柑橘果肉果膠的流變和結構特性

支梓鑒, 鄒明明, 李　珊, 陳健樂, 葉興乾, 陳士國

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院, 馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室, 杭州 310058)

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柑橘果肉果膠的流變和結構特性

支梓鑒, 鄒明明, 李珊, 陳健樂, 葉興乾, 陳士國

(浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院, 馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室, 杭州 310058)

摘要以柑橘果肉為原料, 采用稀酸提醇沉法提取果膠粗品, 研究了果膠溶液的濃度及熱處理溫度對果膠溶液流變學性質的影響. 采用DEAE Cellulose-52柱對柑橘果肉粗品進行洗脫得到3個多糖組分(P-0, P-1和P-2), 對其分子量、 半乳糖醛酸、 單糖組成及酯化度等進行分析, 并利用紅外光譜及核磁共振氫譜等對各組分進行結構特性分析. 結果表明, 柑橘果肉果膠為典型的剪切稀化型非牛頓流體; P-0, P-1和P-2組分分子量存在顯著差異; 柑橘果肉果膠為富含糖醛酸的酸性多糖, 且是發(fā)生部分乙酰化的低酯果膠, 其單糖組成以半乳糖醛酸、 半乳糖、 阿拉伯糖、 鼠李糖和巖藻糖居多, 且均以Ⅰ型聚鼠李半乳糖醛酸(RG-Ⅰ型)結構為主; 3種組分糖環(huán)類型均是吡喃糖, 糖苷鍵既有α型, 又有β型.

關鍵詞柑橘果肉; 果膠; 結構特性; 多糖; 流變學性質

果膠是一種酸性雜多糖, 主要包括均聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、 鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG Ⅰ)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG Ⅱ) 3個結構域[1,2], 其廣泛存在于蘋果、 柑橘、 芒果、 番石榴、 向日葵花盤及甘薯渣中. 果膠是一種可溶性的膳食纖維, 具有降低膽固醇, 預防糖尿病, 防止肥胖以及維持腸道健康[3,4]等功能.

隨著功能性多糖的研究開發(fā)利用, 果膠越來越受到人們的重視和青睞. 有資料表明[5], 全球果膠年需求量約為4萬噸, 且以每年約4%～6%的速度遞增. 同時, 我國是柑橘生產(chǎn)大國, 種植面積居世界首位, 且國內(nèi)果汁行業(yè)處于飛速發(fā)展期, 榨汁過程中易產(chǎn)生大量果渣, 其中含有約20%果膠多糖, 若不將其充分利用, 易引起資源浪費和環(huán)境污染問題. 因此, 合理利用廢棄物提取其功能多糖亟待研究. 目前, 對橘皮中果膠研究較多, 其果膠含量20%～30%, 但對果肉果膠研究很少, 限制其進一步的開發(fā)利用. 本文以柑橘果肉為原料, 研究其果膠的基本理化性質和結構特性, 旨在對其資源再分配和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論基礎.

1實驗部分

1.1材料、 試劑與儀器

晚熟溫州蜜柑(寧波象山). 單糖標品(甘露糖、 氨基葡萄糖、 鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半乳糖醛酸、 半乳糖、 阿拉伯糖、 巖藻糖、 乳糖、 木糖), 右旋糖標樣(Dextran, 重均分子量Mw=50000, 80000, 150000, 270000, 410000, 670000)(Sigma公司); DEAE Cellulose-52(Whatman公司); 乙腈、 甲醇, 色譜純; 重水(D2O, 純度99.9%)、 氘代丙酮、 三氟乙酸(TFA)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)均為分析純; 其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

高速冷凍離心機(日本日立公司); HAAKE RheoStress 6000型流變儀(Thermo Electron(Karlsruhe) GmbH); UV-2550型分光光度計(日本Shimadzu公司); Waters 1525型高效液相色譜儀、 Waters 2695型高效液相色譜儀、 Waters 2414型示差檢測器、 Waters 2996型紫外檢測器(美國Waters公司); ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)(美國Aglient公司); TSK-gel G4000 PWxl色譜柱(日本Tosoh Bioscience公司); SinChrom ODS-BP C18分離柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)(大連依利特公司); AVA TAR370型傅里葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司); Avance Ⅲ 600 MHz型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司).

