度洛西汀中間體生物轉(zhuǎn)化菌株研究

歐志敏，楊　策, 楊根生

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

度洛西汀中間體生物轉(zhuǎn)化菌株研究

歐志敏，楊策, 楊根生

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：(S)-DHTP是合成抗抑郁藥物度洛西汀的關(guān)鍵手性中間體，采用微生物土壤篩菌法從土壤中篩選得到一株能夠?qū)KTP不對(duì)稱地還原為(S)-DHTP的菌株，26S rDNA序列分析鑒定，該菌株屬于假絲酵母屬，命名為熱帶假絲酵母Candida tropicalis zjut 22.該菌株能夠高效地還原DKTP生成度洛西汀關(guān)鍵手性中間體，底物轉(zhuǎn)化率>90%，(S)-DHTP對(duì)映體過量值e.e.>99%，相比于化學(xué)法，生物轉(zhuǎn)化合成反應(yīng)條件更溫和而且對(duì)環(huán)境的污染小.利用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，菌體干菌質(zhì)量濃度可達(dá)14 g/L(菌體干重/發(fā)酵液體積).

關(guān)鍵詞：度洛西??；生物轉(zhuǎn)化法；(S)-DHTP；熱帶假絲酵母

抑郁癥以顯著持久的心境低落為主要特征，屬于一種情感性精神障礙的綜合征，臨床癥狀主要為情緒低落、軀體不適、思維遲鈍等以至于產(chǎn)生自殺行為，其高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高自殺率嚴(yán)重困擾患者的生活質(zhì)量和威脅社會(huì)和諧穩(wěn)定[1].世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè)到2020年抑郁癥將成為僅次于心臟病的第二大疾病[2].度洛西汀，其化學(xué)名稱為(S)-N-甲基-3-(1-氧萘基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，是一種可以雙重抑制5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取作用的抗抑郁藥[3].由美國禮來制藥公司開發(fā)，于2004年被美國FDA批準(zhǔn)首次上市并用于治療嚴(yán)重抑郁癥.目前發(fā)現(xiàn)不僅可以治療抑郁癥，還可用于治療廣泛性焦慮癥、婦女應(yīng)激尿失禁癥以及糖尿病外周神經(jīng)病性疼痛和纖維肌痛等神經(jīng)病學(xué)相關(guān)疾病[4].度洛西汀耐受性和安全性較好，療效確切顯效快，用藥方案簡便，并且副反應(yīng)少，其兩種對(duì)映異構(gòu)體中只有S型度洛西汀具有抗抑郁藥理活性[5].(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙胺((S)-DHTP)是合成抗抑郁癥藥物度洛西汀的重要中間體，采用微生物轉(zhuǎn)化法合成手性藥物中間體具有成本低廉、立體選擇性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[6].本研究利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)度洛西汀中間體(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙胺, 以N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP)為底物, 篩選高效轉(zhuǎn)化菌株，合成度洛西汀的關(guān)鍵中間體(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙胺((S)-DHTP)，進(jìn)而優(yōu)化菌種培養(yǎng)條件,為度洛西汀的合成開辟經(jīng)濟(jì)高效途徑.

1材料與方法

1.1材料

初篩平板培養(yǎng)基:麥芽汁10 g/L,酵母粉3 g/L,蛋白胨5 g/L,瓊脂20 g/L,苯乙酮1 mol/L(過濾除菌).

復(fù)篩液體培養(yǎng)基:酵母粉3 g/L,硫酸銨5 g/L,硫酸鎂0.25 g/L,磷酸氫二鉀1 g/L,磷酸二氫鉀1 g/L,DKTP 1 mol/L(過濾除菌待培養(yǎng)一段時(shí)間后加入).

固體種子培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,麥芽汁10 g/L,酵母粉3 g/L,蛋白胨5 g/L,瓊脂20 g/L.

斜面保存培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,麥芽汁10 g/L,酵母粉3 g/L,蛋白胨5 g/L,瓊脂20 g/L.

