MicroRNA-196b基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王 薇，于寶丹，李玉蓮，曹冉華，閆海成(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.腫瘤內(nèi)科，b.病理科，c.神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 10010；.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤血液科，廣東 廣州 510000)

MicroRNA-196b基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義

王 薇1a，于寶丹2，李玉蓮1b，曹冉華1a，閆海成1c
(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 a.腫瘤內(nèi)科，b.病理科，c.神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 100102；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤血液科，廣東 廣州 510000)

目的 探討非小細(xì)胞肺癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)及其臨床意義。方法 收集2013年5月至2015年5月在我院接受治療的65例非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)組織樣本中MicroRNA-196b的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，分析其與患者臨床病理因素的關(guān)系；評(píng)價(jià)MicroRNA-196b在非小細(xì)胞肺癌診斷中的效能。結(jié)果 非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分型密切相關(guān)(P< 0.05)，而與患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小以及分化程度無關(guān)聯(lián)性(P> 0.05)。癌組織中MicroRNA-196b最佳檢測臨界值為0.879，檢測靈敏度和特異度分別為78.5%、90.8%。結(jié)論 MicroRNA-196b在非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分型有關(guān)；癌組織MicroRNA-196b可作為臨床非小細(xì)胞肺癌診斷的輔助檢測指標(biāo)。

MicroRNA-196b；非小細(xì)胞肺癌；PCR

肺癌是目前發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cance，NSCLC)作為肺癌中最常見的病理類型，占肺癌總發(fā)生率的80%～85%，其五年生存率低于15%[1～3]。NSCLC的早期癥狀缺乏典型特征，導(dǎo)致70%～80%患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。因此，尋找一種能夠有效診斷NSCLC的分子標(biāo)志物是目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題[4]。微小RNA(microRNA)的出現(xiàn)為癌癥的診斷和治療提供了新思路，microRNA是一種小分子單鏈RNA，長度為19～30個(gè)核苷酸，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-196b在乳腺癌、口腔癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤、白血病以及肝癌等腫瘤組織中過表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤的分期和患者的預(yù)后密切相關(guān)[6，7]，但對(duì)于非小細(xì)胞肺癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)水平的研究甚少。本研究探討MicroRNA-196b在NSCLC患者癌及癌旁正常組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，并探討MicroRNA-196b在NSCLC早期診斷中的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2015年5月在本院收治的65例病理學(xué)確診的非小細(xì)胞肺癌患者，所有患者均未采取任何放化療以及生物治療等抗癌治療。其中男41例，女24例，年齡34～81歲[(62.75±8.96)歲]；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例；鱗癌23例，腺癌42例；低分化11例，中分化45例，高分化9例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期14例。手術(shù)獲取腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)生理鹽水清洗后液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 RNA提取試劑盒：miRNeasy Mini Kit (Qiagen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen公司)；熒光定量PCT試劑盒：miScript SYBR Green PCR Kit (Takara公司)；微量移液器(Eppendorf公司)，DU-600型紫外分光光度計(jì)(Beckman公司)，ABI-7500 fast RT-PCR儀(美國Ambion 公司)，高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司)。

1.2.2 引物與內(nèi)參 根據(jù)GenBank中已知的人類MicroRNA-196b基因的cDNA序列，利用Primer premier 6.0 進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成，miR-196b上游引物采用PCR試劑盒中的 miScript Universal Primer，下游引物序列為：5′-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-3′。內(nèi)參U6引物序列如下：F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 標(biāo)本總RNA提取 根據(jù)miRNeasy Mini Kit的操作說明書進(jìn)行總RNA提取，分別在260和280 nm測定RNA溶液吸光值(A)，計(jì)算RNA純度和濃度，選擇A260/A280在1.8～2.1者進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 MicroRNA-196b逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為5×miRNA反應(yīng)緩沖液4 μl，miRNA Prime Script 逆轉(zhuǎn)錄酶混合液 1.0 μl，RNA模板(600 ng)1 μl，RNase-free 水補(bǔ)至20 μl。反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；合成后的cDNA置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 q-PCR反應(yīng) 采用miScript SYBR Green PCR Kit三步法對(duì)miR-196b進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參照，做3個(gè)復(fù)孔重復(fù)；反應(yīng)體系為：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 2 μl，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 2 μl，cDNA模板1 μl，加水補(bǔ)至20.0 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性97 ℃ 10 min，95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，70 ℃延伸34 s，做40個(gè)循環(huán)，計(jì)算Ct平均值。采用2-△△Ct法計(jì)算MicroRNA-196b基因在癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；采用Spearman檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)價(jià)MicroRNA-196b在肺癌早期診斷中的價(jià)值。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MicroRNA-196b在癌及癌旁組織中的表達(dá) 肺癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)量為(1.751±1.29)，而癌旁組織中MicroRNA-196b的表達(dá)量為(0.484±0.372)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.953，P= 0.000)。

2.2 MicroRNA-196b基因與臨床病理因素的關(guān)系

肺癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)水平與性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小以及分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；而MicroRNA-196b的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見表1。

表1 MicroRNA-196b基因與臨床病理因素的關(guān)系

2.3 MicroRNA-196b基因?qū)SCLC的診斷價(jià)值

組織MicroRNA-196b對(duì)NSCLC診斷的ROC曲線下面積為0.908(95%CI：0.859～0.958)，最佳檢測臨界值為表達(dá)水平>0.879，檢測靈敏度為78.5%，特異度為90.8%，見圖1。

