暗棕壤性蘋果梨園土壤有機(jī)磷組分提取流程的優(yōu)化

竇文濤，王非非，謝修鴻，程　晶，梁運(yùn)江*

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林　延吉　133002；2. 長(zhǎng)春大學(xué)園林學(xué)院，吉林　長(zhǎng)春　130022)

暗棕壤性蘋果梨園土壤有機(jī)磷組分提取流程的優(yōu)化

竇文濤1，王非非1，謝修鴻2，程晶1，梁運(yùn)江1*

(1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；2. 長(zhǎng)春大學(xué)園林學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130022)

摘要：對(duì)吉林省延邊州延吉市暗棕壤性蘋果梨園土壤有機(jī)磷進(jìn)行測(cè)定，參照熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法，對(duì)有機(jī)磷組分提取中不同條件進(jìn)行優(yōu)化探索。結(jié)果表明，對(duì)于酸性蘋果梨園土壤，提取不同組分有機(jī)磷的優(yōu)化步驟為：土壤經(jīng)氯仿處理后，加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液超聲波10 min，振蕩30 min提取活性有機(jī)磷；再用0.1 mol·L-1NaOH溶液處理殘余土壤，超聲波10 min，振蕩4 h提取穩(wěn)定性有機(jī)磷且浸提液中無(wú)機(jī)磷為中活性有機(jī)磷，把該浸提液的酸度調(diào)至pH 3，上清液中測(cè)中穩(wěn)性有機(jī)磷，沉淀中為高穩(wěn)性有機(jī)磷；繼續(xù)用1 mol·L-1H2SO4溶液浸提殘余土樣，振蕩3 h，提取中活性有機(jī)磷。

關(guān)鍵詞：蘋果梨園；土壤；有機(jī)磷

土壤有機(jī)磷是土壤磷庫(kù)的重要組成部分，其形態(tài)和變化對(duì)土壤供磷能力和保障植物磷素營(yíng)養(yǎng)舉足輕重，一般占土壤全磷20%～80%，高的可達(dá)95%[1-2]，主要來(lái)源于動(dòng)植物和微生物殘?bào)w[3]，Hedley[4]等1982 年利用一種連續(xù)浸提的技術(shù)，這個(gè)技術(shù)重要的特點(diǎn)是細(xì)化了在土壤循環(huán)中不可缺少的微生物磷的數(shù)量[5]。土壤有機(jī)磷分級(jí)的研究開(kāi)始于20世紀(jì)60年代，其中Bowman和Cole (1978)[6]是第1個(gè)將有機(jī)磷分組體系完善的科學(xué)家。該體系將土壤有機(jī)磷分為4種形態(tài)：活性有機(jī)磷，用0.5 mol·L-1NaHCO3( pH=8.5) 浸提；中活性有機(jī)磷由溶于1.0 mol·L-1H2SO4的磷酸根和溶于0.5 mol·L-1NaOH的磷酸基團(tuán)組成；中穩(wěn)性有機(jī)磷(富里酸磷)；高穩(wěn)性有機(jī)磷(胡敏酸磷)。隨著有機(jī)農(nóng)業(yè)和生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，土壤有機(jī)磷在土壤學(xué)和植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中日益受到重視[7]。其中我國(guó)學(xué)者熊恒多等[8]和范業(yè)寬等[9]對(duì)Bow man-Cole體系進(jìn)行了修正，修正后的體系中，將土壤預(yù)先用氯仿處理,然后再用 0.5 mol·L-1NaHCO3(pH=8.5)處理，以提取活性有機(jī)磷。而后先用0.1 mol·L-1NaOH浸提出穩(wěn)定性有機(jī)磷后,再用1.0 mol·L-1H2SO4浸提出中活性有機(jī)磷。1993年熊恒多等[8]就酸性水稻土有機(jī)磷分組進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)。而后有學(xué)者借鑒酸性水稻土有機(jī)磷分組方法對(duì)石灰性土壤有機(jī)磷有效性分組進(jìn)行過(guò)研究，研究結(jié)果[10]表明：用0.05 mol·L-1NaOH提取穩(wěn)定性有機(jī)磷對(duì)石灰性土壤更合適，中穩(wěn)性有機(jī)磷和高穩(wěn)性有機(jī)磷較為理想的pH分界值為3.0。由于石灰性土壤的組成和性質(zhì)與酸性水稻土顯著不同，因此不同形態(tài)有機(jī)磷的提取條件有明顯的變化。而針對(duì)北方酸性果園土壤適合的有機(jī)磷組分提取流程研究還未見(jiàn)報(bào)道，為此本研究以延邊地區(qū)蘋果梨園酸性土壤為試驗(yàn)材料，參照熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法[11-12]，并對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生的若干問(wèn)題加以解決和改進(jìn)，優(yōu)化了提取北方酸性果園土壤不同形態(tài)有機(jī)磷的條件，為北方土壤有機(jī)磷組分提取提供參考。