主要化學(xué)試劑:DHTP外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品、DKTP標(biāo)準(zhǔn)品,浙江九洲醫(yī)藥有限公司；乙腈、乙二胺等,華東醫(yī)藥股份有限公司；苯乙酮, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2方法

1.2.1采集土樣

土壤采集自浙江工業(yè)大學(xué)的校園，采集時(shí), 鏟去地表土層3～5 cm，取5～10 cm深層土樣10 g，裝入滅菌的牛皮紙袋，4 ℃保存.

1.2.2菌種篩選

初篩時(shí)將土壤稀釋液均勻涂布到初篩平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)幾天后，將初篩平板培養(yǎng)基上長出的顏色與形狀不同的菌落分別接種至復(fù)篩液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，培養(yǎng)12 h左右向復(fù)篩液體培養(yǎng)基中補(bǔ)加1 mol/L的DKTP[7].

1.2.3菌種鑒定

菌株經(jīng)固體種子培養(yǎng)基接種培養(yǎng)后，交由上海生工生物工程公司測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定，通過鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析.菌種鑒定實(shí)驗(yàn)過程如下:

1) 基因組DNA提取，按SK8257(酵母)試劑盒操作.

2) PCR擴(kuò)增供試菌26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列.

3) 凝膠電泳.1%瓊脂糖電泳，150 V，100 mA，20 min電泳觀察.

4) 純化回收.PCR產(chǎn)物電泳條帶切割所需DNA目的條帶，按SK8131試劑盒方法純化，PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序.

1.3培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.3.1單因素試驗(yàn)

將熱帶假絲酵母菌種Candidatropicaliszjut 22接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，得到其一級(jí)種子液.以10%的接種量接種種子液至大小為1 000 mL的三角搖瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，三角搖瓶的裝液量為其標(biāo)定容量的60%.培養(yǎng)過程中保持恒溫振蕩搖床的溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min不變.分別按以下條件進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：

1) 最佳碳源的選擇：分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽汁和淀粉作為二級(jí)液體培養(yǎng)基的碳源，質(zhì)量濃度為30 g/L，其余培養(yǎng)基組份不變.

2) 優(yōu)化碳源質(zhì)量濃度：選擇出最佳的碳源后，分別按5，10，20，30，40，50，60 g/L的碳源質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，其余培養(yǎng)基組份不變.

3) 最佳氮源的選擇：分別以5 g/L硫酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、尿素為無機(jī)氮源，其余培養(yǎng)基組份不變.

4) 優(yōu)化氮源質(zhì)量濃度：選擇出最佳的氮源后，分別按5，10，15，20，25，30 g/L的氮源質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，其余培養(yǎng)基組份不變.

5) 無機(jī)磷質(zhì)量濃度的選擇：在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別控制磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為1，2，4，6，8，10 g/L，其余培養(yǎng)條件不變.

Candidatropicaliszjut 22分別按上述方案，在恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24 h后，離心二級(jí)發(fā)酵液得到菌體測(cè)定干菌質(zhì)量濃度.

1.3.2正交試驗(yàn)

將熱帶假絲酵母菌種Candidatropicaliszjut 22接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，得到其一級(jí)種子液.以10%的接種量接種種子液至大小為1 000 mL的三角搖瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)，按三角搖瓶標(biāo)定容量的60%裝液.培養(yǎng)過程中保持恒溫振蕩搖床的溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min不變.選擇葡萄糖(A)、酵母粉(B)、磷酸鹽(C)、硫酸銨(D) 4個(gè)因素,每個(gè)因素各選擇4個(gè)不同的質(zhì)量濃度水平，確定四因素四水平的正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案(表1)[8].

表1正交實(shí)驗(yàn)因素水平

Table 1Orthogonal experiment consisting of four factors and four levels

g/L

1.3.3測(cè)定方法

1) 底物和產(chǎn)物的分析方法

采用高效液相色譜(HPLC)分析，色譜條件：OD-H (5 μm) 0.46 mm×250 mm手性色譜柱，流動(dòng)相用V(正己烷)∶V(乙醇)∶V(四氟乙酸)∶V(二乙胺)=95∶5∶0.2∶0.1，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為240 nm[7].

