不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致病力

向玉勇， 隋姍姍， 劉 沖， 鄭 怡

(滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000)

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不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致病力

向玉勇， 隋姍姍， 劉 沖， 鄭 怡

(滁州學院 生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000)

為了掌握蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)對金銀花尺蠖(HeterolochajinyinhuaphagaChu)幼蟲致病的最佳條件，測定了不同溫度、不同濃度下的蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致死作用.結果表明，在15～35 ℃，蘇云金芽孢桿菌濃度為1×104,1×105,1×106,1×107,1×108,1×109芽孢·mL-1，各濃度下對金銀花尺蠖幼蟲均有一定的致死作用，在31 ℃時校正死亡率達到最大，分別為60.32%, 67.24%, 72.41%, 79.31%, 84.48%和91.38%，同一溫度下的校正死亡率隨著濃度的升高顯著上升.方差分析顯示，溫度和濃度的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率沒有顯著影響(p>0.05).由所建立的擬合模型計算可得各濃度對應的校正死亡率最大溫度分別為29.88, 31.54, 32.50，31.17，33.28和32.75 ℃.毒性分析表明，31 ℃時蘇云金芽孢桿菌的毒性最強，LC50值為2.70×103芽孢·mL-1，高于或低于31 ℃，其毒性有所下降.

蘇云金芽孢桿菌；金銀花尺蠖；溫度；校正死亡率；毒性

金銀花尺蠖(HeterolochajinyinhuaphagaChu) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種危害金銀花的食葉害蟲， 該蟲屬鱗翅目尺蛾科，別名拱腰蟲，在河南、山東、安徽等地已有報道[1-4].由于該蟲的取食危害，常引起金銀花大面積減產，甚至成片死亡.目前，國內主要通過化學手段來防治金銀花尺蠖[2-3, 5]，但長期不合理使用化學農藥，不但會殺傷天敵，也增強了害蟲的抗藥性，而且還會使金銀花中農藥大量殘留，降低藥材品質.因此，需尋找新的無公害防治方法以保障金銀花的產量和品質.

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)，在形成芽孢的同時會在菌體的一端或兩端形成伴胞晶體(parasporal crystal)，被昆蟲吞噬后，伴胞晶體在昆蟲中腸特殊酸堿度條件下溶解，并釋放出殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，這種殺蟲晶體蛋白被中腸擬胰蛋白酶激活后能特異性地與中腸上皮細胞受體結合，改變細胞膜的通透性，引起細胞代謝失調導致昆蟲死亡[6-7].因此，蘇云金芽孢桿菌具有非常高的生物防治價值，已被制成微生物殺蟲劑，即Bt殺蟲劑，廣泛用于害蟲防治，其殺蟲譜已擴大到鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目、虱目和蚤目9個目的200多種害蟲[8-9].由于Bt殺蟲劑具有生產方便、成本低廉、致病力強、不傷害天敵、對人、畜無毒害、不污染環(huán)境等優(yōu)點，已成為世界上產量最大、效果最好的微生物殺蟲劑.我國Bt制劑的產量已超過2×104t，每年應用面積可達4×106hm2，主要用來防治馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)、柳藍葉甲(Plagioderaversicolora)、光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)、松墨天牛(Monochamusalternatus)等鞘翅目害蟲[10-12]，以及小菜蛾[Plutellaxyllostella(Linnaeus)]、菜青蟲(PierisrapaeLinne)、棉鈴蟲(HelicoverpaarmigeraHubner)、大豆天蛾(Clanisbilineata)、茶毛蟲(EuproctispseudoconspersaStrand)、玉米螟(Ostrinianubilalis)、三化螟[Tryporyzaincertulas(Walker)]、蘋果巢蛾(YponomeutapadellaLinnaeus)、馬尾松毛蟲(DendrolimuspunctatusWalker)、油桐尺蠖(BuasrasuppressariaGuenee)等鱗翅目害蟲[13].但害蟲的種類繁多，蘇云金芽孢桿菌對不同昆蟲的致病能力存在差異，其殺蟲效果還受溫度、濕度、光照等多種環(huán)境因素的影響，有關蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖的致病力還未見報道. 本文研究不同溫度條件下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致病力，旨在尋找蘇云金芽孢桿菌感染金銀花尺蠖幼蟲的最佳溫度條件，為該蟲的生物防治提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蘇云金芽孢桿菌菌株ATCC10792，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司.

1.2 供試蟲源

從明光市三界鎮(zhèn)野生金銀花上采集金銀花尺蠖幼蟲，帶回實驗室，放在人工氣候箱中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng).人工氣候箱的光周期L∶D設置為14∶10，溫度為25±1 ℃，相對濕度為(70±7)%.選取大小一致的健康老熟(5齡)幼蟲作為試驗材料.

1.3 培養(yǎng)基

基礎培養(yǎng)基：3.0%牛肉膏、1.5%瓊脂、5.0% NaCl、10.0%蛋白胨.

