不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環(huán)功能變化的實驗研究

阿麗米娜·阿文，關(guān)麗娜，虎曉梅，穆玉明(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環(huán)功能變化的實驗研究

阿麗米娜·阿文，關(guān)麗娜，虎曉梅，穆玉明
(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 觀察不同頻率超聲聯(lián)合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環(huán)功能的影響。方法 18只新西蘭大白兔單側(cè)股動脈制成富含血小板的混合性血栓模型，分為A、B、C3組各6只。均通過靶向微泡攜帶尿激酶在超聲照射30 min下輔助溶栓，其中A組超聲頻率1.6 kHz，B組2.2 kHz，C組2.8 kHz。應(yīng)用脈沖多普勒血流儀持續(xù)監(jiān)測血流流速，對血流量變化特點進行分析，并對各組脛前肌行HE染色，比較不同頻率超聲的溶栓作用及對微循環(huán)功能變化的影響。結(jié)果 溶栓后120 min時，三組血流量變化比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實現(xiàn)了完全再通。A、C組均有未溶通或者微栓塞情況發(fā)生。經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn)C組微循環(huán)末端有微小栓子，成分為由嗜酸性同質(zhì)性纖維素構(gòu)成，鏡下呈粉紅色。結(jié)論 超聲頻率2.2 MHz的條件下溶栓可以實現(xiàn)血栓的完全溶解，遠(yuǎn)端未見微栓子形成，栓子處于完全溶解狀態(tài)。

超聲；靶向微泡；溶栓；微循環(huán)；微栓塞

血栓形成和血栓栓塞后斑塊的破裂產(chǎn)生的碎片及微循環(huán)栓塞是任何一個血管手術(shù)術(shù)后有可能發(fā)生的一種并發(fā)癥，靜脈使用溶栓藥物的副作用主要是引起出血，其操作復(fù)雜、有創(chuàng)、易引發(fā)血管壁損傷或發(fā)生遠(yuǎn)端小血管栓塞的缺點，而體表超聲助溶不但能有效溶解血栓并且能夠使溶栓更加徹底，減少微循環(huán)栓塞的發(fā)生[1]。有研究報道，在目前先進的支架及手術(shù)技術(shù)基礎(chǔ)上，栓塞率有所下降，微循環(huán)栓塞這種并發(fā)癥的死亡率由過去的4%～17%下降到了0.9%，因此如何減少微循環(huán)再栓塞無疑對治療血管性疾病起到重要作用[2]。既往研究結(jié)果顯示，應(yīng)用診斷超聲聯(lián)合靶向微泡攜帶尿激酶可以完全溶解股動脈內(nèi)血栓[3]，但同時發(fā)現(xiàn)，在實現(xiàn)了靶向血管內(nèi)血栓的有效溶解后，其末端的分支小血管出現(xiàn)了不同程度的再閉塞。因此，為進一步研究其可能的原因，本研究通過選取不同超聲頻率聯(lián)合靶向微泡、尿激酶對兔股動脈血栓進行溶栓，探討不同頻率超聲溶栓后對微循環(huán)功能及微血栓形成的影響因素與意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型制備 18只新西蘭大白兔，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，體質(zhì)量1.8～2.8 kg，戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉，建立靜脈通道，仰臥位固定，腹股溝區(qū)脫毛，備皮，鈍性分離組織，分離股動脈，結(jié)扎其相應(yīng)的深支和淺支。在該段股動脈后壁放置大小為2.5 cm×2.5 cm 的橡膠薄膜，以保護動脈周圍組織。在橡膠薄膜與股動脈后壁放置一大小約0.5 cm×0.5 cm的浸有15%三氯化鐵溶液濾紙片將股動脈環(huán)繞包裹，接觸面約為股動脈周徑的3/4，待血流穩(wěn)定后，將股動脈的遠(yuǎn)端用動脈夾夾閉，7～8 min后取出動脈夾，約20 min后取出濾紙片，用生理鹽水沖洗局部組織。所有動物的處置均經(jīng)過新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意(批件號:20140403003)并按照相關(guān)規(guī)定處理。血栓模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn):①在30 min內(nèi)形成完全閉塞性血栓；②脈沖多普勒流儀血流量<0.05 ml/min；③二維和彩色多普勒超聲顯示閉塞性血栓；④經(jīng)HE染色證實為以血小板為主的混合件混合性血栓。以上標(biāo)準(zhǔn)如有1項不符合即為陰性結(jié)果。終止實驗標(biāo)準(zhǔn):自制作模型開始觀察，總觀察時間120 min后終止實驗[4]。

