和油酸乙酯（9.44%）的含量遠(yuǎn)大于新鮮黑莓籽油（1.99%和1.12%）。通過對(duì)釀酒前后黑莓籽油成分差異的研究，為黑莓酒渣的綜合利用提供參考。