進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與卡培他濱耐藥及毒性反應(yīng)的關(guān)系

龐明輝，梁麗芹，侯能易，胡雪梅，丁 玥，王 康(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610072)

進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與卡培他濱耐藥及毒性反應(yīng)的關(guān)系

龐明輝，梁麗芹，侯能易，胡雪梅，丁 玥，王 康
(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610072)

目的 檢測進(jìn)展期結(jié)直腸癌組織中MTHFR基因的表達(dá)，分析其與卡培他濱耐藥及毒性反應(yīng)的關(guān)系。方法 56例進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者的病理組織，檢測MTHFRC677T位點(diǎn)的基因多態(tài)性，測試進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者原代腫瘤細(xì)胞對(duì)卡培他濱的響應(yīng)。結(jié)果 MTHFRC677T位點(diǎn)TT型對(duì)卡培他濱化療的敏感例數(shù)及化療毒性反應(yīng)例數(shù)均高于CC及CT型，且化療毒性反應(yīng)例數(shù)均高于CC基因型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。結(jié)論 進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療前應(yīng)檢測MTHFR基因多態(tài)性，MTHFRC677T基因TT型患者首選卡培他濱，化療期間注意毒性反應(yīng)的發(fā)生。

5-FU；卡培他濱；結(jié)直腸癌；體外藥效學(xué)；基因多態(tài)性

5-Fu是進(jìn)展期結(jié)直腸癌最常用的氟尿嘧啶類藥物，在此基礎(chǔ)上，還衍生出了其他氟尿嘧啶類藥物，如替加氟、替吉奧、卡培他濱等。5-Fu進(jìn)入體內(nèi)在亞甲基四氫葉酸的參與下與胸苷酸合成酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，干擾DNA的合成與修復(fù)。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是5-Fu體內(nèi)代謝過程中的關(guān)鍵酶之一[1]。卡培他濱是5-Fu的前藥，是進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療的氟尿嘧啶類基礎(chǔ)用藥。由于進(jìn)展期結(jié)直腸癌對(duì)卡培他濱的反應(yīng)差異，以及卡培他濱不可預(yù)期的毒副作用和耐藥，常常導(dǎo)致用藥劑量的降低和治療的中斷[2]，最終影響其化療效果。進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者卡培他濱耐藥及毒性反應(yīng)與MTHFR基因多態(tài)性的關(guān)系有待闡明，研究表明影響MTHFR活性的基因多態(tài)位點(diǎn)中，C677T是最常見的位點(diǎn)。本文通過原代腫瘤細(xì)胞的體外藥效學(xué)試驗(yàn)，從上述最常見位點(diǎn)入手，研究MTHFR基因多態(tài)性與卡培他濱毒副作用和耐藥性的關(guān)系，為指導(dǎo)臨床個(gè)體化化療用藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1～6月四川省人民醫(yī)院收治的56例進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者的病理組織，均經(jīng)病理確診。所有患者病歷資料完整，化療前后均有全面的體格檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查(包括肝功能、腎功能、心電圖等)。年齡(59.6±13.2)歲，其中男37例，女19例；高分化30 例，中低分化26 例；41例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。術(shù)后均采用以卡培他濱為主的化療方案。標(biāo)本采集程序符合四川省人民醫(yī)院人體樣本實(shí)驗(yàn)研究倫理規(guī)范。

