草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1與其親本的肌肉特性比較研究

李迪 李偉 肖調(diào)義　褚武英　何美鳳　周智愚　金生振　鄧亞林

摘 要 為探討草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1的肉質(zhì)特點(diǎn)，以同規(guī)格的草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1和其親本草魚（母本）、赤眼鱒（父本）為材料，采用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定分析比較了三者肌肉質(zhì)構(gòu)特性，采用冷凍切片法和HE染色法統(tǒng)計(jì)分析比較了三者肌纖維數(shù)量和密度，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析了與肉質(zhì)特性關(guān)聯(lián)緊密的鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）基因、Ⅰ型膠原蛋白α1基因（COL1A1）和α2基因（COL1A2）.在雜交F1和親本肌肉中的表達(dá)量.結(jié)果顯示：雜交F1與母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異（P>0.05）；雜交F1的肌肉硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性均顯著高于母本草魚（P<0.05），與父本赤眼鱒無顯著差異；雜交F1的肌纖維直徑和密度與其母本草魚無顯著差異（P>0.05），與其父本赤眼鱒差異顯著（P<0.05）；COL1A1和COL1A2兩個(gè)基因在雜交F1肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其母本草魚（P<0.05），而與其父本赤眼鱒無顯著差異（P>0.05）；CAST基因在雜交F1肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其母本草魚（P<0.05），與其父本赤眼鱒無顯著差異（P>005）.

關(guān)鍵詞 草魚（♀）×赤眼鱒（♂）雜交F1；肉質(zhì)；肌纖維；I型膠原蛋白α1；I型膠原蛋白α2；鈣蛋白酶抑制蛋白

中圖分類號(hào) S963.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2537（2016）03-0028-06

Abstract Objective：To explore the muscle texture of the crossbreed F1. Method： The female parent grass carp （Ctenopharyngodon idellus） （♀） × Barbel chub （Squaliobarbus curriculus） （♂） F1（crossbreedF1） as well as their parents at the same specification were used for our research. The texture analyzer， the freezing sectioning technology and hematoxylin-eosin staining method were used for muscle characterization and fiber diameter. In addition， the spatio-temporal expression of COL1A1， COL1A2， CAST genes were identified by RT-PCR. Our results show that hybrid F1 muscle fiber diameter is less than that of the female parent grass carp. By using the real-time PCR technology， we found that COL1A1， COL1A2 and CAST genes expressions in hybrid F1 muscle volume were slightly higher than the expression on grass carp muscle. Results： The muscle tenderness， cohesiveness， springiness and chewiness in crossbreed F1 is significantly better than those of grass carp （P<0.05）. No significant difference was found for barbell chub. The muscle adhesiveness， gumminess and resilience had no significant difference in hybrid F1， grass carp and barbell chub （P>0.05）. The muscle fiber diameter and density of crossbreed F1 when compared with grass carp had no significant difference （P>0.05）. But they were significantly different when compared with barbell chub （P>0.05）. The expression of COL1A1， COL1A2， CAST genes in crossbreed F1 was significantly higher than that grass carp （P<0.05）， but was no significantly different in comparison with barbell chub （P>0.05）.

Key words grass carp （♀）×barbel chub （♂） crossbreed F1； muscle texture； muscle fiber； COL1A1；COL1A2；CAST

草魚是我國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水經(jīng)濟(jì)魚類.由于生產(chǎn)上近親繁殖的影響，草魚種質(zhì)資源衰退較為嚴(yán)重，疾病頻發(fā)，其品質(zhì)也呈下降趨勢(shì)，肉質(zhì)疏松、口感下降等問題嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價(jià)值.提高草魚抗病力和改善草魚肉質(zhì)是目前急需解決的問題，遠(yuǎn)緣雜交育種是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效方法之一.

赤眼鱒與草魚同屬雅羅魚亞科，不僅外形上與草魚相似，還具有抗草魚出血病毒（GCRV）強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，本課題研究團(tuán)隊(duì)在2010年完成了草魚與赤眼鱒的雜交試驗(yàn)，獲得了正交F1和反交F1兩個(gè)雜交子代群體[1].基于日常生活中魚產(chǎn)品肉質(zhì)的口感是吸引消費(fèi)者的重要原因，本實(shí)驗(yàn)選取正交F1為試驗(yàn)對(duì)象，結(jié)合其母本草魚和父本赤眼鱒的肉質(zhì)特點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行了肌肉特性分析比較研究，并采用Real Time PCR技術(shù)，從mRNA水平研究COL1A1，COL1A2，CAST三個(gè)基因在不同群體的表達(dá)水平，探索基因表達(dá)與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系，從分子水平對(duì)肌肉品質(zhì)差異的形成進(jìn)行初步分析，從而系統(tǒng)評(píng)價(jià)正交F1.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取18月齡雜交F1（體重953.09±23.63 g，體長(zhǎng)36.24±0.31 cm）、赤眼鱒（體重235.71±9.81 g，體長(zhǎng)20.54±0.35 cm）和草魚（體重2 215.65±69.65 g，體長(zhǎng)47.56±0.45 cm）健康個(gè)體各10尾，所有樣品均由瀏陽(yáng)烏龍漁場(chǎng)養(yǎng)殖基地提供.