1.2 方法 將0.3 ml的TagestarSA超聲微泡與生物素化尿激酶(3 ml)及生物素化RGDS(3 ml)三者混勻，于室溫條件下孵育20分鐘，期間不斷輕微震蕩。待血栓形成后，經(jīng)耳緣靜脈通道緩慢注射。將LA523探頭置于血栓處，選擇爆破條件，待微泡到達血栓處，曝破約10 min，待股動脈內(nèi)完全看不到造影劑即可停止爆破。使用LA240探頭，頻率1～4 MHz，照射血栓處30 min，觀察兩小時。將脈沖多普勒血流計的血流量恢復(fù)正?；A(chǔ)血流四分之三以上定義為完全溶通，進一步用二維和彩色多普勒超聲加以確定。實驗結(jié)束后即刻結(jié)扎遠(yuǎn)、近端血管，取出血管后，予過量麻醉藥處死動物，切開兔前肢小腿前側(cè)皮膚，鈍性分離筋膜組織，取脛前肌組織2 cm×1.5 cm，厚度為0.2 cm，標(biāo)本用4%福爾馬林溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，HE染色，觀察組織末端血管內(nèi)有無微血栓存在。

1.3 溶栓療效評價指標(biāo) 血管再通率: CDFI或血管造影進行評價，以血管再通(達I級:僅見細(xì)窄血流通過)為標(biāo)準(zhǔn)[5]，判斷各組溶栓治療后血管的再通率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不服從正態(tài)分布，采用秩和檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血流量的比較 不同時間段比較三組血流量變化情況，溶栓后120 min時，三組血流量變化比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實現(xiàn)了完全再通。見表1。

表1 不同超聲頻率下溶栓后120 min內(nèi)股動脈血流量情況 (ml/min)

2.2 三組溶栓后血管的溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況 根據(jù)CDFI血流頻譜觀察實驗結(jié)果:三組溶栓后血管的溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況:A組溶栓后血管部分未溶通，但未發(fā)生微栓塞；B組溶栓后血管均完全被溶通，沒有發(fā)生微栓塞；C組溶栓后有部分血管未溶通，發(fā)生了微栓塞。見表2。

2.3 各組超聲檢查結(jié)果 觀察不同條件下溶栓后血管溶通的情況溶通組:CDFI可見血流通過，未通組:CDFI未見血流通過。見圖1。

表2 不同超聲頻率下溶栓后血管溶通情況及發(fā)生微栓塞的情況

2.4 溶栓后兔脛前肌鏡下表現(xiàn) 18只動物中14只血管內(nèi)血栓均完全溶解，4只未溶通。其中的1只出現(xiàn)了微循環(huán)再栓塞，光鏡下可見組織存在較明顯的瘀血和出血，白細(xì)胞聚集，組織呈蠟樣變性，提示骨骼肌壞死，微血管中由血小板纖維素和/或紅細(xì)胞組成，HE 染色呈粉紅色，證明微血栓形成。見圖2。

圖1 靶向微泡、尿激酶溶栓后血管再通的超聲及造影圖像 a:溶通組超聲下CDFI血流通過； b:未通組超聲下CDFI未見血流通過；c:溶通組造影可見造影劑顯影；d:未通組造影下造影劑未顯影

圖2 溶栓后脛前肌組織血管鏡下表現(xiàn) a:溶通組未發(fā)生微栓塞；b:纖維素及血小板組成的粉紅色血栓，略透明，箭頭所指為微血栓形成 (HE染色，×400)

3 討論

溶栓后微循環(huán)產(chǎn)生的碎片導(dǎo)致微循環(huán)栓塞，是溶栓治療最主要最嚴(yán)重的并發(fā)癥。本研究也證實，應(yīng)用不同超聲頻率聯(lián)合靶向微泡、尿激酶溶栓，雖然可以溶解血栓，但在末端分支小血管內(nèi)也可能出現(xiàn)小的碎片。因此，及時發(fā)現(xiàn)微小栓子對減少微循環(huán)栓塞有重要意義。