圖1 MicroRNA-196b表達(dá)診斷NSCLC的ROC曲線

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤之一，隨著各種腫瘤標(biāo)志物的深入研究，MicroRNA也得到了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[8]。MicroRNA是廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子RNA，由于其不編碼蛋白質(zhì)，曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄本的“噪音”。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA能夠抑制靶mRNAs的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及促進(jìn)mRNAs降解，參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、代謝和凋亡等生理調(diào)控過程，尤其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用[9，10]。

目前報(bào)道的肺癌相關(guān)MicroRNA約有40余種，包括miRNA-21、miRNA-141、miRNA-210等[11]。MicroRNA-196b是位于人類7號(hào)染色體(7p15.2)的高度保守區(qū)域，能夠結(jié)合不同靶基因，從而發(fā)揮抑癌或者致癌作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)[12，13]，MicroRNA-196b在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)，其表達(dá)量與癌癥的進(jìn)展以及患者預(yù)后和生存期顯著相關(guān)。Liao等[14]對(duì)63例胃癌組織及正常組織檢測發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-196b在胃癌組織中高表達(dá)，當(dāng)敲除MicroRNA-196b基因后，轉(zhuǎn)移性胃癌HR細(xì)胞的遷移和侵襲得到抑制；進(jìn)一步研究其作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-196b是通過與具有抑制腫瘤作用的轉(zhuǎn)錄因子ETS2相結(jié)合，而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。田慶剛等[15]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)47例結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-196b進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-196b在直腸癌組織中表達(dá)顯著增高，其水平與結(jié)腸癌的惡化程度密切相關(guān)，且miR-196b對(duì)機(jī)體序列特異性轉(zhuǎn)錄因子HoxB8具有抑制作用。徐麗華等[16]研究了miR-196b在急性髓細(xì)胞白血病(AML)兒童骨髓中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，骨髓miR-196b水平與兒童AML的發(fā)生相關(guān)，經(jīng)過治療預(yù)后良好患兒miR-196b水平明顯降低。MicroRNA-196b在NSCLC中的研究相對(duì)較少，Saito等[17]應(yīng)用ROC曲線研究了miR135、miR196b、miR31等12種miRNA對(duì)肺腺癌的診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括miR196b在內(nèi)的三種miRNA對(duì)肺腺癌的診斷效能較高，三種miRNA聯(lián)合檢測可大大提高肺腺癌的診斷準(zhǔn)確度。然而miRNA對(duì)NSCLC診斷效能的研究尚不多見。

本研究對(duì)NSCLC患者癌組織及正常組織中MicroRNA-196b表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示MicroRNA -196b在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示MicroRNA-196b的高表達(dá)與NSCLC的發(fā)生相關(guān)；進(jìn)一步采用ROC曲線分析MicroRNA-196b對(duì)NSCLC的診斷效能，結(jié)果顯示MicroRNA-196b對(duì)于NSCLC診斷的最佳檢測臨界值為>0.879，診斷靈敏度和特異度分別為78.5%，90.8%；提示MicroRNA-196b對(duì)NSCLC診斷的效能較高，有助于臨床上NSCLC的快速診斷，減少誤診。另外，本研究還分析了各病理因素患者癌組織中MicroRNA-196b的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期以及腺癌患者的癌組織中的表達(dá)均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期以及鱗癌患者，說明MicroRNA-196b的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分期以及病理分型均密切相關(guān)；分析MicroRNA-196b參與NSCLC的發(fā)展，且對(duì)肺腺癌的發(fā)生可能具有一定的特異性；因此，對(duì)癌組織MicroRNA-196b進(jìn)行檢測，有助于判斷NSCLC的進(jìn)展和組織學(xué)分型，對(duì)NSCLC治療過程采取最佳治療方案提供依據(jù)。

綜上所述，MicroRNA-196b在NSCLC組織中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與NSCLC的病理類型以及惡化程度等相關(guān)，MicroRNA-196b可作為臨床NSCLC診斷的輔助檢測指標(biāo)。

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Expression and clinical significance of MicroRNA-196b in non-small cell lung cancer

WANGWei1a，YUBao-dan2，LIYu-lian1b，CAORan-hua1a，YANHai-cheng1c
(1.AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity，a.DepartmentofInternalMedicine-Oncology，b.DepartmentofPathology，c.DepartmentofNeurosurgery，Hohhot010050，China； 2.DepartmentofHematology&Oncology，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510000，China)

YANHai-cheng

Objective To explore the expression and clinical significance of MicroRNA-196b in non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Samples of cancer tissues and corresponding para-carcinoma tissues were collected from 65 patients with NSCLC from May 2013 to May 2015 in our hospital.Real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the level of MicroRNA-196b in these tissue samples.The correlation between the expression of MicroRNA-196b and clinicopathologic characteristics was analyzed and the diagnostic efficiency of MicroRNA-196b in NSCLC was evaluated.Results The expression of MicroRNA-196b in cancer tissues was significantly higher than that in corresponding para-carcinoma tissues (P< 0.05).The expression of MicroRNA-196b in cancer tissues was closely correlated with lymph node metastasis，TNM stage and pathological type (P< 0.05) but not correlated with gender，age，smoking history，tumor size and differentiation (P> 0.05).The best detection threshold of MicroRNA-196b for early diagnosis of NSCLC was 0.879 with 78.5% sensitivity and 90.8% specificity，respectively.Conclusion The expression level of MicroRNA-196b is significantly increased in cancer tissues of NSCLC.The MicroRNA-196b level is related to lymph node metastasis，TNM stage and pathological type.It has a good clinical value for early diagnosis of NSCLC.

MicroRNA-196b； Non-small cell lung cancer； PCR

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2015MS0831)；內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：YKD2014QN CX009)

閆海成

R734.2

A

1672-6170(2016)05-0061-04

2016-03-16；

2016-06-01)