液體培養(yǎng)基：豆餅粉4.5%、淀粉2.0%、玉米粉2.0%、硫酸鎂0.1%、碳酸鈣0.1%、磷酸二氫鉀0.1%.

1.4 菌懸液制備

取蘇云金芽孢桿菌菌種接種于基礎培養(yǎng)基斜面，在32 ℃下培養(yǎng)24 h，然后移入液體培養(yǎng)基中，30 ℃下經搖床震蕩培養(yǎng)48 h長出芽孢和伴胞晶體.收集培養(yǎng)物，用離心機離心10 min (2 000 r·min-1)，除去上清液，取沉淀用無菌水制備成1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109芽孢·mL-16個濃度的菌懸液待用.

1.5 蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致死作用分析

設置15，19，23，27，31，35 ℃ 6個溫度，將不同濃度的菌懸液噴灑在金銀花葉片上，風干后放在一次性塑料杯中，接入1頭5齡老熟金銀花尺蠖幼蟲，杯口覆上保鮮膜，并用昆蟲針扎許多小孔透氣，然后置于人工氣候箱中，24 h后改用未噴灑菌懸液的新鮮金銀花葉片飼養(yǎng)，72 h后觀察并記錄幼蟲的死亡情況(死亡幼蟲身體發(fā)黑、僵直，體壁破后有黑色液體流出).每個溫度下各濃度的菌懸液分別測定20頭幼蟲，實驗重復3次，并以噴灑無菌水的葉片作對照.根據(jù)下列公式計算死亡率和校正死亡率：

死亡率=(死亡蟲數(shù)/處理試蟲總數(shù))×100%，

校正死亡率=[(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)]×100%.

2 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan氏新復極差法作差異顯著性檢驗.

3 結果與分析

3.1 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖的致死作用

在15～35 ℃的溫度范圍內，各濃度的蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲均有一定的致死作用(見表1)，不同溫度下的校正死亡率存在顯著差異，15 ℃時最低，各濃度的校正死亡率分別為32.76%，39.66%，44.83%，51.72%，56.89%和63.79%，隨著溫度的升高，校正死亡率不斷上升，31 ℃時達到最大，分別為60.32%，68.24%，72.41%，79.31%，84.48%和91.38%.35 ℃時校正死亡率開始下降，分別為52.73%，61.82%，69.10%，74.55%，81.82%和87.27%.在同一溫度下，蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率隨著濃度的升高而上升，差異達顯著水平.

方差分析顯示(見表2)，溫度和蘇云金芽孢桿菌濃度交互作用的p值大于0.05，說明溫度和蘇云金芽孢桿菌濃度的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率沒有顯著影響.

表1 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率Table 1 Corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

表中數(shù)據(jù)為M±SE，后面標注的英文字母為多重比較的結果，同一行中不同大寫字母表示不同溫度下的校正死亡率數(shù)據(jù)差異顯著(p<0.05)，同一列中不同小寫字母表示不同濃度下的校正死亡率數(shù)據(jù)差異顯著(p<0.05)，否則不顯著.

The data in the table are mean±SE，the marked letters after them show the results of multi comparison. In the same line, the different capital letters mean a significant difference between different temperatures (p<0.05)，and the different lower case letters in the same row mean a significant difference between different dosages (p<0.05), otherwise mean no difference.

表2 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲校正死亡率的方差分析Table 2 Two-way ANOVA on the corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

注 表中字母A為溫度，B為濃度，SS為平方和，DF為自由度，MS為均方，e為誤差，T為總和.

Notes The letters A, B, SS, DF, MS, e and T represent temperature, dosages, sum of squares, degree of freedom and mean square, error and total, respectively.

3.2 蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率與溫度的擬合模型

通過分析建立金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率與溫度間的擬合模型(見圖1)，蘇云金芽孢桿菌濃度為1×104,1×105,1×106,1×107,1×108,1×109芽孢·mL-1時的擬合方程分別為y=-0.112x2+6.692 7x-42.784，y=-0.090 5x2+5.708 8x-25.737，y=-0.084 9x2+5.518 2x-18.98,y=-0.089 4x2+5.730 9x-14.965,y=-0.078 4x2+5.218 5x-3.832,y=-0.082 9x2+5.430 2x+0.203 3，式中x為溫度(℃)，y為校正死亡率(%)，R2值分別0.965 9,0.968 9,0.982 4,0.975 3,0.984 3和0.978.表明所建模型能夠反映試驗溫區(qū)的實際變化規(guī)律，模型成立.根據(jù)所建模型可以計算出各濃度蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲校正死亡率最高時的溫度分別為29.88,31.54,32.50,31.17,33.28和32.75 ℃.