通過超聲聯(lián)合微泡溶栓可能會使血栓破碎成小塊，但如果碎片大于下游毛細(xì)血管的直徑，這就會增加二次栓塞的風(fēng)險[6，7]，研究發(fā)現(xiàn)溶栓后可能存在有大小約30～150 μm的游離血栓隨著大栓子脫落至管壁，繼而隨血液循環(huán)流動至血管的細(xì)小分支導(dǎo)致微循環(huán)末端的再次栓塞[8，9]。這種小的栓塞結(jié)構(gòu)經(jīng)病理HE染色鏡下可見其內(nèi)部為團塊狀的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，觀察其周圍發(fā)現(xiàn)一些散在的紅色顆粒，考慮可能為沉淀的紅細(xì)胞，相比這種較小的栓子，當(dāng)血栓直徑小于150 μm時，血管內(nèi)可見有纖維素和紅細(xì)胞組成的粉紅色物質(zhì)，于之前看到的單純的紅細(xì)胞聚集形成的血栓不同，在病理HE染色時發(fā)現(xiàn)此時鏡下的細(xì)胞呈粉紅色，這種粉紅色的物質(zhì)為微血栓。

血凝塊碎片的大小在很大程度上取決于超聲照射強度[10，11]。研究表明超聲可有效促進血栓溶解，當(dāng)超聲與溶栓藥物聯(lián)合溶栓時，可增加溶栓藥物的療效，使溶栓時間由3 h縮短至30 min[12]。另外，體外溶栓實驗結(jié)果顯示，高強度超聲在脈沖模式下會誘發(fā)血凝塊溶解，這種技術(shù)取決于空化效應(yīng)和組織使用聚焦超聲波的頻率，由于脈沖時間短(<50個周期)、壓力高(>6 MPa)，相對于非線性脈沖空化作用低(0.1%～5%)，可在較短的時間內(nèi)分離出組織碎片。在血管溶栓治療的應(yīng)用中，多普勒超聲可有效反饋溶栓情況，5 MHz超聲診斷儀被用于監(jiān)測與治療血栓疾病，若在超聲溶栓的過程中，不斷增加頻率的范圍，首先出現(xiàn)的不良反應(yīng)為對機體有傷害作用，而且溶栓效果也并沒有較低頻率溶栓的結(jié)果理想，使用頻率較低的超聲具有通過體積較大的聲波作用來改進穿透力與定位的優(yōu)點[13]。

研究表明[14]，超聲頻率2.2 kHz，超聲照射時間30 min，尿激酶劑量為3 mg時，將溶栓時間控制在10～60 min，隨超聲照射時間的延長，超聲溶栓效果越明顯。因此本實驗依據(jù)要求將超聲照射血栓處的時間控制在30 min，我們既往的研究中[15]，由于使尿激酶有了靶向性，成功地降低了尿激酶的劑量(3 mg)，雖然實現(xiàn)了靶向血栓的有效溶解，但可能也存在一部分的尿激酶在血液中被中和后失活，進而導(dǎo)致血液中尿激酶濃度減低，血栓的溶解片段過大，致微循環(huán)的再栓塞，因此藥物尿激酶的適量濃度也將影響血栓片段大小。不但實現(xiàn)了血管的溶通，并且沒有發(fā)生碎片，病理證實無微栓塞發(fā)生。而其他兩組，均有血管未通或(和)微栓塞發(fā)生，考慮其可能的原因是由于超聲在助溶的同時，可能會對遠(yuǎn)端小血管產(chǎn)生一定影響，造成血栓溶解片段過大，隨微循環(huán)在末端分支小血管產(chǎn)生微小的碎片，因此選取適當(dāng)?shù)某曨l率對減少微循環(huán)的栓塞有一定的作用。

[1] Weem SMOP，Haelst STWV，Ruijter HMD，et al.Lack of Evidence for Dual Antiplatelet Therapy after Endovascular Arterial Procedures: A Meta-analysis[J].European Journal of Vascular & Endovascular Surgery，2016,52(2):253-262.

[2] Lu Y，Wang J，Huang R，et al.Microbubble-Mediated Sonothrombolysis Improves Outcome After Thrombotic Microembolism-Induced Acute Ischemic Stroke[J].Stroke，2016,47(5):1344-1353.

[3] 關(guān)麗娜，穆玉明，王春梅，等.尿激酶RGDS微泡在體溶栓的血流頻譜特點與可能機制的實驗研究[J].中華超聲影像學(xué)雜志，2010，19(11):997-1000.

[4] 關(guān)麗娜，穆玉明，王春梅，等.影響動脈血栓形成因素的超聲研究[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(10):873-877.

[5] Mu Y，Li L，Ayoufu G.Experimental study of the preparation of targeted microbubble contrast agents carrying urokinase and RGDS[J].Ultrasonics，2009，49(8):676-681.

[6] .Pacella J，Chen X，Brands J，et al.Abstract 15990: Microbubble-Mediated Sonothrombolysis With Long Tone Burst Ultrasound for the Treatment of Microvascular Microembolization: An in vivo Study[J].Circulation，2013，128(22):A15990.