1材料與分析

1.1供試土壤

供試材料為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹(shù)試驗(yàn)基地蘋果梨園土壤，2015年4月在果園中隨機(jī)選取樹(shù)體健康、長(zhǎng)勢(shì)良好的蘋果梨樹(shù)，避開(kāi)施肥處，在距離樹(shù)干1 m處設(shè)置采樣點(diǎn)，采樣深度為0～20 cm，其土壤類型為暗棕壤，質(zhì)地為粘土，土壤的基本化學(xué)性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1　供試土壤基本性質(zhì)

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)參照熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法[11-12]，具體步驟如下：

土樣經(jīng)氯仿處理后，加碳酸氫鈉溶液，按0、5、10、15 min超聲波處理，在振蕩機(jī)上振蕩30 min(250 r·min-1)，離心后上清液測(cè)定活性有機(jī)磷，重復(fù)3次；

按上面優(yōu)化的時(shí)間進(jìn)行超聲波處理，設(shè)置0、20、25、30、35 min進(jìn)行振蕩，離心后上清液測(cè)定活性有機(jī)磷，重復(fù)3次；

按熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法浸提順序，用0.1 mol·L-1NaOH浸提殘余土樣，按0、5、10、15 min超聲波處理后，連續(xù)振蕩4 h，離心后上清液測(cè)定穩(wěn)定性有機(jī)磷，重復(fù)3次。

按上面優(yōu)化的時(shí)間進(jìn)行超聲波處理，設(shè)置0、2、3、4、5 h進(jìn)行振蕩，離心后上清液測(cè)穩(wěn)定性有機(jī)磷，重復(fù)3次。

設(shè)NaOH濃度為0.025、0.05、0.10、0.20 mol·L-1，按前面優(yōu)化的超聲波處理時(shí)間和振蕩時(shí)間進(jìn)行處理，提取上清液測(cè)穩(wěn)定性有機(jī)磷，重復(fù)3次。

按熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法浸提順序，設(shè)置上面優(yōu)化的NaOH濃度、超聲波處理時(shí)間和振蕩時(shí)間，提取的穩(wěn)定性有機(jī)磷溶液所有上清液倒在一起混勻，測(cè)定穩(wěn)定性有機(jī)磷；同時(shí)取上清液50 mL于150 mL三角瓶中(或相應(yīng)縮減，例如取上清液20 mL于100 mL三角瓶中)，加濃鹽酸酸化分別調(diào)節(jié)至pH為1.4、1.8、2.2、2.6、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3，每個(gè)處理重復(fù)3次，靜置過(guò)夜并用定量濾紙過(guò)濾出上清液。取酸化后上清液測(cè)定中穩(wěn)定性有機(jī)磷；穩(wěn)定性有機(jī)磷減去中穩(wěn)定性有機(jī)磷含量為高穩(wěn)定性有機(jī)磷含量。