2) 測(cè)定二級(jí)發(fā)酵液的濕菌質(zhì)量濃度

將二級(jí)發(fā)酵液搖晃均勻，用吸量管吸取4 mL的發(fā)酵液樣品放入離心管中，稱重為W1.離心管配平后在臺(tái)式離心機(jī)上以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，將發(fā)酵液樣品離心后的上清液倒入另外的干凈離心管中，稱重為W2.計(jì)算濕菌質(zhì)量濃度，其計(jì)算式為

C1= (W1-W2) ÷4×1 000

(1)

3) 測(cè)定發(fā)酵液的干菌質(zhì)量濃度

將上述步驟離心管中所得的酵母泥，加入少量純凈水?dāng)嚢枳尵w完全分散在水中后，倒入已知重量的坩堝中.將坩堝置于恒溫干燥箱中，在135 ℃左右條件下干燥數(shù)小時(shí)至恒重，稱重與坩堝重量之差為W.計(jì)算干菌質(zhì)量濃度，其計(jì)算式為

C2= W/V

(2)

式中:C1為濕菌質(zhì)量濃度，g/L; C2為干菌質(zhì)量濃度，g/L;W為恒重后稱量重量，g；V為樣品的體積，L.

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化底物DKTP制備產(chǎn)物(S)-DHTP菌株的篩選

產(chǎn)物外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，由圖1可知：標(biāo)準(zhǔn)品(S)-DHTP 出峰大約在24.33 min處，(R)-DHTP 出峰在35.06 min處.高效液相色譜檢測(cè)篩選出的菌株對(duì)底物DKTP的轉(zhuǎn)化能力和產(chǎn)物構(gòu)型.由圖2可知：(S)-DHTP 出峰在24.53 min處，DKTP出峰在40.39 min處.初篩平板培養(yǎng)基上有12株初始菌株長出，分別挑出經(jīng)復(fù)篩液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，得到7株菌株.其中：命名為Candidautiliszjut 125，Candidapseudotropicaliszjut 114，Rhodotorulaqlutiniszjut 210，Candidafamatazjut 227四種菌株轉(zhuǎn)化底物得到的產(chǎn)物為R型；命名為Candidapseudotropicaliszjut 102，Candidapseudotropicaliszjut 107的菌株轉(zhuǎn)化底物所得產(chǎn)物構(gòu)型為S型，但轉(zhuǎn)化率與e.e.值均不高于40%.研究過程中篩選到一株對(duì)底物轉(zhuǎn)化效果較好的菌株，該菌株可不對(duì)稱轉(zhuǎn)化底物DKTP成目的產(chǎn)物(S)-DHTP，e.e.值大于99%.分離純化該菌株后送上海生工進(jìn)行菌種鑒定.

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖譜Fig.1　High performance liquid chromatography chart of standard sample

圖2　供試菌株轉(zhuǎn)化所得產(chǎn)物的高效液相色譜圖譜Fig.2　HPLC chart of the product converted by isolated strain

2.2菌種鑒定

將供試菌株26S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)該菌株序列與Candidatropicalis具有99%的同源性.根據(jù)BLAST同源性對(duì)比結(jié)果以及MEGA6.0軟件分析計(jì)算,得到供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,確定供試菌株在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位.該菌株與其他種屬酵母菌間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系如系統(tǒng)進(jìn)化樹所示(圖3),再結(jié)合供試菌卵圓形的細(xì)胞形狀和邊緣整齊、表面光滑平坦、粘稠濕潤的菌落形態(tài)學(xué)特征,確定該菌株屬于假絲酵母屬,命名為Candidatropicaliszjut 22[9].

圖3　供試菌株與酵母其他種屬間的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3　Phylogenetic tree about isolated strain and other yeasts

2.3培養(yǎng)條件優(yōu)化

選擇不同的碳源、氮源種類及其質(zhì)量濃度、無機(jī)磷質(zhì)量濃度進(jìn)行二級(jí)發(fā)酵實(shí)驗(yàn),通過測(cè)定比較發(fā)酵液的干菌質(zhì)量濃度，從而確定最佳的的培養(yǎng)基組份.