1.2 方法

1.2.1 ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性試驗(yàn)(ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP- TCA) 卡培他濱以20×5-Fu(購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，貨號(hào):E0748)代替[3]。用DMSO溶解配置成濃度為0.5 mg/ml的儲(chǔ)存液，-20 ℃保存。ATP- TCA檢測試劑盒購自湖州海創(chuàng)生物科技有限公司，按照試劑盒說明操作進(jìn)行原代腫瘤細(xì)胞分離、細(xì)胞培養(yǎng)及ATP檢測?？拱┧幬锕ぷ饕核幬餄舛仍O(shè)定為6個(gè)梯度，即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的藥物測試濃度(test drug concentration，TDC)。分析軟件根據(jù)抗癌藥物各濃度抑制率計(jì)算得出藥物IC90及IC50(IC90:抑制 90%腫瘤細(xì)胞生長的 TDC；IC50:抑制 50%腫瘤細(xì)胞生長的 TDC。CSI =500-各TDC的抑制率之和。判定標(biāo)準(zhǔn):化療敏感性根據(jù)以下三種進(jìn)行分類::IC50≤25%TDC為敏感； IC90≤100% TDC 且 IC50 >25%，或CSI≤300為輕度敏感；IC90>100% TDC 且 IC50>25%且 CSI>300為耐藥[4]。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測 從石蠟包埋的腫瘤組織切片中提取DNA，操作過程參照試劑盒說明書(TAKARA，DEXPAT)。擴(kuò)增的上游引物[5]為:5'- CCTTGAACAGGTGGAGGCC-3'；下游引物為 5'- CAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT-3'，擴(kuò)增片段長 158 bp。PCR反應(yīng)體系總體積 25 μl，包括引物(10 mmol/L)各1.0 μl、4×dNTP(各2.5 mmol/L) 2.5 μl、Taq酶1U、基因組DNA溶液0.5 μl、10×Buffer(含MgCl2)2.5 μl。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性5 min；變性 95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入HinfI 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)后于3%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3 近期毒性反應(yīng)評(píng)價(jià) 觀察化療2周期內(nèi)不良反應(yīng)發(fā)生情況。是否出現(xiàn)腹瀉、惡心、白細(xì)胞減少、血小板減少、手足綜合癥、肝腎功受損、骨髓抑制、脫發(fā)等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 10.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFRC677T基因型頻率 檢出TT純合型 6例(10.7%)，CT雜合型16 例(28.6%)，CC野生型34例(60.7%)。通過哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在直腸癌患者中MTHFR677基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均符合Hardy- Weinberg 遺傳平衡規(guī)律，表明本研究入組病例具有群體代表性。

2.2 MTHFR基因多態(tài)性與ATP體外藥敏結(jié)果的關(guān)系 MTHFR667 TT純合型敏感例數(shù)高于CC及CT基因型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.519，χ2=4.200；P< 0.05)。

表1 MTHFR677基因多態(tài)性與體外藥敏結(jié)果的關(guān)系

2.3 MTHFRC677T基因多態(tài)性與臨床相關(guān)的早期毒性的關(guān)系 56例患者化療毒副反應(yīng)主要表現(xiàn)為出現(xiàn)Ⅱ度以上肝損傷3例，骨髓抑制2例，手足綜合癥4例，口腔炎2例，腹瀉1例。TT基因型患者的毒性反應(yīng)發(fā)生例數(shù)顯著高于CC型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.971，P< 0.05)，但與CT型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

表2 MTHFR 677基因型與毒性反應(yīng)的關(guān)系 [n(%)]

3 討論

卡培他濱是5-Fu的前藥，可以明顯改善無疾病生存期，是進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療的常用藥物。Schuller等報(bào)道[6]，每天兩次口服1255 mg/m2卡培他濱，在原發(fā)結(jié)直腸癌組織中5-Fu的濃度平均是正常組織的3.2倍，腫瘤組織/血漿的5-Fu濃度比值超過20，而其他組織的比值為8～10。在體外藥敏試驗(yàn)中，一般設(shè)定的TDC參照血漿峰值濃度設(shè)定，因此本研究以20倍的5-Fu血藥濃度來模擬卡培他濱的體外藥效學(xué)試驗(yàn)。當(dāng)臨床上有多個(gè)可以接受的等效化療方案時(shí)，體外藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)有效的優(yōu)化治療方案的選擇[7]。本研究采用的ATP-TCA是一種敏感和穩(wěn)定的體外藥效學(xué)方法，它與臨床療效相關(guān)性高[8]。