將NaOH處理后的殘余土樣用H2SO4溶液浸提，設(shè)H2SO4濃度為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol·L-1，提取上清液測(cè)定中活性有機(jī)磷，重復(fù)3次。

按熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法浸提順序，按上面篩選出的硫酸濃度，設(shè)置0、1、2、3、4 h振蕩，提取上清液測(cè)定中活性有機(jī)磷含量，重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel SPSS 11.5軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(α=0.05)。折線圖觀測(cè)點(diǎn)，上端用誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤大小，不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1活性有機(jī)磷提取參數(shù)

2.1.1活性有機(jī)磷超聲波處理時(shí)間如圖1所示，不加超聲波處理，活性有機(jī)磷提取量最低為8.38 mg·kg-1，分析得出：各超聲波處理時(shí)間段活性有機(jī)磷提取量無(wú)顯著性差異, 但是為了保證超聲波的足夠作用時(shí)間，充分地提取活性有機(jī)磷含量，選取活性有機(jī)磷均值最高對(duì)應(yīng)的10 min超聲波處理時(shí)間作為試驗(yàn)建議處理時(shí)間。

2.1.2活性有機(jī)磷振蕩處理時(shí)間如圖2所示，隨振蕩處理時(shí)間的不斷增加，與活性有機(jī)磷提取量的關(guān)系曲線呈向上傾斜M形變化。隨振蕩處理時(shí)間增加到20 min，活性有機(jī)磷提取含量顯著上升，20～25 min振蕩處理提取量無(wú)顯著性差異，25～30 min振蕩處理提取量顯著增加，隨后繼續(xù)增加振蕩處理時(shí)間提取量無(wú)顯著性差異。另外直觀上可以看出30 min振蕩處理時(shí)間提取量高于35 min且30 min振蕩處理時(shí)間提取量為所有時(shí)間段提取量的最高值。所以，從在活性有機(jī)磷提取量和節(jié)約能源角度來(lái)看，活性有機(jī)磷振蕩處理時(shí)間最合理的時(shí)間是30 min。

2.2穩(wěn)定性有機(jī)磷提取參數(shù)

2.2.1穩(wěn)定性有機(jī)磷超聲波處理時(shí)間如圖3所示，超聲波處理時(shí)間與穩(wěn)定性有機(jī)磷提取的關(guān)系曲線呈不規(guī)則的倒V形變化，穩(wěn)定性有機(jī)磷提取量10 min與其他時(shí)間段對(duì)比含量均顯著增加，其他時(shí)段含量間無(wú)顯著性差異。顯而易見(jiàn)，活性有機(jī)磷提取量最高點(diǎn)為超聲波處理時(shí)間10 min，提取量高達(dá)19.87 mg·kg-1。

2.2.2穩(wěn)定性有機(jī)磷振蕩處理時(shí)間如圖4所示，振蕩處理時(shí)間與穩(wěn)定性有機(jī)磷關(guān)系曲線呈M形變化，分析得出：無(wú)震蕩處理時(shí)間到振蕩處理時(shí)間2 h，穩(wěn)定性有機(jī)磷提取量顯著增加。2～3 h振蕩處理時(shí)間穩(wěn)定性有機(jī)磷提取含量顯著下降。3～4 h振蕩處理時(shí)間穩(wěn)定性有機(jī)磷提取含量顯著上升。4～5 h振蕩處理時(shí)間穩(wěn)定性有機(jī)磷提取含量無(wú)顯著性差異。從節(jié)約能源與時(shí)間角度來(lái)講，應(yīng)選穩(wěn)定性有機(jī)磷震蕩時(shí)間為4 h。

2.2.3穩(wěn)定性有機(jī)磷提取液NaOH濃度如圖5所示，NaOH濃度為0.025 mol·L-1時(shí)，穩(wěn)定性有機(jī)磷量最少為20.18 mg·kg-1，隨NaOH濃度增加到0.1 mol·L-1，穩(wěn)定性有機(jī)磷提取量也顯著增加，0.1 mol·L-1NaOH濃度繼續(xù)增加到0.2 mol·L-1時(shí)，穩(wěn)定性有機(jī)磷提取量無(wú)顯著性差異。由于0.1 mol·L-1NaOH數(shù)值高于0.2mol·L-1NaOH，所以，提取穩(wěn)定性有機(jī)磷NaOH濃度應(yīng)選擇0.1 mol·L-1。

