表皮葡萄球菌icaADBC操縱子檢出與細(xì)菌耐氨基糖苷類抗菌藥物的關(guān)系

包裕杰，張雯雁，葉楊芹，奚　婷，陳芳瑩，范列英

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科　200120)

·論著·

表皮葡萄球菌icaADBC操縱子檢出與細(xì)菌耐氨基糖苷類抗菌藥物的關(guān)系

包裕杰，張雯雁，葉楊芹，奚婷，陳芳瑩，范列英

(同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科200120)

摘要:目的分析臨床分離表皮葡萄球菌對不同類型氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥特征；分析icaADBC操縱子在臨床分離的表皮葡萄球菌中的檢出及與細(xì)菌耐藥的關(guān)系。方法收集2013年1～10月上海市東方醫(yī)院臨床分離的表皮葡萄球菌77株，采用紙片擴(kuò)散法檢測細(xì)菌4種氨基糖苷類抗菌藥物(慶大霉素、鏈霉素、奈替米星和阿米卡星)藥敏試驗(yàn)特征；構(gòu)建icaADBC特異性引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增技術(shù)檢測77株細(xì)菌中icaADBC的分布狀況。結(jié)果結(jié)果77株表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高，分別為慶大霉素：62.3%，鏈霉素：61.0%，阿米卡星：22.1%，奈替米星：23.4%。icaADBC操縱子的檢出率為20.8%，ica陽性菌株與陰性菌株對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論臨床分離的icaADBC操縱子陽性表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高。

關(guān)鍵詞:icaADBC；表皮葡萄球菌；氨基糖苷類抗菌藥物

表皮葡萄球菌是一種革蘭染色陽性、凝固酶陰性的葡萄球菌，一般黏附于人體的皮膚和黏膜，是重要的條件致病菌。隨著插管、透析技術(shù)、人工心瓣膜、人工關(guān)節(jié)和人工晶體等醫(yī)療材料的廣泛應(yīng)用，人口老年化及免疫低下人群的出現(xiàn)等，表皮葡萄球菌的感染日趨嚴(yán)重。已證實(shí)icaADBC操縱子編碼產(chǎn)物是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分[1]。本研究分析icaADBC操縱子在臨床分離表皮葡萄球菌中的檢出率，以及細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥情況，進(jìn)而明確分析icaADBC與細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1菌株來源標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)，由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供，作為本研究的藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株及陰性對照菌株；臨床分離菌株為2013年1～10月上海市東方醫(yī)院臨床分離表皮葡萄球菌77株。

1.2抗菌藥物和培養(yǎng)基抗菌藥物：慶大霉素(10 μg/mL),奈替米星(30 μg/mL),鏈霉素(10 μg/mL),阿米卡星(30 μg/mL)，藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基(MH瓊脂)為英國Oxoid公司產(chǎn)品，血瓊脂平板為北京賽墨飛世爾有限公司產(chǎn)品。

1.3儀器與試劑Micro-Scan Walkaway-96全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)；ABI-7000熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析儀，Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)。PCR所需試劑購自上海閃晶生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)對所有表皮葡萄球菌臨床分離菌株及質(zhì)控菌株做氨基糖苷類抗菌藥物藥敏試驗(yàn)，包括慶大霉素、奈替米星、鏈霉素和阿米卡星。結(jié)果按照CLSI2015版判斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[2]。

1.4.2模板DNA制備將各臨床分離菌株及質(zhì)控菌株接種于血瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)過夜，取適量菌落加入300 μL生理鹽水，混勻，10 000 r/min離心5 min；棄上清，加入300 μL雙蒸水，混勻，煮沸100 ℃，15 min；12 000 r/min離心2 min；取上清液為DNA模板。

1.4.3構(gòu)建引物icaADBC特異性引物:icaA上游引物為5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′;icaA下游引物為5′-TGC CTC TGT CTG GGC TTG ACC-3′。icaC上游引物為5′-ACG CAA TAT TTT TAT TTT CGG CAC CCC-3′；icaC下游引物為5′-ACT CTC TTA ACA TCA TTC CGA CGC CT-3′。