1.2實驗方法

1.2.1柑橘果肉果膠提取取冷凍桔肉, 解凍, 過濾, 取渣備用. 用勻漿機將橘渣打勻, 按料液體積比1∶1加入蒸餾水, 調(diào)節(jié)pH=1.8, (80±1) ℃, 磁力攪拌90 min, 冷卻至室溫, 離心, 取上層清液, 加入無水乙醇至體積分數(shù)為70%, 靜置1 h, 400目過濾, 取濾渣用95%(體積分數(shù))乙醇洗滌3次, 復溶, 用分子量為14000的透析袋流水透析, 凍干, 計算果膠得率.

(1)

(2)

式中:K(Pa·sn)為黏度系數(shù);n為流動指數(shù), 表征偏離牛頓流體程度的指數(shù).

1.2.3柑橘果肉果膠的快速純化及分級取粗果膠1.497 g溶解, 上樣于DEAE Cellulose-52陰離子交換柱, 依次以0, 0.1, 0.3, 0.5和1.0 mol/L NaCl溶液(0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液, pH=6.0)洗脫出3個組分(0.5和1.0 mol/L洗脫部分糖反應不明顯, 未收集), 分別命名為P-0, P-1和P-2. 在濾液中加入乙醇至體積分數(shù)為70%, 靜置, 離心, 復溶, 透析, 凍干, 備用.

1.2.4分子量的測定分別取不同分子量的右旋糖苷標準品2 mg, 配成2 mg/mL的溶液. 高效液相色譜(HPLC)條件: 流動相0.2 mol/L NaCl溶液, 流速0.5 mL/min, 柱溫和檢測溫度均為40 ℃, 進樣量20 μL. 取果膠樣品P-0, P-1和P-2, 利用HPLC和TSK-gel G4000 PWxl色譜柱測定分子量, 并利用Breeze2軟件計算其重均分子量(Mw)、 數(shù)均分子量(Mn)和多分散系數(shù)(D).

1.2.5單糖組成分析配制標準單糖(甘露糖、 鼠李糖、 葡萄糖醛酸、 半乳糖醛酸、 葡萄糖、 半乳糖、 木糖、 阿拉伯糖、 巖藻糖、 氨基葡萄糖等)混合溶液(各單糖濃度為2 mmol/L). 將400 μL單糖混合液與450 μL 0.3 mol/L NaOH于離心管中, 加50 μL 1.6 mmol/L乳糖和450 μL 0.5mol/L PMP(甲醇作溶劑), 混勻, 于70 ℃水浴反應30 min, 以0.3 mol/L HCl溶液調(diào)至中性, 加入1 mL氯仿萃取, 重復2次, 過0.45 μm水膜.

稱取果膠樣品約3 mg于安培瓶中, 加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸(TFA), 充N2氣封管, 在110 ℃水解8 h(烘箱). 冷卻至室溫, 用N2氣吹干TFA, 用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性, 再用超純水定容至1 mL. 取400 μL樣品進行衍生化.

參照文獻[7]方法, 用色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)檢測分離, 紫外檢測波長為250 nm, 進樣體積10 μL.

1.2.6半乳糖醛酸含量的測定分別配制濃度為0, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240和270 μg/mL的半乳糖醛酸標準溶液1.0 mL, 利用硫酸咔唑法在530 nm波長下測定吸光值, 得標準曲線y=0.0035x+0.0092,R2=0.9964, 其中y表示吸光值,x表示半乳糖醛酸濃度(μg/mL). 將果膠P-0, P-1和P-2溶解至適當濃度, 各取1 mL利用硫酸咔唑法測定吸光值, 并根據(jù)標準曲線計算半乳糖醛酸的含量.

1.2.7酯化度的測定取果膠樣品10 mg, 加入0.5 mL CuSO4溶液(1 mg/mL)、 10 μL異丙醇溶液(20 μL/mL)和1 mL NaOH溶液(0.5 mol/L), 將混合溶液置于冰浴中反應30 min, 離心, 取上層清液, 用稀HCl調(diào)節(jié)pH=2.0. 配制混標溶液: 將10 μL異丙醇溶液(100 μL/mL)、 10 μL冰乙酸溶液(100 μL/mL)和6 μL甲醇混勻, 用水補充至2 mL. 用HPLC檢測. 流動相4 mmol/L H2SO4溶液, 流速0.8 mL/min, 色譜柱C18柱(SinChrom ODS-BP 5 μm, 250 mm×4.6 mm), 示差折光檢測器(RID), 進樣體積20 μL.

(3)

(4)

(5)

式中:mMeOH or AcOH or IPA分別為MeOH, AcOH或IPA的質量,AMeOH or AcOH or IPA分別為MeOH, AcOH或IPA的峰面積; GalA%為半乳糖醛酸的含量.