2.3中穩(wěn)定性有機(jī)磷提取參數(shù)

2.3.1中穩(wěn)定性有機(jī)磷和高穩(wěn)定性有機(jī)磷pH分界在高穩(wěn)性有機(jī)磷中，植酸鐵在pH2.5～ 8 范圍內(nèi)呈不溶態(tài), pH< 2.5 或pH> 8.0 均呈可溶態(tài)，植酸鋁在 pH3～ 9呈不溶態(tài), G Anderson[12]也指出, 肌醇六磷酸鋁鹽在pH 值2. 9 方可沉淀完全。在中穩(wěn)性有機(jī)磷中，肌醇三磷酸鐵鹽在pH 3.2～ 6. 2 為不溶態(tài), 當(dāng)pH< 3.2 或pH > 6.2 均為可溶態(tài)[13]，所以pH應(yīng)控制在2.9～3.1。如圖6所示，pH為2.8之前，中穩(wěn)性和高穩(wěn)性有機(jī)磷含量曲線近似2條平行線，對(duì)于酸性蘋果梨園土，隨pH值繼續(xù)上升，溶液中產(chǎn)生沉淀物，高穩(wěn)性有機(jī)磷和中穩(wěn)性有機(jī)磷逐漸分離。當(dāng)pH=3時(shí)，中穩(wěn)性有機(jī)磷含量達(dá)到最高，pH繼續(xù)增加中穩(wěn)性有機(jī)磷含量下降，說(shuō)明有中穩(wěn)性有機(jī)磷從溶液中沉淀出來(lái)，所以中穩(wěn)性有機(jī)磷和高穩(wěn)性有機(jī)磷最高的分界為pH=3。

2.4中活性有機(jī)磷提取參數(shù)

2.4.1中活性有機(jī)磷提取液H2SO4濃度如圖7所示，H2SO4濃度為0.5 mol·L-1時(shí)，中活性有機(jī)磷提取量為最低。0.75～1 mol·L-1時(shí)，中活性有機(jī)磷提取量無(wú)顯著性差異，當(dāng)H2SO4濃度在1～1.25 mol·L-1時(shí)，中活性有機(jī)磷提取量顯著下降，H2SO4濃度增加到1.5 mol·L-1時(shí)中活性有機(jī)磷提取量無(wú)顯著性差異。在H2SO4濃度為1 mol·L-1中活性有機(jī)磷提取量達(dá)到最高值，所以浸提中活性有機(jī)磷H2SO4濃度選擇1 mol·L-1。

2.4.2中活性有機(jī)磷振蕩處理時(shí)間如圖8所示，可以看出 3 h提取量最大，最大值為108.03 mg·kg-1，分析得出除3 h外，其他時(shí)間段振蕩處理提取量無(wú)顯著性變化。所以，中活性有機(jī)磷振蕩處理時(shí)間最合理的是3 h。

3結(jié)論

提取蘋果梨園土壤有機(jī)磷4個(gè)組分的優(yōu)化步驟如下：土壤經(jīng)氯仿處理后，加入0.5 mol·L-1NaHCO3溶液超聲波10 min，振蕩30 min提取活性有機(jī)磷；再用0.1 mol·L-1NaOH溶液處理殘余土壤，超聲波10 min，振蕩4 h提取穩(wěn)定性有機(jī)磷，且浸提液中無(wú)機(jī)磷為較易被水解的中活性有機(jī)磷，這與前人研究結(jié)果一致。在熊-范改進(jìn)Bowman-Cole法中[11-12]并未提到中穩(wěn)性有機(jī)磷pH值問(wèn)題，經(jīng)過(guò)本研究提出把該浸提液的酸度調(diào)至pH=3，在上清液中測(cè)定中穩(wěn)性有機(jī)磷含量最好，所以就北方酸性果園土壤來(lái)說(shuō)，浸提中穩(wěn)性有機(jī)磷pH值調(diào)至為3，沉淀為高穩(wěn)性有機(jī)磷；繼續(xù)用1 mol·L-1H2SO4溶液浸提殘余土樣，與熊-范改進(jìn)Bowman-Cole[11-12]比較振蕩時(shí)間增加到3小時(shí)，來(lái)提取中活性有機(jī)磷。