2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)

1) 碳源種類和最佳質(zhì)量濃度對(duì)Candidatropicaliszjut 22細(xì)胞生長的影響

不同微生物有著各自生長或產(chǎn)酶的最佳碳源，因此考察了培養(yǎng)基中碳源種類對(duì)提高菌體干菌質(zhì)量濃度的影響.通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較得出葡萄糖為較合適的碳源(圖4)，說明微生物Candidatropicaliszjut 22能夠優(yōu)先利用單糖——葡萄糖進(jìn)行生長，采用葡萄糖為碳源可以獲得較高的菌體質(zhì)量濃度.選擇葡萄糖為最佳碳源，改變其質(zhì)量濃度，進(jìn)一步研究有利于Candidatropicaliszjut 22生長的最佳葡萄糖質(zhì)量濃度，圖5結(jié)果表明30 g/L葡萄糖為最佳碳源質(zhì)量濃度.

圖4　碳源種類對(duì)菌體生長的影響Fig.4　Effect of different carbon on cell growth

圖5　葡萄糖的質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長的影響Fig.5　Effect of glucose concentration on cell growth

2) 氮源的種類和質(zhì)量濃度對(duì)Candidatropicaliszjut 22生長的影響

氮源是微生物生長代謝和生物合成的第二大物質(zhì)和必不可少的營養(yǎng)源，可以為菌體代謝生長和RNA積累提供必需的氨基酸和核苷前體.不同種類的氮源對(duì)微生物細(xì)胞的生長有很大差別，因此考察了培養(yǎng)基中不同氮源對(duì)菌體干菌質(zhì)量濃度的影響.圖6顯示不同種類的氮源對(duì)細(xì)胞生長的影響顯著不同，速效氮源硫酸銨為最佳的氮源.硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞生長的影響如圖7所示，5 g/L的硫酸銨為最佳氮源質(zhì)量濃度[10].

圖6　氮源種類對(duì)菌體生長的影響Fig.6　Effect of different nitrogen source on cell growth

圖7　硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長的影響Fig.7　Effect of (NH4)2SO4 concentration on cell growth

3) 無機(jī)磷質(zhì)量濃度的選擇

磷酸鹽是菌體生長的主要限制營養(yǎng)成分,對(duì)菌體生長階段的細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活力，丙酮酸質(zhì)量濃度，糖類底物的代謝和發(fā)酵液的pH值有著一定程度的影響，它的質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)是控制次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的重要手段.低質(zhì)量濃度的磷酸鹽可以促進(jìn)菌體的生長，隨著磷酸鹽質(zhì)量濃度的提高，會(huì)產(chǎn)生飽和作用，并對(duì)菌體的生長產(chǎn)生抑制作用.通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較得到不同磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長的影響,選擇2 g/L為較適宜無機(jī)磷質(zhì)量濃度(圖8).

2.3.2正交實(shí)驗(yàn)對(duì)菌體質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)化率的影響

通過選擇葡萄糖(A)、酵母粉(B)、磷酸鹽(C)、硫酸銨(D)4個(gè)因素,分別以4個(gè)不同質(zhì)量濃度水平確定四因素四水平正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表2所示.

圖8　不同磷酸鹽濃度對(duì)菌體生長的影響Fig.8　Effect of phosphate concentration on cell growth

實(shí)驗(yàn)編號(hào)因素水平ABCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化率/%干菌質(zhì)量濃度/(g·L-1)1111178.6110.842122283.4611.363133389.6212.244144481.2211.565212376.3111.456221483.0412.857234194.4216.368243282.8914.029313472.829.8510324376.8910.0311331275.885.8212342183.248.6313414273.545.9214423180.556.6115432470.346.7816441375.926.43