1.2.8紅外光譜(FTIR)和核磁共振氫譜(1H NMR)測定各取1 mg干燥果膠樣品與KBr壓片, 使用AVA TAR370傅里葉紅外光譜儀, 測定4000～400 cm-1范圍的光譜吸收. 取分離純化的P-0, P-1和P-2樣品, 用99.9%的氘水交換2次, 凍干, 樣品濃度為10 mg/mL, 以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標, 利用VANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振波譜儀在20 ℃條件下測定1H NMR譜.

2結果與討論

2.1流變學特性

2.1.1濃度對果肉果膠溶液流變性的影響各濃度柑橘果肉果膠溶液的黏度隨剪切速率的變化曲線如圖1(A)所示. 在0.1～600 s-1剪切速率范圍內(nèi), 其黏度隨濃度增大而增大, 且不同濃度的果膠溶液均表現(xiàn)為溶液黏度隨剪切速率增加而減小的典型假塑性流體行為. 利用OriginPro7.5軟件對不同濃度的果膠溶液流變曲線進行冪律方程的擬合, 得到不同濃度果膠溶液的流體冪律方程及相關參數(shù)(見表1). 結果表明, 隨果膠溶液濃度的增大, 稠度系數(shù)K顯著上升, 表觀黏度隨之增大[9]. 原因可能是果膠在水溶液中呈鏈狀線性構象, 分子間相互纏結形成交聯(lián)結構, 且具有較強的分子間作用力, 果膠濃度增大使連接區(qū)的果膠分子數(shù)增多, 分子間引力逐漸加強, 加劇了分子鏈段間及分子間相互纏結, 而形成網(wǎng)狀結構, 使流體流動阻力增大, 從而使表觀黏度急劇增大, 隨著剪切速率的增大, 這種強化效應逐漸減弱[10]. 表1和表2中顯示各濃度果膠溶液n值均小于1, 表明在實驗剪切速率范圍(0.1～600 s-1)內(nèi), 柑橘果肉果膠溶液屬于假塑性流體[11]. 當果膠溶液濃度為0.25%時, 非牛頓指數(shù)n=0.8766, 其流動行為更接近于理想狀態(tài)的牛頓流體; 隨著濃度的增大,n值逐漸降低, 果膠溶液的剪切變稀進一步增強, 假塑性流體行為更加明顯.

2.1.2溫度對果肉果膠溶液流變性的影響溫度對1.00%柑橘果肉果膠溶液的流變性的影響如圖1(B)所示, 在相同剪切速率(0.1～600 s-1)下, 隨著處理溫度的升高, 果膠溶液的黏度逐漸減小. 表1和表2結果表明, 隨果膠溶液處理溫度升高, 稠度系數(shù)K顯著降低, 流體黏度也相應減小. 處理溫度為100 ℃時, 果膠溶液的流變曲線遠遠低于25 ℃時的流變曲線, 稠度系數(shù)K僅為4.26 mPa·sn, 且果膠黏度隨著剪切速率的增大基本保持不變, 表現(xiàn)出理想的牛頓流體性質. 原因可能是溫度升高導致分子熱運動加劇, 鏈柔順程度增強, 流動性增大; 分子鏈間氫鍵被破壞, 分子間斥力增強, 電離度減小, 交聯(lián)作用也逐漸減小[12]; 果膠分子降解, 分子間纏結點減小, 最終導致果膠黏度下降.

2.2果膠分子量

柑橘果肉果膠的洗脫圖如圖3所示. 組分P-0, P-1和P-2分別為用0, 0.1和0.3 mol/L NaCl溶液(0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液, pH=6.0)洗脫出來的組分. 表3數(shù)據(jù)顯示, P-0, P-1和P-2重均分子量分別為752410, 286320和131380, 三者存在顯著差異.

2.3單糖組成分析

柑橘果肉果膠各組分含有的單糖種類及其摩爾分數(shù)如表3所示. P-0含有9種單糖, P-1和P-2含有8種單糖, 3種果膠組分的單糖組成均以半乳糖醛酸、 半乳糖、 阿拉伯糖、 鼠李糖和巖藻糖5種單糖居多, 但是含量存在明顯差異, 半乳糖醛酸、 鼠李糖和巖藻糖摩爾分數(shù)依次增加, 而半乳糖和阿拉伯糖摩爾分數(shù)依次減少. P-0組分半乳糖醛酸摩爾分數(shù)最低, 鼠李糖、 半乳糖和阿拉伯糖摩爾分數(shù)之和最高; P-2組分半乳糖醛酸摩爾分數(shù)最高, 鼠李糖、 半乳糖和阿拉伯糖摩爾分數(shù)之和最低.