1.4.4PCR擴(kuò)增50 μLPCR 擴(kuò)增體系：MgCl2(25 mmol)，dNTP(10 mmol)，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)，10×PCR Buffer(25 mmol)，上游引物(50 pmol)，下游引物(50 pmol)，DNA模板5 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.4.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析1.2%瓊脂糖凝膠于1×硼酸緩沖液，用0.5 μg/mL溴化乙錠染色，150 V電壓下電泳約30 min，將PCR擴(kuò)增所得特異性片段克隆測序,并在MegaBlast上進(jìn)行基因序列比對。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.14種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥結(jié)果見表1。

表1　　77株表皮葡萄球菌對氨基糖苷類

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1icaA PCR擴(kuò)增結(jié)果77株表皮葡萄球菌臨床分離菌株中有16株檢出icaA，檢出率為20.8%，特異性片段長度在300～400 bp(圖1),將PCR擴(kuò)增得到特異性片段克隆測序，片段長度為386 bp。

圖1　　icaA PCR擴(kuò)增結(jié)果

注：條帶1、3、4、6～9為凝固酶陰性葡萄球菌臨床分離菌株，條帶5為DL500 ladder，條帶2為ATCC 25923。

2.2.2icaC PCR擴(kuò)增結(jié)果選取之前檢測到icaA位點(diǎn)的16株表皮葡萄球菌，對其進(jìn)行icaC位點(diǎn)檢測。其中有8株檢測到icaC位點(diǎn)，檢出率為50.0%，特異性片段長度在800～1 000 bp(圖2)。將PCR擴(kuò)增得到特異性片段克隆測序，片段長度為807 bp。

注：條帶1為100 bp ladder，條帶2～8、10為表皮葡萄球菌臨床分離菌株，條帶9為金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株(陰性對照)。

圖2icaC PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3氨基糖苷類抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果與ica檢出結(jié)果分析77株表皮葡萄球菌臨床分離株中ica陽性菌有16株，占20.8%；ica陰性菌有61株，占79.2%。16株陽性菌對慶大霉素耐藥的有15株,占93.8%,還有1株敏感，占6.2%；對阿米卡星耐藥的有10株,占62.5%，中介有2株,占12.5%，敏感有4株，占25.0%；對鏈霉素耐藥的有15株,占93.8%，還有1株中介，占6.2%；對奈替米星耐藥的有10株,占62.5%，中介有2株,占12.5%，敏感有4株，占25.0%(表2)。

表2　　16株ica陽性菌株細(xì)菌耐藥性結(jié)果[n(%)]

2.4icaADBC檢出結(jié)果與細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性關(guān)系見表3。

表3　　表皮葡萄球菌ica檢出與細(xì)菌對氨基糖苷類

注：R表示細(xì)菌對抗菌藥物耐藥；NR表示細(xì)菌對抗菌藥物非耐藥(敏感或中介)。

3討論

表皮葡萄球菌是一種常見的條件感染病原菌[3]。由于表皮葡萄球菌分泌的毒性因子較金黃色葡萄球菌少，導(dǎo)致其致病的主要因素是伴隨“異物”(高分子材料如塑料等)進(jìn)入人體，并通過黏附形成生物膜[4-5]。它不僅使宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)呈抑制狀態(tài)，促使表皮葡萄球菌增殖，而且其黏液阻礙了親水性的抗菌藥物進(jìn)人菌體發(fā)揮殺菌作用，引起表皮葡萄球菌對抗菌藥物的多重耐藥[6]。

氨基糖苷類抗菌藥物是一類重要的抗感染藥物，具有水溶性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)和吸收排泄良好等特點(diǎn)。因其具有濃度依賴性快速殺菌作用、與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生協(xié)同作用、細(xì)菌耐藥性低、臨床有效和價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床常用藥物[7-8]。