[7] Maxwell AD，Cain CA，Duryea AP，et al.Noninvasive Thrombolysis Using Pulsed Ultrasound Cavitation Therapy- Histotripsy[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2009，35(12):1982-1994.

[8] Cameron W，Kullervo H，David G.In vitro and in vivo high-intensity focused ultrasound thrombolysis.[J].Investigative Radiology，2012，47(4):217-225.

[9] Zhang X，Owens GE，Gurm HS，et al.Noninvasive thrombolysis using histotripsy beyond the intrinsic threshold (microtripsy)[J].IEEE Transactions on Ultrasonics Ferroelectrics & Frequency Control，2015，62(7):1342-1355.

[10]Pacella JJ，Brands J，Schnatz FG，et al.Treatment of Microvascular Micro-embolization Using Microbubbles and Long-Tone-Burst Ultrasound: An inVivo，Study[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2015，41(2):456-464.

[11]Porter TR，Radio S，Lof J，et al.Diagnostic Ultrasound High Mechanical Index Impulses Restore Microvascular Flow in Peripheral Arterial Thromboembolism[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2016，42(7):1531-1540.

[12]Merouani S，Hamdaoui O，Rezgui Y，et al.Sensitivity of free radicals production in acoustically driven bubble to the ultrasonic frequency and nature of dissolved gases[J].Ultrasonics Sonochemistry，2015，22:41-50.

[13]Tomkins AJ，Schleicher N，Murtha L，et al.Platelet rich clots are resistant to lysis by thrombolytic therapy in a rat model of embolic stroke[J].Experimental & Translational Stroke Medicine，2015，7(1):1-9.

[14]Jian Z，Zhaoyun C，Xiaoqiang Q，et al.Investigation of the long-term patency of a transmural heparinized polycaprolactone and poly(D，L-lactic/glycolic acid) scaffold.[J].Journal of Surgical Research，2014，187(2):394-402.

[15]關(guān)麗娜，王春梅，穆玉明，等.超聲介導(dǎo)下攜尿激酶靶向微泡在兔動脈內(nèi)溶栓后的電鏡觀察[J].中華超聲影像學(xué)雜志，2011，20(9):799-802.

The changes of microcirculation function after in vivo thrombolysis by using targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency

ALIMINAA-Wen，GUANLi-na,HUXiao-mei,MUYu-ming
(DepartmentofEchocardiography，TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

MUYu-ming

Objective Objective To observes the effect of targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency on the microcirculation function after in vivo thrombolysis. Methods Eighteen New Zealand white rabbits were divided into A, B and C groups, 6 in each group after establishing a mixed thrombus model richer with platelets in unilateral femoral artery. Auxiliary thrombolysis was performed by using the target microbubbles with urokinase under ultrasound for 30 min, in which the group A

ultrasonic frequency was 1.6 MHz, the group B 2.2 MHz and the group C 2.8 MHz. Blood flow velocity was monitored by using a pulse Doppler blood flow meter and blood flow changes were analyzed. Meanwhile, samples of tibialis anterior muscles were stained by HE and the effects of thrombolysis under different ultrasonic frequency on microcirculation function were compared. Results After 120 min of thrombolysis, blood flow changes were significantly different among the three groups (P< 0.05), in which the group B achieved complete recanalization. There was incomplete recanalization or microemboli in another two groups. The HE staining showed that there was a small dose of microembolism composed of eosinophilic homogeneity of cellulose with pink color under microscopy. Conclusion The ultrasonic frequency 2.2 MHz, irradiation time 30 min, and urokinase of 3 mg thrombolysis can completely dissolve thrombus and can effectively prevent the microembolus formation.

Ultrasound； Targeted microbubble； Thrombolysis； Microcirculation； Micro embolism

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:81301230)

穆玉明，男，博士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。中華醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會常委，中華醫(yī)學(xué)會分會第七屆委員會淺表組織和血管超聲學(xué)組副組長，中華醫(yī)學(xué)會超聲醫(yī)學(xué)分會第八屆超聲心動圖學(xué)組副組長，中國醫(yī)師協(xié)會超聲醫(yī)師分會常務(wù)委員，中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會常務(wù)理事，中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會超聲心動圖專業(yè)委員會副主任委員，中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)研究會超聲分會常務(wù)委員，新疆超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會會長，新疆醫(yī)學(xué)會超聲專業(yè)委員會主任委員。研究方向:心血管超聲。

540.4+5

A

1672-6170(2016)05-0015-04

2016-07-20)