另外，為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及測(cè)定液的用量，在保持水土比不變的基礎(chǔ)上增加了稱土量。為了避免反復(fù)更換玻璃儀器的污染以及繁瑣的操作，將盛放容器從頭到尾統(tǒng)一為120 mL離心管，來(lái)保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

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(責(zé)任編輯：黃愛(ài)萍)

Optimizing Extraction Process Organic Phosphorus Fractionation from Dark Brown Soil at Apple-pear Orchards

DOU Wen- tao1, WANG Fei-fei1，XIE Xiu-hong2， CHENG Jing1,LIANG Yun-jiang1*

(1.CollegeofAgriculture,YanbianUniversity,Yanji,Jilin133002,China；2.CollegeofLandscapeArchitecture，ChangchunUniversity，Changchun,Jilin130022,China)

Abstract：Dark brow soil at the apple-pear orchards at Yanji in the Korean Autonomous Prefecture of Yanbian in Jilin province was sampled for the experimentation on organic phosphorus fractionation. The process was optimized by using the Bowman-Cole method modified by Xiong Heng-duo and Fan Ye-kuan. The fractionation included the following major steps: (1) to the acidic soil pretreated with chloroform, 0.5 mol·L-1of NaHCO3 were added with ultrasonic treatment for 10 minutes followed by oscillation for 30 minutes to extract the labile organic phosphorus into the supernatant; (2) to the soil left after the initial extraction, 0.1 mol·L-1of NaOH was added with ultrasound for 10 minutes followed by oscillating for 4 hours to leach the stable and the moderately labile organic phosphorus fractions into the alkali solution; (3) to the above alkali supernatant, acid was added to adjust the pH to 3.00 to precipitate the highly stable organic phosphorus and allow the moderately stable fraction remain in the solution; and finally, (4) to the soil, 1 mol·L-1of H2SO4 was added with a constant oscillation for 3 hours to extract the moderately labile organic phosphorus. In comparison to the existing methods, the current fractionation process on the acidic orchard soil in north China appeared to have optimized the conditions with improved efficiency.

Key words：apple-pear orchard; soil; organic phosphorus

收稿日期：2016-12-16初稿；2016-03-18修改稿

作者簡(jiǎn)介：竇文濤(1992-)，男，碩士生，現(xiàn)主要從事土壤與植物營(yíng)養(yǎng)研究(E-mail: 846638941@qq.com) 共同第一作者：王非非(1991-)，女，碩士生，現(xiàn)主要從事土壤與植物營(yíng)養(yǎng)研究(E-mail: 664804629@qq.com) *通訊作者：梁運(yùn)江(1972-)，男，博士，副教授，現(xiàn)從事土壤與植物營(yíng)養(yǎng)研究(E-mail: lyjluo@ybu.edu.cn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460117); 延邊大學(xué)第7屆本科生科研立項(xiàng)項(xiàng)目(ydbksky2015052)

中圖分類號(hào)：S 153.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0384(2016)04-419-05

竇文濤，王非非，謝修鴻，等.暗棕壤性蘋果梨園土壤有機(jī)磷組分提取流程的優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(4)：419-423.

DOU W-T，WANG F-F，XIE X-H，et al.Optimizing Extraction Process Organic Phosphorus Fractionation from Dark Brown Soil at Apple-pear Orchards[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(4)：419-423.