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析(表3)中，K1，K2，K3，K4分別為各因素對(duì)應(yīng)列上1,2,3,4水平效應(yīng)考察的綜合平均值，各因素中4個(gè)不同水平對(duì)干菌質(zhì)量濃度和底物轉(zhuǎn)化率影響的大小由相應(yīng)的K值大小反映.R是極差，值為同一因素中最大K值與最小K值之差，各因素對(duì)干菌質(zhì)量濃度和底物轉(zhuǎn)化率的影響主次由極差的大小判斷，R值的大小表明相應(yīng)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，R值越大，則相應(yīng)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大，反之亦然.比較各因素下極差值R的大小，可以得到影響菌體干菌質(zhì)量濃度的因素主次順序?yàn)椋浩咸烟?磷酸鹽>硫酸銨>酵母粉.影響菌體對(duì)底物轉(zhuǎn)化率的因素主次順序?yàn)椋浩咸烟?硫酸銨>酵母粉>磷酸鹽.分析結(jié)果表明，在得到較高菌體質(zhì)量濃度的培養(yǎng)條件下，相應(yīng)也能得到較高的轉(zhuǎn)化率.菌體的最佳培養(yǎng)條件為A2B3C4D1，即最優(yōu)的培養(yǎng)基配比為:碳源葡萄糖30 g/L，氮源硫酸銨5 g/L，酵母粉10 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L.菌種二級(jí)發(fā)酵液在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，120 r/min轉(zhuǎn)速和30 ℃溫度條件下培養(yǎng)36 h，菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90%左右,菌體的干菌質(zhì)量濃度可以達(dá)到14 g/L以上[11].

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3結(jié)論

本研究篩選得到一株假絲酵母Candidatropicaliszjut 22，該菌株能不對(duì)稱還原底物DKTP生成手性藥物度洛西汀的關(guān)鍵中間體(S)-DHTP，具有高轉(zhuǎn)化率和較好的對(duì)映體過剩值(轉(zhuǎn)化率>95%，e.e.>99%).使微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)度洛西汀手性中間體變得經(jīng)濟(jì)可行.通過單因素試驗(yàn)，確定了適合所篩假絲酵母菌株Candidatropicaliszjut 22菌體生長的液體培養(yǎng)基中最佳碳源、氮源以及無機(jī)鹽的組份和質(zhì)量濃度.然后通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化了培養(yǎng)基中各組份的配比，從而確定了最優(yōu)液體培養(yǎng)基組成.10%接種量下，接種菌種在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在120 r/min和30 ℃的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)36 h，菌體對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90%左右,可以得到14 g/L以上的菌體干菌質(zhì)量濃度.本研究為進(jìn)一步將Candidatropicaliszjut 22應(yīng)用于DKTP的不對(duì)稱轉(zhuǎn)化合成度洛西汀關(guān)鍵手性中間體(S)-DHTP奠定基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：劉巖)

Screening, identification and cultivation of microorganisms for preparation of duloxetine chiral intermediate

OU Zhimin, YANG Ce, YANG Gensheng

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:(S)-DHTP is key chiral intermediate for synthesis of duloxetine. A biotransformation method was used to screen fungus from soil in order to obtain a fungus capable of reducing N,N-dimethyl-3-keto-3-(2-thienyl)-1-propanamine (DKTP) to (S)-DHTP, a key precursor to synthesize duloxetine. A fungus was obtained which was capable of asymmetrically reduce DKTP to (S)-DHTP with high yield (more than 90%) and high enantiometric excess (more than 99%). The DNA sequence of 26S rDNA identification showed that the fungus belong to the Genus of Candida, and was named as Candida tropicalis zjut 22. The screened fungus could efficiently and asymmetrically reduce DKTP to (S)-DHTP. Compared with the chemical method, the reaction conditions of the microbial transformation are mild and environmentally friendly. The medium content was optimized by Univariate Orthogona and Orthogonal experimental analysis. The concentration of cells can reach up to 14 g/L (cell dry weight/volume of fermentation).

Keywords:duloxetine；biotransformation；(S)-DHTP；Candida tropicalis

收稿日期：2015-11-23

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY15B060005)

作者簡介：歐志敏(1973—)，女，遼寧鐵嶺人，教授，博士，研究方向?yàn)樯扑幒兔腹こ?，E-mail:oozzmm@zjut.edu.cn.

中圖分類號(hào)：R971.43

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)03-0340-06