* Each value represents the mean of three replicates. Man: mannose; Rha: rhamnose; GluA: glucuronic acid; GalA: galacturonic acid; Glu: Glucose; Glu; Gal: galactose; Xyl: xylose; Ara: arabinose; Fuc: fucose; \%D\%: polydispersity index.

果膠RG-Ⅰ域是由重復的鼠李半乳糖醛酸二糖單元4)-α-D-GalpA-(1,2)-α-L-Rhap-(1連接而成, 在鼠李糖殘基的C4位可發(fā)生阿拉伯聚糖、 半乳聚糖或混合阿拉伯半乳聚糖的取代. Schols等[13]提出, 當果膠分子的Rha/GalA比值在0.05～1.00之間時, 其結構主要為RG-Ⅰ 型; 當比值低于0.05 時, 結構主要為HG和RG-Ⅱ型. 柑橘果肉果膠3種組分的Rha/GalA值分別為0.23, 0.20, 0.26, 因此可推斷3個果膠組分均以RG-Ⅰ型結構為主. Ferreira等[14]提出, (Gal+Ara)/Rha值可粗略估計RG-Ⅰ型果膠分子結構的側鏈長度, 其值越大, 表明通過鼠李糖連接到RG-Ⅰ主鏈上的側鏈越長. 柑橘果肉果膠3種組分的(Gal+Ara)/Rha值分別為4.09, 2.62, 1.39, 因此可推斷3個果膠組分通過鼠李糖連接到RG-Ⅰ主鏈上的側鏈鏈長依次遞減, 并且3種組分各自的半乳糖和阿拉伯糖含量相差不大, 因此, 側鏈是半乳聚糖、 阿拉伯聚糖或者混合阿拉伯半乳聚糖均有可能.

2.4半乳糖醛酸含量測定

果膠經(jīng)水解生成半乳糖醛酸, 在強酸中與咔唑試劑發(fā)生縮合反應生成紫紅色化合物, 其呈色強度與半乳糖醛酸含量成正比, 可比色定量. 柑橘果肉果膠3種組分的半乳糖醛酸含量如表4所示. 可見其含量較高并且存在一定差異性, 表明這3種組分均是富含糖醛酸的酸性多糖. 該結果與單糖組成分析的結果存在一定差異, 可能是果膠組分的中性糖的干擾所致.

Table 4Content of galacturonic acid(GalA), degree of methylation(DM) and actylation(DA) of different pectin polysaccharide from citrus pulp

2.5酯化度分析

半乳糖醛酸的甲酯化和乙?；枪z多糖類物質重要的結構特征. 酯化度的大小直接影響果膠多糖的物理化學性質, 如膠凝特性、 離子交換特性及與鈣離子的交聯(lián)特性等; 另外, 果膠分子間的氫鍵作用也主要取決于分子主鏈上甲酯化度和乙?；鹊臄?shù)目和分布. 以異丙醇作為內(nèi)標計算得到柑橘果肉果膠的酯化度結果見表4. 其中P-1甲酯化程度最高, P-0次之, P-2最低; 3種組分的乙酰化度較低并且差異不大. 表明柑橘果肉果膠是發(fā)生部分乙?；牡王スz.