1.2 樣品的采集和處理

每種魚各取10尾，取魚體側(cè)線上部的背部肌肉，在下面放有冰塊的解剖盤內(nèi)按橫縱方向修好組織塊（1 cm×1 cm×0.5 cm）.采下后放于30%的蔗糖溶液中脫水24 h.采取背中部肌肉樣品用于質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn).另采取部分背肌放入已滅菌的1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)定量PCR分析.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌肉質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定 采取魚背中部肌肉切成厚20 mm×15 mm×15 mm的小塊，利用TA.XT.Plus型物性測(cè)試儀（英國(guó)Stable Micro Systems公司），使用平底柱形探頭P/36，模擬人牙齒咀嚼食物，對(duì)樣品進(jìn)行兩次壓縮TPA測(cè)試，測(cè)試條件如下：測(cè)試前速率5 mm/s，測(cè)試速率1 mm/s，測(cè)試后速率5 mm/s，壓縮程度60%，停留間隔時(shí)間5 s，負(fù)重探頭類型：Auto-5g，數(shù)據(jù)收集率200 pps.樣品在室溫下進(jìn)行TPA測(cè)試，每尾魚取4個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定.

1.3.2 冷凍切片的制備 將樣品修整好后放入樣品托上，均勻抹上OCT，迅速放入冰凍切片機(jī)內(nèi).待OCT均變?yōu)榘咨?，用刀片休整組織塊并切片.其后再進(jìn)行HE染色.切片制作完成后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照（如圖1）.

1.3.3 相關(guān)肉質(zhì)基因表達(dá) 采用Trizol法提取肌肉RNA，按照Fermentas pure公司提供的cDNA試劑盒產(chǎn)品說明書完成cDNA第一鏈的合成.使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)COL1A1，COL1A2以及CAST的定量引物（如表1），送于鉑尚公司合成.用于熒光定量表達(dá)實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)程序如表2.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Image-pro plus 6.0進(jìn)行肌纖維統(tǒng)計(jì)，熒光定量數(shù)據(jù)用EXCEL進(jìn)行整理，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以各組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)構(gòu)特性

通過質(zhì)構(gòu)儀對(duì)雜交F1及其親本的測(cè)定，得到結(jié)果見表3.雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異（P>0.05）；雜交F1肌肉硬度和彈性（分別為4 791.02±427.89 g和0.65±0.05），顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性（分別為2 348.82±194.69 g和0.42±0.02） （P<0.05）.與其父本赤眼鱒肌肉硬度和彈性（分別為4 658.51±564.32 g和0.64±0.03），無顯著差異.

2.2 肌肉組織學(xué)分析

在倒置顯微鏡下觀察兩種魚的肌肉切片，可以看出雜交F1和母本草魚的肌纖維紋理清楚，排列緊密，基本結(jié)構(gòu)相同（圖1，彩圖見封三）.肌纖維直徑的測(cè)量：參考陳璐等[2]的計(jì)算方法，選取一定視野范圍內(nèi)的肌纖維進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出每根肌纖維的面積，并默認(rèn)為“圓”的面積，根據(jù)s=πr2（r為半徑）自動(dòng)計(jì)算出每根肌纖維的等效直徑，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，如圖2所示，肌纖維直徑大小在30～60 μm范圍內(nèi)的雜交F1占61%，母本草魚占68%，父本赤眼鱒占38%；纖維直徑在60～80 μm范圍內(nèi)的雜交F1占28%，母本草魚占25%，赤眼鱒占41%；80 μm以上的肌纖維直徑雜交F1占11%，母本草魚占7%，父本赤眼鱒占21%. 用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，見表4.結(jié)果表明，雜交F1的肌纖維直徑與其母本草魚肌纖維直徑差異不顯著（P>0.05），但顯著小于其父本赤眼鱒；雜交F1的肌纖維密度與其母本草魚的肌纖維密度無顯著差異（P>0.05），但顯著大于其父本赤眼鱒.

2.3 相關(guān)肉質(zhì)基因表達(dá)分析

以草魚RPL13作為內(nèi)參，考察COL1A1，COL1A2，CAST三個(gè)基因在F1和草魚肌肉中的表達(dá)，COL1A1和COL1A2兩個(gè)基因在父本赤眼鱒和雜交F1中的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），都較母本草魚高且差異顯著（P<0.05）.CAST基因在母本草魚和雜交F1中的表達(dá)量無顯著差異（P>0.05），都比父本赤眼鱒低且差異顯著（P<0.05）（如圖3）.