圖1 蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率與溫度的擬合模型Fig.1 Regression models about the corrected mortality of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva and temperatures

3.3 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的毒性

毒性測定結果顯示(見表3)，在15,19,23,27,31,35 ℃ 6個溫度梯度下，蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲均有一定的毒性，其LC50值分別為1.77×106，2.17×105，6.12×104，1.52×104,2.70×103和1.51×104芽孢·mL-1， 說明在15～31 ℃范圍內，隨著溫度的升高，蘇云金芽孢桿菌的毒性在增強，當溫度高于31 ℃后，毒性開始下降.

表3 不同溫度下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的毒性Table 3 Toxicities of Bt against H. jinyinhuaphaga Chu larva at different temperatures

4 討 論

溫度是影響微生物殺蟲劑殺蟲效果的一個重要因素，筆者研究了不同溫度條件下蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致死作用.結果表明，溫度能在很大程度上影響蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的致死效果.在15～35 ℃，31 ℃最有利于蘇云金芽孢桿菌感染金銀花尺蠖幼蟲，溫度過高或過低，都會降低其致死作用，尤其是高溫，各溫度下的差異顯著，可能是由于高溫或低溫條件影響了芽孢和伴胞晶體的產生，從而影響致死效果. 汪敏捷等[14]研究了不同溫、濕度下白僵菌對紅緣天牛幼蟲的致病力，也得到了類似結果.在同一溫度下，蘇云金芽孢桿菌對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率隨著濃度的升高而上升，差異顯著.方差分析顯示，溫度和蘇云金芽孢桿菌濃度的交互作用對金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率沒有顯著影響(p>0.05).

根據(jù)建立的金銀花尺蠖幼蟲的校正死亡率與溫度間的回歸模型計算得出：蘇云金芽孢桿菌在濃度為1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109芽孢·mL-1時，金銀花尺蠖幼蟲校正死亡率最高時的溫度分別為29.88,31.54,32.50,31.17,33.28和32.75 ℃. 毒性測定結果也說明溫度在15～31 ℃，蘇云金芽孢桿菌的毒性隨著溫度的升高而增強，溫度高于31 ℃時，毒性開始下降.因此，在利用蘇云金芽孢桿菌制劑進行生物防治時，應避開高溫環(huán)境，可以選擇在陰天施藥，以充分發(fā)揮其藥效.

目前，國內關于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲效果已有較多報道，但所選用的菌株不一樣，其殺蟲效果亦存在一定差異，并且殺蟲效果還受濕度、光照等多種環(huán)境因素的影響.本研究只選用了一種菌株，測定不同溫度下其對金銀花尺蠖幼蟲的致死作用.今后還應選擇不同菌株，研究溫度、濕度、光照等因素綜合作用下的致死作用，以確定不同菌株的最佳作用條件，為金銀花尺蠖的生物防治提供科學依據(jù).

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Pathogenicity ofBacillusthuringiensistoHeterolochajinyinhuaphagaChu larvae at different temperatures.

XIANG Yuyong, SUI Shanshan, LIU Chong, ZHENG Yi

(SchoolofBiologyandFoodEngineering,ChuzhouUniversity,Chuzhou239000，AnhuiProvince,China)

To obtain the optimal pathogenicity conditions ofBacillusthuringiensis(Bt) toHeterolochajinyinhuaphagaChu larvae, the lethal effects of Bt onH.jinyinhuaphagaChu larvae at different temperatures and dosages were tested in laboratory. The dosages of Bt were set as 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109spores·mL-1. The result showed that Bt at each dosage had a certain lethal effect onH.jinyinhuaphagaChu larvae in the range from 15 to 35 ℃. The corrected mortality reached the highest level at 31 ℃, which was 60.32%, 67.24%, 72.41%, 79.31%, 84.48% and 91.38%, separately, and it would decrease significantly at lower or higher temperatures. At the same temperature, the corrected mortality would increase when the dosage was added. Two way ANOVA showed that the interaction of temperatures and dosages had no significant effect on the corrected mortality ofH.jinyinhuaphagaChu larvae(p>0.05). According to the established regression model, the optimum temperatures for the biggest corrected mortality at each dosage were calculated as 29.88, 31.54, 32.50, 31.17, 33.28 and 32.75 ℃, respectively. Toxicity analysis showed that the toxicity of Bt was strongest at 31 ℃, and it’s LC50value was 2.70×103spores·mL-1. The toxicity of Bt would decrease at the temperatures higher or lower than 31℃.

Bacillusthuringiensis;HeterolochajinyinhuaphagaChu; temperature; corrected mortality; toxicity

2015-09-23.

安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2012B123)；安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金(2009SQRZ147)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310377018)；安徽省高校優(yōu)秀中青年骨干人才國內外訪學研修重點項目(gxfxZD2016249).

向玉勇(1974-)，ORCID: http://orcid.org/0000-0001-9335-2256，男，博士，副教授，主要從事昆蟲化學生態(tài)學及害蟲防治研究，E-mail: xyy10657@sohu.com.

10.3785/j.issn.1008-9497.2016.04.010

Q 965

A

1008-9497(2016)04-436-06

Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2016,43(4):436-441