MTHFR是葉酸代謝通路上的關(guān)鍵代謝酶，會(huì)影響5-Fu的毒性與臨床應(yīng)答[9]。研究顯示，以卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案能夠提高晚期胃腸道腫瘤患者血清中 MTHFR濃度，抗腫瘤療效確切[10]。在不同人種和地區(qū)中，該酶的基因多態(tài)性分布存在差異。本研究人群中，MTHFRC677T位點(diǎn)TT型對(duì)卡培他濱化療的敏感性高于CC及CT型，原因有以下兩個(gè)方面:①C677T位點(diǎn)CT的突變可導(dǎo)致該蛋白222位氨基酸由丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，而此處氨基酸的轉(zhuǎn)變將使MTHFR酶的穩(wěn)定性和活性降低[11]；②突變會(huì)增加細(xì)胞內(nèi) 5，10亞甲基四氫葉酸的含量，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)胸苷酸合成酶的抑制作用，使癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性增高，進(jìn)而增強(qiáng)氟尿嘧啶類藥物的抗腫瘤活性[12]。Cohen 等[13]報(bào)道43例接受以 5-FU 為主的一線治療的晚期結(jié)腸癌患中，C667T的基因多態(tài)性與腫瘤反應(yīng)率密切相關(guān)，TT基因型患者的有效率達(dá)100%，而CC與CT基因型患者的有效率分別為47%和67%。

進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者對(duì)化療藥物的敏感性方面存在個(gè)體差異，腫瘤的耐藥性是化療失敗的主要原因，而大約50%的耐藥性是用藥前就已經(jīng)存在?？梢愿煽康卦u(píng)估化療的毒副作用和耐藥的風(fēng)險(xiǎn)，建立更個(gè)性化的治療方案，避免無效治療，提高腫瘤治療效果。本研究提示進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療前可以常規(guī)檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性，重點(diǎn)關(guān)注C677T，其中TT型患者首選卡培他濱作為化療藥物。

本研究結(jié)果顯示，攜帶 MTHFRC677T位點(diǎn)TT基因型患者的化療毒性反應(yīng)尤其是手足綜合征和骨髓抑制，顯著高于CC型患者[14]。提示進(jìn)展期結(jié)直腸癌卡培他濱化療期間注意毒性反應(yīng)，加強(qiáng)對(duì)TT基因型患者手足綜合征和骨髓抑制的預(yù)防和處理。

目前研究表明，檢測惡性腫瘤患者外周血白細(xì)胞DNA中相關(guān)基因多態(tài)性可能對(duì)于指導(dǎo)晚期消化道癌的化療、預(yù)測以5-FU為基礎(chǔ)的化療方案的療效具有較高的臨床價(jià)值[15]，本研究提取腫瘤細(xì)胞中DNA檢測相關(guān)基因多態(tài)性亦顯示相同效果。我們研究提示MTHFR基因有可能作為進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療耐藥性的預(yù)測指標(biāo)，建議進(jìn)展期結(jié)直腸癌化療前檢測MTHFR基因多態(tài)性，對(duì)于MTHFRC677T位點(diǎn)TT型患者，化療藥物首選卡培他濱，藥物治療期間需注意手足綜合征和骨髓抑制的毒性反應(yīng)。

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The relationship between MTHFR polymorphism and capecitabine resistance and toxicity reaction in advanced colorectal cancer

PANGMing-hui,LIANGLi-qin,HOUNeng-yi，HUXue-mei,DINGYue，WANGKang
(DepartmentofGastrointestinalSurgery,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,China)

WANGKang

Objective To detect methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene expression in advanced colorectal cancer tissue, and analyze its association with capecitabine resistance and toxicity reaction. Methods We collected 56 cancer tissue samples from patients with advanced colorectal cancer. We detected the polymorphism at MTHFRC677T loci and measured the response of colorectal primary tumor cells to capecitabine. Results The incidence of sensitivity to and chemotherapy toxicity reaction to capecitabin in TT genotype was higher than those in CC genotype and CT genotype at MTHFRC677T loci (P< 0.05). Conclusion MTHFR gene polymorphism has to be detected before chemotherapy for patients with advanced colorectal cancer. The capecitabine is the preferred drug for patients with TT genotype of MTHFR gene. The toxic reaction should be paid attention during period of chemotherapy.

5-Fu； Capecitabine； Colorectal cancer； In vitro pharmacodynamics； Gene polymorphism

王 康

R735.3

A

1672-6170(2016)05-0156-03

2016-04-16；

2016-07-22)