3 討論

肌纖維是組織學(xué)特性中較為重要的物理參數(shù)，是魚類肌肉品質(zhì)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[3-6].本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析了雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌纖維直徑和肌纖維密度.結(jié)果顯示，雜交F1的肌纖維直徑顯著小于父本赤眼鱒，與母本草魚的肌纖維直徑無顯著差異；雜交F1的肌纖維密度顯著大于父本赤眼鱒的肌纖維密度，與母本草魚的肌纖維密度無顯著差異.吳信生[7]等對(duì)我國(guó)7種地方雞種的組織學(xué)研究表明，肌纖維密度與肌肉的嫩度相關(guān)比較密切，7個(gè)地方雞種肌纖維密度與嫩度呈負(fù)相關(guān)，肌纖維直徑與嫩度呈正相關(guān)，即肌纖維愈細(xì)，肌纖維密度愈大，肉質(zhì)越鮮嫩.劉錚鑄[8]等對(duì)波爾山羊雜交后代肌肉組織學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)雜交后代羊與唐山奶山羊在眼肌肌纖維密度方面差異顯著，臂三頭肌肌纖維密度雖未達(dá)到顯著差異，但雜交后代明顯高于唐山奶山羊，說明雜交后代羊比唐山奶山羊的肉質(zhì)好.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與父本赤眼鱒相比，雜交F1的肌纖維直徑更小，肌纖維密度更大，這表明雜交F1肉質(zhì)比親本赤眼鱒更鮮嫩.

質(zhì)構(gòu)特性是決定其品質(zhì)的重要因素之一，儀器測(cè)定是質(zhì)構(gòu)特性的重要評(píng)價(jià)手段，一定程度上減少了人的主觀因素帶來的評(píng)價(jià)誤差.胡芬[9]等對(duì)5種淡水魚的質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行了相關(guān)性分析，得出硬度和彈性是影響魚肉質(zhì)構(gòu)特性的主要因素.本實(shí)驗(yàn)中雜交F1肌肉硬度和彈性，顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性.雜交F1肉質(zhì)硬度和彈性增強(qiáng)，會(huì)使其口感更好.

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者選出了COL1A1，COL1A2和CAST三個(gè)與肌肉嫩度和彈性相關(guān)基因， 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法從分子水平上進(jìn)一步對(duì)上述組織學(xué)水平指標(biāo)做出解釋.鈣蛋白酶系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，是降解肌原纖維蛋白的主要酶系統(tǒng)，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速環(huán)節(jié)，在肌肉的嫩化過程中起著重要作用[10-12].蛋白酶CAST系統(tǒng)在魚類中的相關(guān)研究報(bào)道不多，只有斑馬魚[13]、虹鱒[14]和草魚的部分mRNA被克隆分離.Dutt等[15]研究表明，Calpastatin表達(dá)量的減少都會(huì)導(dǎo)致肌肉蛋白水解及肉質(zhì)嫩度的增加，表明鈣蛋白酶水解作用才是導(dǎo)致肉質(zhì)嫩化的主要因素.關(guān)磊[16]等研究表明鈣蛋白酶抑制蛋白 mRNA 的高表達(dá)水平可提高魚類肌肉生長(zhǎng)率和魚肉硬度、堅(jiān)韌性，CAST基因在肌肉中的表達(dá)可影響其肉質(zhì)硬度.本實(shí)驗(yàn)中CAST基因在雜交F1肌肉上的表達(dá)量與父本赤眼鱒無顯著差異，但是顯著高于其母本草魚，通過質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn)得出，雜交F1的肉質(zhì)變硬，彈性變大，可能也是和CAST基因在肌肉中的表達(dá)量提高有關(guān).

Hatae[17]等人研究表明，魚類肌肉的堅(jiān)韌性與膠原蛋白的含量密切相關(guān).在大西洋鮭[18]研究表明，肌肉中膠原蛋白含量的增加使肌肉具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，凝聚性增大.李文倩[19]等的實(shí)驗(yàn)中表明，膠原蛋白含量與質(zhì)構(gòu)參數(shù)均呈正相關(guān)，膠原蛋白含量增加能夠改善肌肉質(zhì)構(gòu)，較高的肌肉膠原蛋白含量，其肌肉的結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度和品質(zhì)也相對(duì)較好.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，COL1A1和COL1A2兩個(gè)基因在雜交F1肌肉上的表達(dá)量顯著高于在母本草魚肌肉上的表達(dá)量，肌肉硬度和彈性也顯著高于母本草魚.

4 結(jié)論

綜上所述，雜交F1肌肉彈性大、嫩度高，肉質(zhì)堅(jiān)韌，這給人們?cè)谶x擇水產(chǎn)品時(shí)提供了一種新的魚蛋白選擇，同時(shí)也豐富了魚類種質(zhì)資源.

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（編輯 WJ）