本研究以慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素和奈替米星作為代表藥物檢測表皮葡萄球菌的耐藥特征，結(jié)果顯示，對慶大霉素耐藥率為62.3%，對阿米卡星耐藥率為22.1%，對鏈霉素耐藥率為61.0%，對奈替米星耐藥率為23.4%。由此說明試驗(yàn)菌株對氨基糖苷類抗菌藥物有不同程度耐藥，其中對半人工合成的阿米卡星及奈替米星耐藥率較直接由微生物產(chǎn)生的鏈霉素和慶大霉素低。

icaA編碼是412個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，Staphylococcus carbosus體外多糖胞間黏附素(PIA)合成試驗(yàn)表明，icaA單獨(dú)呈現(xiàn)低的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶活性,icaC編碼是355個(gè)氨基酸組成的疏水蛋白，icaC與外排作用有關(guān)，可有效抵擋抗菌藥物侵入[9-10]。

本研究先檢測了icaA位點(diǎn)及其與表皮葡萄球菌臨床分離菌株對慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素和奈替米星這4種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的關(guān)系。結(jié)果77株表皮葡萄球菌臨床分離菌株中icaA陽性菌有16株，占20.8%，這16株陽性菌對慶大霉素和鏈霉素均耐藥有15株,占93.8%；對阿米卡星和奈替米星均耐藥有10株,占62.5%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌檢出ica與細(xì)菌耐氨基糖苷類抗菌藥物差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

已證實(shí)細(xì)菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因是細(xì)菌產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶AAC(6′)-APH(2″),編碼此酶的耐藥基因可由復(fù)合型轉(zhuǎn)座子Tn4001轉(zhuǎn)入并整合到染色體中。插入序列IS256是復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn4001的組成部分，IS256可參與icaADBC的表達(dá)調(diào)控。葡萄球菌生物膜的形成主要是由操縱子icaADBC的表達(dá)所介導(dǎo)，它能編碼產(chǎn)生多糖細(xì)胞間外源凝集素的酶PIA,經(jīng)過相變異產(chǎn)生PIA，這個(gè)過程受IS256在操縱子ica插入熱點(diǎn)上交替的插入和切除影響[11]。通過上述關(guān)聯(lián)可以在一定程度解釋為何產(chǎn)生生物膜的表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥[12]。

綜上所述，表皮葡萄球菌臨床分離菌株對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高，對半合成類抗菌藥物耐藥率相對較低，因此臨床用藥應(yīng)優(yōu)先考慮此類藥物。含有icaADBC的細(xì)菌往往對氨基糖苷類抗菌藥物表現(xiàn)出更高的耐藥性，或與細(xì)菌生物膜形成有關(guān)，應(yīng)增加細(xì)菌對抗菌藥物的抵抗力，值得臨床進(jìn)一步研究。

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Relationship between icaADBC in Staphylococcus epidermidis and the resistance to aminoglycosides

BAOYujie,ZHANGWenyan,YEYangqin,XITing,CHENFangying,FANLieying

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiEastHospitalAffiliatedofTongjiUniversity,Shanghai200120,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus epidermidis to different kinds of aminoglycoside and to explore the relationship between icaADBC in Staphylococcus epidermidis and the resistance to aminoglycosides.MethodsAntimicrobial susceptibility to different aminoglycosides including gentamicin,streptomycin,netimicin and amikacin were tested in 77 isolated strains by the agar diffusion method.The iac ADBC specific primers were constructed.And the icaADBC of 77 strains were detected by PCR amplification technology.ResultsThe resistance to aminoglycosides were as following:23.4%,61.0%,22.1% and 62.3%of the 77 strains were resistant to netilmicin,streptomycin,amikacin and gentamicin,respectively.Among the 77 stains,the positive rate of icaADBC was 20.8%.The differences of resistance to aminoglycosides between ica positive strains and ica negative strains had statistic significance(P<0.05).ConclusionClinical Staphylococcus epidermidis isolated with icaADBC show high percentage of resistance to aminoglycosides.

Key words:icaADBC;Staphylococcus epidermidis;aminoglycosides

作者簡介：包裕杰，男，主管技師，主要從事臨床微生物領(lǐng)域方面的研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.012

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1479-03

(收稿日期：2015-12-21修回日期：2016-03-13)