2.6紅外光譜表征

2.7核磁共振氫譜分析

1H NMR譜圖主要解決多糖結構中糖苷鍵的構型問題, P-0, P-1和P-2組分的1H NMR 波譜圖如圖4所示. 多糖異頭氫信號多集中在δ4.8～5.5范圍內(nèi), 且α型吡喃糖C1上質子信號超過δ4.95, 而β型小于δ4.95; 呋喃糖C1上的質子信號在δ5.4附近, 且J1,2<2 Hz. 圖4插圖顯示, 在δ5.4附近無譜峰, 表明各組分均為吡喃糖. P-0組分在δ4.8～5.5間有5個譜峰, 峰尖分別為δ4.90, 5.03, 5.09, 5.12和5.18; P-1組分有4個譜峰(δ4.91, 5.03, 5.10和 5.18); P-2組分有3個譜峰(δ4.91, 5.04和5.10). 結果表明3種組分的糖苷鍵既有α型, 又有β型.δ5.03附近是發(fā)生甲酯化的半乳糖醛酸的H-1信號,δ5.10附近是未發(fā)生甲酯化的半乳糖醛酸的H-1信號, P-0, P-1和P-2在δ3.74附近的信號是酯化果膠的甲氧基的端基質子信號[15]. 各組分在δ1.85, 2.01, 2.11附近的信號是酯化果膠的乙酰基的端基質子信號, 表明3種組分的果膠HG和RG Ⅰ型結構中乙?；B接在半乳糖醛酸的位置均不同[16]. 3種組分的甲氧基端基質子信號和乙酰基端基質子信號的出現(xiàn)表明柑橘果肉果膠發(fā)生甲酯化和乙?；? 與酯化度的測定結果一致. P-0在δ1.25, 1.26; P-1在δ1.26, 1.27及P-2在δ1.27, 1.28處的信號是甲基氫信號, 分別歸屬于α-1,2及α-1,2,4連接的鼠李糖殘基的H-6信號[17]. P-0在δ1.19, P-1在δ1.19及P-2在δ1.20處的信號為巖藻糖的甲基(CH3)氫信號[18], 譜峰較強, 表明柑橘果肉果膠巖藻糖含量較高, 與單糖組成分析的結果一致.

3結論

在柑橘果肉中提取果膠, 采用DEAE Cellulose-52陰離子交換快速分離純化出P-0, P-1和P-2組分, 并研究了其結構. 柑橘果肉果膠溶液的黏度隨剪切速率的增加而逐漸降低, 表現(xiàn)為典型的剪切稀化型非牛頓流體, 可在食品工業(yè)中用于增稠劑等; 酯化度測定結果表明柑橘果肉果膠為發(fā)生部分乙酰化的低酯果膠, 可廣泛應用于果醬、 冰淇淋、 果肉型飲料及焙烤食品中; 采用紅外和核磁共振分析各組分果膠, 發(fā)現(xiàn)其均為吡喃糖, 且糖苷鍵類型既有α型, 又有β型, 為其在食品產(chǎn)業(yè)中的應用和廢棄果渣資源再利用提供理論基礎.

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(Ed.: D, Z)

? Supported by the Public Welfare Project of Zhejiang Province, China(No.2014C32G2010026) and the Agricultural Major Project of Ningbo City, China(No.2013C11013).

Rheological and Structural Characterization of Pectin Polysaccharides from Citrus Pulp?

ZHI Zijian, ZOU Mingming, LI Shan, CHEN Jianle, YE Xingqian, CHEN Shiguo*

(CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,FuliInstituteofFoodScience,ZhejiangKeyLaboratoryforAgro-foodProcessing,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

KeywordsCitrus pulp; Pectin; Structural feature; Polysaccharide; Rheological property

AbstractRaw pectin from citrus pulp was prepared with diluted acid extraction and ethanol precipitation. Its rheological behavior was assessed under different thermal treatments at different concentrations. Three polysaccharides, named P-0, P-1 and P-2, were isolated by anion-exchange chromatography on a diethyl-aminoethyl(DEAE) cellulose-52 column at 0, 0.1, 0.3 mol/L NaCl eluent, respectively. Their structural features were elucidated by determination of their molecular weight, sugar analyses, esterification degree analyses, Fourier transform infrared(FTIR) and1H nuclear magnetic resonance(1H NMR) spectra. The results indicated that citrus pulp pectin was the typical shearing thinning non-newtonian fluid. The molecular weights of P-0, P-1 and P-2 were 752410, 286320, 131380, respectively. They belonged to the kind of acid polycose, which was abundant in uronic acid and low-esterified pectin with partial acetylesterification. P-0, P-1 and P-2 were mainly made up of rhammogalacturonan-Ⅰ(RG-Ⅰ) structure and their monosaccharides compositions were mostly glucuronate, galactose, arabinose, rhamnose and fucose at different ratio. FTIR and NMR spectra implied that P-0, P-1 and P-2 owned pyranose rings and exhibited bothα- andβ-glycosidic bonds.

收稿日期:2016-01-26. 網(wǎng)絡出版日期: 2016-05-10.

基金項目：浙江省公益性項目(批準號: 2014C32G2010026)和寧波市農(nóng)業(yè)重大項目(批準號: 2013C11013)資助.

中圖分類號O631; O629

文獻標志碼A

聯(lián)系人簡介: 陳士國, 男, 博士, 副教授, 博士生導師, 主要從事海洋糖化學和糖生物學研究. E-mail: chenshiguo210@163.com